Tiểu luận Phương pháp Northern blot, Southern blot, Western blot

Bài tiểu luận: Phương pháp Northern blot, Southern blot, Western blot Những người thực hiên: Nguyễn Xuân Trung Lê Đức Thuận Lê Hoàng Lâm Nguyễn Hữu Phúc Đàng Nguyên Lưu Vy Vi A.Lai trên pha rắn 1. Nguyên tắc Lai trên pha rắn có cùng nguyên tắc với lai trên pha lỏng. Điểm khác biệt ở đây là một trong hai trình tự bổ sung (thường là trình tự đích , tức trình tự cần tìm) được cố định trên một giá thể rắn. Thuận lợi của việc sử dụng giá thể rắn là tạo dễ dàng trong thao tác và trong việc tách các trình tự không lai ra các phân tử lai, mặt khác còn ngăn sự tái bắt cặp giữa hai mạch của cùng một phân tử. Bù lại, việc phân tích định lượng các phân tử lai sau đó kém chính xác và hiệu quả thấp. Thật vậy, vận tốc lai trên pha rắn thấp hơn 10 lần so với vận tốc lai trên pha lỏng do một phần các nucleic acid được cố định trên giá thể bị che khuất, không tiếp xúc được với các trình tự bổ sung. 2. Các yếu tố kĩ thuật quan trọng trong các phương pháp lai trên pha rắn Giá thể rắn dùng cố định nucleic acid là các màng lai. Có hai loại màng lai : màng lai bằng nitrocellulose – là loại giá thể được sử dụng đầu tiên – hiện nay không còn thông dụng do hai nhược điểm : độ bền cơ học kém nên khó thao tác, không thể tách rời các phân tử lai trên màng để lai trở lại với một mẫu dò khác; màng lai bằng nylon, có độ bền cơ học cao và cho phép lai nhiều lần với nhiều mẫu dò khác nhau (cần loại bỏ mẫu dò cũ trước khi lai với mẫu dò mới). Các bước lai trên pha rắn 3. Ứng dụng của các phương pháp lai trên pha rắn Trong rất nhiều ứng dụng của các phương pháp lai trên pha rắn , nổi bật lên ba phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất :phương pháp Southern blot, Northern blot và Western blot . 3.1. Southern blot Phương pháp này được sử dụng để định vị những trình tự đặc biệt trên DNA bộ gen ,hay những DNA kích thước nhỏ như DNA plasmid, phage … Sơ đồ phương pháp lai Southern blot Cơ sở của phương pháp là kĩ thuật chuyển (tranfer) DNA từ gel lên màng lai do Southern mô tả năm 1975. Phương pháp Southern blot gồm các bước sau: - DNA bộ gen được cắt thành những đoạn kích thước khác nhau bởi 1 hay nhiều enzyme giới hạn (RE) ; các đoạn này được phân tách dựa vào kích thước qua điện di trên gel agarose . - DNA được làm biến tính (biến thành 2 mạch đơn ) ngay trên gel rồi được chuyển lên 1 màng lai. Trong quá trình chuyển, vị trí các đoạn được giữ nguyên . - DNA cố định trên màng được đem lai với mẫu dò có đánh dấu phóng xạ. Sau quá trình lai, người ta rửa màng lai để loại bỏ các mẫu dò không bắt cặp chuyên biệt với DNA cố định trên màng. - Cuối cùng, người ta dùng kĩ thuật phóng xạ tự ghi (autoradiography) để định vị các phân tử lai (DNA bộ gen ; mẫu dò ) trong kĩ thuật này, người ta đặt 1 phim nhạy cảm với tia xạ áp sát vào màng lai. Các phân tử lai (đúng hơn là mẫu dò có đánh dấu phóng xạ ) sẽ tác động lên phim và kết quả được thể hiện qua các chấm đen trên phim. Các ứng dụng của Southern blot : - Lập bản đồ giới hạn của 1 gen . - Phát hiện các đa dạng trình tự (frament polymorphism ) của cùng 1 gen ở các chủng hay các cá thể khác nhau qua sự so sánh bản đồ giới hạn của chúng . - Phát hiện các đột biến mất đoạn , đột biến điểm hay tái tổ hợp trên 1 gen vì chúng làm thay đổi bản đồ giới hạn . 3.2 Northern blot Sơ đồ phương pháp lai Northern blot Chuyển RNA từ gel lên màng lai Sơ đồ phương pháp lai Northern blot Phương pháp này được sử dụng để xác định kích thước và hàm lượng của 1 mRNA đặc trưng trong 1 hỗn hợp RNA. Phương pháp này cũng bao gồm những bước sau: - RNA (đã được làm biến tính )sẽ được phân tách theo kích thước nhờ điện di trên gel agarose có chứa các chất làm biến tính . Các chất làm biến tính có tác dụng khiến các liên kết yếu quy định cấu trúc bậc 2 của RNA không thể hình thành trở lại sau khi RNA đã biến tính. Và do đó không cản trở sự di chuyển cũng như sự phân tách các RNA trong gel. - Sau đó RNA được chuyển lên mành lai . - RNA cố định trên màng lai được đem lai với mẫu dò có đánh dấu phóng xạ . - Các phân tử lai được phát hiện nhờ kĩ thuật phóng xạ tự ghi. 3.3. Western blot Western blot là quá trình protein-protein kết hợp đặc hiệu với nhau. Thường thì người ta sẽ sử dụng antibody protein co gắn phóng xa hoặc gắn huỳnh quang để phát hiện một loại protein nào đó Western blot là kỹ thuật phát hiện protein bằng phương pháp điện di trên gel SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis), được dùng rộng rãi trong chẩn đoán các bệnh miễn dịch như chẩn đoán nhiễm HIV, viêm gan virus...Western blot còn có tên gọi khác là Western blotting hay là phương pháp lai thấm protein.Western blot bao gồm các bước cơ bản sau:- Protein được phân tách bằng điện di trên gel SDS-PAGE.- Các protein được chuyển sang màng lai nitrocellulose, giữ nguyên vị trí như đã phân tách trên gel.- Ủ màng lai đã cố định protein với một kháng thể sơ cấp (primary antibody). Kháng thể sơ cấp là một kháng thể đặc hiệu, sẽ bám vào protein và tạo thành một phức hợp protein-kháng thể đối với protein quan tâm.- Tiếp theo ủ màng lai với một kháng thể thứ cấp (secondary antibody) có enzyme (alkalin phosphatase hoặc horseradish peroxidase) đi kèm. Kháng thể thứ cấp sẽ bám vào kháng thể sơ cấp giống như kháng thể sơ cấp đã bám vào protein.- Tiếp tục ủ màng lai trong một hỗn hợp phản ứng đặc hiệu với enzyme. Nếu mọi việc đều diễn ra một cách chính xác sẽ phát hiện thấy các băng ở bất kỳ nơi nào có mặt phức hợp protein-kháng thể sơ cấp-kháng thể thứ cấp-enzyme hay nói cách khác là ở bất kỳ nơi nào có mặt protein quan tâm.- Ðặt một phim nhạy cảm với tia X lên màng lai để phát hiện các điểm sáng phát ra do enzyme. 3.4. Bảng so sánh các phương pháp lai : Southern Blot Northern Blot Western Blot 1) Trích DNA từ tế bào. 1) Trích RNA từ tế bào. 1) Trích protein từ tế bào . 2) Cắt với enzyme giới hạn. 2) Làm biến tính với formaldehyde . 2) Làm biến tính với SDS . 3) Chạy trên gel (thường dùng agarose). 3) Chạy trên gel (thường dùng agarose). 3) Chạy trên gel (thường dùng polyacrylamide gọi là “SDSPAGE”. 3*) Làm biến tính DNA với alkali. 4) Chuyển lên màng nitrocellulose (thường bằng họat động mao dẫn). 4) Chuyển lên màng nitrocellulose (thường bằng họat động mao dẫn). 4) Chuyển lên màng nitrocellulose (thường do chạy điện di). 5) Tắc nghẽn với DNA dư. 5) Tắc nghẽn với RNA dư. 5) Tắc nghẽn với protein dư 6) Lai với mẫu dò DNA được đánh dấu. 6) Lai với mẫu dò DNA được đánh dấu. 6) Lai với mẫu dò kháng thể được đánh dấu. 7) Rửa sạch khỏi mẫu dò chưa được liên kết (dưới sự kiểm sóat nghiêm ngặt) 7) Rửa sạch khỏi mẫu dò chưa được liên kết (dưới sự kiểm soát nghiêm ngặt) 7) Rửa sạch khỏi mẫu dò chưa được liên kết Ứng dụng Bản đồ giới hạn của gene X trong chromosome. Phát hiện các fragment polymorphysm của cùng 1 gen ở các cá thể khác nhau . Phát hiện đột biến mất đoạn, điểm hay tái tổ hợp trên 1 gen. Ứng dụng - Bao nhiêu mRNA của gene X hiện diện? - Độ dài mRNA của gene X? Ứng dụng - Bao nhiêu protein X hiện diện ? - Độ lớn của protein X? Những đặc tính quan trọng của 3 phương pháp : Southern Northern Western Cái gì chia khối lượng phân tử đích? DNA bị cắt bởi enzyme cắt RNA bị làm biến tính với formaldehyde Protein bị làm biến tính với SDS Mẫu dò DNA mang gene X có tính phóng xạ DNA mang gene X có tính phóng xạ Kháng thể đối kháng với protein X được đánh dấu phóng xạ hay enzyme CHẤT PHỤ GIA THỰC PHẨM BIẾN ĐỔI GEN Tên giống Tác giả / cơ quan Gen hữu hiện Phương pháp xét nghiệm Năm Hiện trạng Ứng dụng Bắp Mosanto cry3Bb1 / Bacillus thuringiensis subsp. kumamotoensis Southern 2001 Làm thực phẩm, thức ăn gia súc ở Mỹ,Canada,Philipines,Nhật, Châu âu làm thúc ăn gia súc. Bảo vệ bắp đối với sâu hại rễ bắp Dekalb Genetics Corporation cry 1Ac / Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki (Btk),                                bar/ Streptomyces hygrocopicus Phân tích Southern, PCR 1997 Dùng làm tực phẩm và thức ăn gia súc ở Canada, M, Philippines; thực phẩm ở Nhật, Úc và Đài loan Kháng sâu đục trái Châu âu và thuốc cỏ glufosinate Mosanto mepsps / Zea mays Phân tích Northern và Western 1997 Dùng làm thực phẩm và thức ăn gia súc ở Canada, Argentina, Nhật,  Mỹ, Philippines; thực phẩm ở Đài loan, Úc và Hàn quốc; thức ăn gia súc ở Châu âu Kháng thuốc cỏ glyphosate Pioneer Hi-Bred International, Inc., Mycoyen Seeds/Dow AgrSciences LLC cry1Fa2 / Bacillus thuringiensis var. aizawai                              pat / Streptomyces viridochromogenes Phân tích Southern, Northern, Direct DNA sequencing, ELISA 2001 Dùng làm thực phẩm và thức ăn gia súc ở Canada, Argentina, Nhật,  Mỹ, Philippines, Nam Phi; thực phẩm ở Đài loan, Úc; thức ăn gia súc ở Châu âu Kháng sâu đục trái bắp Châu âu (Ostrinia nubilalis), Tây nam (Diatraea gradiosella), sâu keo Spodoptera sp., black cutworm (Agrotis ipsilon); kháng thuốc cỏ glufosinate Cải dầu AgrEvo pat / Streptomyces viridochromogenes Phân tích Southern 1995 Được sử dụng làm thực phẩm và thức ăn gia súc ở Nhật và Canada; thực phẩm ở Mỹ Kháng thuốc trừ cỏ Glufosinate Plant Genetic System bar/ Streptomyces hygrocopicus,                             barstar /  Bacillus amyloliquefaciens PCR, Phân tích Southern, Northern; pat assay, npttII assay 1996 Được sử dụng làm thực phẩm và thức ăn gia súc ở Nhật Kháng thuốc trừ cỏ Glufosinate,  tính phục hồi hữu thụ Khoai tây Mosanto cry 3A / Bacillus thuringiensis subsp. Tenebrionis Phân tích Southern 1996 Chấp nhận dùng làm thực phẩm và thức ăn gia súc ở Canada và Mỹ; thực phẩm ở Úc Kháng bọ cánh cứng Colorado hại khoai tây Củ cải đường Monsanto, Syngenta Seeds AG cp4 epsps /Agrobacterium sp. strain CP4 Phân tích Southern,Western hoặc ELISA 1998 Dùng làm thực phẩm và thức ăn gia súc ở Úc, Philippines và Mỹ Kháng thuốc cỏ glyphosate Đậu nành Mosanto cp4 epsps /Agrobacterium sp.strain CP4 Phân tích Southern, Western; PCR, ELISA 1994 Dùng làm thực phẩm và thức ăn gia súc ở Mỹ, Canada, Argentina, Brasil, Cộng hoà Séc, Nhậ, Mexico Kháng thuốc cỏ glyphosate Cà chua Mosanto cry1Ac / Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki (Btk) Phân tích Southern 1998 Dùng làm thực phẩm và thức ăn gia súc ở Mỹ; thực phẩm ở Canada Kháng sâu thuộc họ Lepidoptera Lúa mì Mosanto cp4 epsps /Agrobacterium sp.strain CP4 Phân tích Southern 2004 Dùng làm thực phẩm và thức ăn gia súc ở Mỹ Kháng thuốc trừ cỏ glyphosate Bông vải Bayer CropSci bar /Streptomyces hygroscopius Phân tích Southern, PCR 2003 Dùng làm thực phẩm và thức ăn gia súc ở Canada, Và Mỹ Kháng thuốc cỏ glufosinate CÁC CÂY TRỒNG BIẾN ĐỔI GEN Loại Sản phẩm Tác giả / cơ quan Gen hữu dụng / nguồn gốc Phương pháp xét nghiệm Hiện trạng Ứng dụng Lipase IUB3.1.1.3 Novo Nordisk lipase / Rhizomucor meihie Phân tích Southern NHẬT phê duyệt Acid béo cao cho công nghệ sản xuất bơ sữa a-Amylase TS-25 Novozymes A/S Hiệu suất cao Rennet Maxiren GIST-BROCADES N.V. Hiệu suất cao Pullulanase Optimax Genencor International, Inc. (USA) Hiệu suất cao Riboflavin Ribiflavin (vitamin B2) F. Hoffman-La Hiệu suất cao Glucoamylase AMG-E Novozymes A/S Hiệu suất cao