Tiểu luận Nuôi cấy bao phấn tạo cây đơn bội

Bài tiểu luận GVHD: Ths.Võ Thị Xuyến Sinh viên thực hiện Hà Thị Mỹ Dung Phạm Thị Hồng Liên Trần Thị Luyến Nguyễn Thị Kim Phụng Nguyễn Thị Thu Thanh Huỳnh Thanh Phương Trần Quốc Trung Trương Thị Ngọc Vinh Võ Thị Kim Xuyến MỤC TIÊU ĐẶC ĐIỂM CỦA NUÔI CẤY BAO PHẤN VÀ HẠT PHẤN PP NUÔI CÂY TẠO CÂY ĐƠN BỘI KĨ THUẬT NUÔI CẤY SỰ PHÁT TRIỂN CÁ THỂ CỦA PHÁT SINH ĐƠN TÍNH ĐỰC NUÔI CẤY HẠT PHẤN MỘT SỐ CÂYTRỒNG CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG TẠO CÂY ĐƠN BỘI TRONG NUÔI CẤY BAO PHẤN HẠT PHẤN IN VITRO SỰ ỔN ĐỊNH CỦA NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐƠN BỘI Ý NGHĨA VÀ VIỆC SỬ DỤNG THỂ ĐƠN BỘI ƯU ĐIỂM VÀ NHƯỢC ĐIỂM CỦA NUÔI CẤY CÂY ĐƠN BỘI Giới thiệu 1953 Tulecke, lần đầu tiên quan sát hạt phấn chín thuần thục của cây hạt kín Ginkgo Biloba có thể phát sinh tăng sinh trong nuôi cấy hình thành mô sẹo đơn bội. Năm 1964, Guha và Maheswari ghi nhận sự phát triển trực tiếp của phôi từ tiểu bào tử Datura innoxia qua nuôi cấy túi phấn tách rời. Bourgin và Nitsch(1976) thu nhận được cây thuốc lá( Nicotiana tabacum) đơn bội hoàn chỉnh và từ đó có nhiều thành tựu trong nuôi cấy mô đơn bội được công bố. I. Mục tiêu Nghiên cứu phát sinh đột biến và cũng như sản xuất những cá thể đồng hợp tử với số lượng lớn.  Tìm hiểu vai trò của DNA nhân và DNA tế bào chất, xác định các tính trạng liên quan đến di truyền tế bào chất. Sử dụng trực tiếp trong trồng trọt. II. ĐẶC ĐIỂM CỦA NUÔI CẤY BAO PHẤN  VÀ HẠT PHẤN Nuôi cấy bao phấn và hạt phấn tạo cây đơn bội là nhờ sự cảm ứng phát sinh phôi từ những lần phân chia lặp lại của các bào tử đơn bội, các tiểu bào tử, các hạt phấn non. Giai đoạn phát triển đặc thù của bao phấn tại thời điểm nuôi cấy là nhân tố quan trọng nhất đối với sự thành công của phát sinh phôi. Thực vật hạt kín, mỗi chồi hoa có thể chứa các bao phấn ở các giai đoạn phát triển khác nhau. Vì vậy, mỗi chồi hoa phải được kiểm tra để xác định tất cả các giai đoạn phát triển giúp lựa chọn những bao phấn có độ tuổi phù hợp cho nuôi cấy. III. PP nuôi cây tạo cây đơn bội PP1: Các bao phấn được nuôi cấy trên môi trường có agar hoặc môi trường lỏng và sự phát sinh phôi xảy ra trong bao phấn. PP 2: Hạt phấn được tách rời khỏi bao phấn hoặc bằng phương pháp cơ học, hoặc do nứt nẻ tự nhiên của bao phấn và được nuôi trên môi trường lỏng. IV. Kĩ thuật nuôi cấy Chọn và xử lí nguyên liệu Chọn môi trường tái sinh cây thích hợp Thời gian phát triển và đưa ra vườn ươm. Kiểm tra mức bội thể của cây đơn bội Nhị bội hóa cây đơn bội Chọn và xử lý nguyên liệu Chồi hoa non Tách, vô trùng Rửa nước cất(3 lần) Tách nhị Nuôi cấy vào ống nghiệmor đĩa petri Trên môi trường đặc Trên môi trường lỏng t = 24-270C CĐ chiếu sáng 2400 lux Trong 14 ngày Môi trường nuôi cấy Tùy theo đối tượng nuôi cấy bao phấn, hạt phấn mà chúng ta lựa chọn môi trường thích hợp tương ứng. Môi trường cơ bản thường được sử dụng như White, Murashige và Skoog, Nitsch. Nguồn Carbon là sucrose(2-4%) được sử dụng trong nuôi cấy. Sắt (Fe) Khoáng dinh dưỡng: là nhân tố cần thiết cho phát sinh đơn tính đực. Kích thích phát triển phôi Ở cây thuốc lá và Atropa phát sinh đơn tính đực có thể phát sinh hoàn hảo trên môi trường dinh dưỡng khoáng đơn giản, nhưng trong hầu hết các trường hợp cần bổ sung một tỷ lệ cân bằng auxin/cytokinin hay các chất bổ sung phức tạp vào môi trường nuôi cấy. Auxin đặc biệt quan trọng trong tạo mô sẹo nhưng ức chế tạo phôi, thường sử dụng ở giai đoạn đầu nuôi cấy. Cytokitin cực kì quan trọng cho phản ứng của hạt phấn nuôi cấy. Than hoạt tính: Kích thích quá trình phát sinh đơn tính đực trong nuôi cấy cây thuốc lá. Hấp thu các chất gây độc tiết ra từ mẫu nuôi cấy vào môi trường. Gây ra một sự gia tăng nhỏ phát sinh thể nhị bội. Có thể loại bỏ auxin ra môi trường. Hàm lượng các chất điều hòa sinh trưởng thực vật, nội sinh và ngoại sinh được điều hòa. Thời gian phát triển và đưa ra vườn ươm: Phụ thuộc vào từng loại cây khác nhau mà thời gian nảy mầm từ hạt phấn khác nhau, thường mất từ 3 dến 8 tuần để cho cây nảy mầm từ hạt phấn. PP kiểm tra nhiễm sắc thể Các cây con sau khi đưa ra chậu 20-30 ngày có khoảng 10-15 nhánh. Lấy ngẫu nhiên ở mỗi cây 2-3 nhánh, cắt bỏ hết các bẹ lá ngoài, chỉ lấy một đoạn non trong cùng và đánh dấu thứ tự cho từng cây. Mẫu được cố định theo carnua ( 75ml cồn tuyệt đối + 25ml acetic acid đậm đặc) từ 6-12 giờ. Rửa mẫu vài lần bằng cồn 70%, sau đó rửa bằng nước cất. Nhuộm mẫu bằng dung dịch carmin 2% hay bằng Carbon fuchsin theo Kao. Dung dịch Carbon fuchsin được pha như sau: DD A (dd A): fuchsin basic (3g) + cồn 70%(100ml). DD B (dd B): dd A (1ml) + phenol 5% ( 90 ml). DD C (dd C): dd B + acetic acid (6ml) + formaldehyde (6ml). Ép mẫu trong acetic acid 45%, kiểm tra mức bội thể dưới kính hiển vi. Nhị bội hóa cây đơn bội Xử lí colchicine: cây con in vitro khi còn dính túi phấn được xử lý 24 đến 48 giờ với dd colchicine 0,5%, được rửa sạch bằng nước cất vô trùng và cấy chuyền lại tuy nhiên nếu cây đơn bội lớn thuần thục, dung dd colchicines-lanolin thấm lên trên cuống lá. Tái sinh qua phương pháp nuôi cấy mô: Những thể lưỡng bội được hình thành từ sự nhân đôi xảy ra thường xuyên trong quá trình nuôi cấy mô thực vật đơn bội. Thường sử dụng mô lá của cây đơn bội nuôi cấy. V. SỰ PHÁT TRIỂN CÁ THỂ CỦA PHÁT SINH ĐƠN TÍNH ĐỰC Hiện tượng phát sinh cây đơn bội từ các tế bào giao tử đực của thực vật được gọi là sinh sản đơn tính đực (androgenesis) Có 2 phương thức sinh sản đơn tính đực:- Phát sinh trực tiếp - Phát sinh gián tiếp Mô hình phát sinh đơn tính đực 1. Sinh sản đơn tính trực tiếp từ tiểu bào tử Tiểu bào tử trong bao phấn → Phôi → Cây đơn bội. Cấu trúc dạng phôi (embryoid) phát triển trực tiếp từ hạt phấn. Quá trình này thường xảy ra trong bao phấn. Phôi ở giai đoạn hình cầu, được phóng thích ra từ vỏ ngoài và phát triển. 2. Sinh sản vô tính qua callus Tiểu bào tử trong bao phấn → Callus → Chồi → Cây đơn bội. khối mô này thường phát triển ra ngoài bao phấn. Kiểu phát triển này hoàn toàn phổ biến và do môi trường kích thích phát sinh VI. NUÔI CẤY HẠT PHẤN MỘT SỐ CÂY: A. CÂY LÚA Thu thập vật liệu: Túi phấn được thu nhận vào ngày thứ 60 hoặc 90 sau trồng. Các dòng lúa được gieo trồng cách khoảng nhau 1 tuần và tiến hành trong 5 lần để tránh các giống có thời gian chín khác nhau. Mỗi dòng cần 1-2 tép có mang tược hoa thụ phấn ở giai đoạn chín Quy trình Xử lý vật liệu: - Cây lúa lấy ở giai đoạn phân tử có nhân phân chia đồng nhất trước khi hạt phấn đi vào quá trình phân chia giảm nhiễm. Mẫu được lấy khi khoảng cách giữa tai lá đòng và lá thứ 2 khoảng 2-3cm. Đoạn thân được đặt trong bao nylon phủ giấy nhôm. Xử lý lạnh túi phấn trước khi đưa vào nuôi cấy ở 100C trong tối 48-72h. Khử trùng 20 phút Rửa nước cất 2 tuần Dán kính bằngparafin D= 2mm Dán kính, 270C 5-7 lần Sau vài tuần Đoạn thân chứa túi phấn xử lý lạnh Dd natrihypoclorit2.5% Tách hoa ra khỏi thân Tách túi phấn Mô sẹo phát sinh Phòng dưỡng câyở 24-270C.CDAS 2000lux Cấy lên MT N6 Cấy lên MT tái sinh MS Phòng dưỡng cây CĐCS 50-60mol/m2/s Hình thành chồi Cây, xuất hiện rễ trắng Khi cây cao 8-10 cm, cấy sang môi trường Whitelà bước trung gian khi chuyển ra đất. Các môi trường sử dụng trong nuôi cấy túi phấn lúa: Môi trường tạo mô sẹo: N6 + 2mg/l 2-4,D + 60g/l sucrose. Môi trường tái sinh: MS + 1mg/l BAP + 1mg/l NAA + 1mg/l kinetin + 30g/l sucrose Môi trường nhân chồi: MS + 2mg/l BAP + 30g/l sucrose Môi trường nhân nhanh: MS + 30g/l sucrose Môi trường tạo rễ: MS + 1mg/l NAA + 30g/l sucrose Môi trường thích nghi: dung dịch Yoshida. Kiểm tra NST Tiến hành kiểm tra NST của cây đơn bội bằng cách cố định theo carnua, sau đó nhuộm mẫu bằng carmin hay dd cacbon fuchsin. Quan sát dưới kính hiển vi Nhị bội hóa cây đơn bội Có 3 pp cùng nồng độ colchicine và thời gian 24-48h. PP1: nhổ, rửa và ngâm rễ lúa trong dd colchicine khi cây bắt đầu đẻ nhánh mạnh, sau đó rửa sạch và cấy lại. PP2: cắt bỏ phần trên cây lúa và bao chổ cắt của phần dưới bằng bông tẩm dd colchicine. PP3: dùng dao rạch nhẹ từ trên xuống một đoạn dọc thân khoảng 2cm ngay trên ngọn bông lúa chưa trổ thành một khe nhỏ và đặt vào đó 1 miếng bông tẩm colchicine. ở pp 2 và 3 có thể pha colchicine trong dd glycerin 2% để tránh bay hơi. B. CÂY THUỐC LÁ Nguyên liệu thực vật: Sử dụng bao phấn của cây thuốc lá (Nicotiana tabacum). Hoa thuốc lá 2. Nuôi cấy bao phấn khử trùng 4 tuần Chuyển ra bầu đất 4 tuần Nụ thuốc lá hái ở giai đoạn cánh hoa sắp ló ra khỏi lá đài (nụ dài khoảng 10-15 mm) được khử trùng theo thứ tự: 2 phút trong cồn 70%, 5 phút trong dung dịch HgCl2 0,05% và rửa bằng nước cất vô trùng từ 4-5 lần Trong điều kiện vô trùng, dùng forceps và dao mổ tách nụ lấy các bao phấn cấy vào ống nghiệm chứa môi trường dinh dưỡng đã chuẩn bị sẵn (Bảng 4.1, cột 2). Mỗi ống nghiệm cấy 5-10 bao phấn và đặt ở nhiệt độ 25- 27oC, chiếu sáng từ 10-12 giờ/ngày với cường độ chiếu sáng 2000-3000 lux. Sau 6-8 tuần nuôi, vỏ bao phấn sẽ nứt ra và xuất hiện các cây thuốc lá đơn bội, cấy chuyển những cây thuốc lá này sang những bình tam giác loại 250 ml chứa 50 ml của cùng một loại môi trường để cây đơn bội phát triển. 3. Nhị bội hóa thông qua giai đoạn callus Tiến hành kiểm tra NST của cây đơn bội. Thân của cây thuốc lá đơn bội nuôi cấy trong ống nghiệm được cắt thành từng đoạn dài 5 mm và cấy lên môi trường tạo callus. Sau 7-10 ngày, từ đoạn thân trên sẽ tạo ra callus sơ cấp, sau đó nó sẽ tái sinh thành chồi khi gặp điều kiện thuận lợi. VII. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG TẠO CÂY ĐƠN BỘI TRONG NUÔI CẤY BAO PHẤN HẠT PHẤN IN VITRO Tuổi hạt phấn: Gđ thích hợp để nuôi cấy bắt đầu từ thể 4 nhân cho đến ngay sau lần nguyên phân đầu tiên Trang thái sinh lí của cây cho bao phấn và hạt phấn:Hiệu suất tạo cây đơn bội phụ thuộc nhiều vào trạng thái sinh lý của cây bố, mẹ cho bao phấn, hạt phấn. . Khả năng thành công cao nhất với những bao phấn thu được trong lần trổ hoa đầu tiên và giảm dần trong những lần trổ hoa tiếp theo. Kiểu gen:Trong điều kiện ngày dài thì khả năng tạo cây đươn bội từ túi phấn kém hơn so với ngày ngắn. Tiền xử lí bao phấn, hạt phấn: Hiệu quả nuôi cấy bao phấn tăng nếu xử lí cây cho túi phấn bằng một số tác nhân lí hóa.Xử lý mẫu nhiệt độ lạnh đã làm tăng khả năng tạo mô sẹo và cây từ bao phấn, đồng thời cho phép bảo quản mẫu lâu hơn. Bao phấn từ những cây sinh trưởng dưới cường độ ánh sáng cao, trong điều kiện ngắn ngày sẽ cho hiệu quả tạo phôi cao hơn. Mật độ bao phấn. hạt phấn:Phản ứng sinh trưởng trong nuôi cấy đơn bội bị chi phối bởi mật độ bao phấn, hạt phấn nuôi cấy trên môi trường và thay đổi tùy theo loài thực vật. Dinh dưỡng, hoocmon và các nguyên tố khác: - Môi trường nuôi cấy được sử dụng trong nuôi cấy bao phấn, hạt phấn là: MS-1962, LS-1965, B5-1968, N6-1976. - Các Auxin ngoại sinh (IAA, NAA, IBA, 2,4 D) và cytokinin (BAP, Kinetin, Zeatin ,) cần được đưa vào môi trường để thúc đẩy quá trình phát sinh phôi. - Các nguồn chất hữu cơ không xác định như: dịch chiết nấm men, dịch chiết khoai tây, cà chua… và các axit amin, glutamin có tác động tích cực với sinh trưởng trong nuôi cấy bao phấn, hạt phấn. - Than hoạt tính có tác dụng kích thích phát sinh phôi vô tính cũng như thúc đẩy sự khởi đầu của phôi từ mô bao phấn đơn bội. - Khi sử dụng môi trường đặc cần lựa chọn thạch có độ tinh khiết cao sẽ cho hiệu quả tạo mô sẹo và cây con cao hơn. - Hàm lượng đường cho vào môi trường nuôi cấy thay đổi tùy theo đối tượng nuôi cấy. Hiện tượng bạch tạng trong nuôi cấy bao phấn: Cây hai lá mầm thường phát sinh trực tiếp từ tiểu bào tử và ít khi xuất hiện cây bạch tạng. Cây một lá mầm phát sinh thông qua giai đoạn callus và tần số cây bạch tạng khá cao. Nguyên nhân chưa rõ, có thể hạt phấn chứa ít diệp lục hoặc do điều kiện nuôi cấy làm giảm số lượng lục lạp trong tế bào mô sẹo. Cách khắc phục: tái sinh cây trong đk nhiệt độ thấp hoặc bổ sung thêm than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy. Tần số bạch tạng phụ thuộc vào: Tuổi callus cấy chuyển từ môi trường tạo mô sẹo sang môi trường tái sinh cây. Càng cấy chuyển muộn tần số bạch tạng càng cao. Nhiệt độ nuôi cấy. Nhiệt độ cao thường làm tăng số lượng cây bạch tạng . VIII. SỰ ỔN ĐỊNH CỦA NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐƠN BỘI: Trong nuôi cấy bao phấn, việc xuất hiện những phôi lưỡng bội từ tế bào lưỡng bội của vỏ bao phấn chưa thể loại trừ được. Vì vậy, người ta đang thí nghiệm tạo cây đơn bội từ hạt phấn phân lập. Duy trì được tính ổn định di truyền qua thời gian nuôi cấy kéo dài. Các nhà khoa học đã nghiên cứu tác dụng của việc sử dụng para-fluorophenylame (PFP) để ổn định hay tăng cường sinh trưởng trong nuôi cấy đơn bội. IX. Ý NGHĨA VÀ VIỆC SỬ DỤNG THỂ ĐƠN BỘI: Đơn bội được sử dụng vì hai lý do: Sự có mặt của một bộ nhiễm sắc thể đơn dễ dàng cho tách dòng đột biến. Nhị bội đồng hợp tử thu nhận được bằng cách nhị bội hóa cây đơn bội. Rất có ý nghĩa trong công tác lai tạo giống. Nghiên cứu về phôi học thực nghiệm Nghiên cứu về tế bào học Nghiên cứu đột biến và di truyền Cải thiện giống cây trồng Tạo dòng thuần Tạo cây từ hạt phấn của các dòng lai F1 Nghiên cứu tạo cây từ hạt phấn của các giống thuần Nghiên cứu đột biến, gây đột biến ở các dạng đơn bội và chọn lọc Phát triển các dòng vô tính ở các loài cây thân gỗ lâu năm Chuyển các gen ngoại lai mong muốn Thiết lập các dòng tế bào đơn bội và nhị bội của cây hạt phấn ƯU ĐIỂM VÀ NHƯỢC ĐIỂM CỦA NUÔI CẤY CÂY ĐƠN BỘI Ưu điểm: Nuôi cấy bao phấn: Vì bao phấn có kích thước lớn nên thao tác dễ dàng. Môi trường nuôi cấy đơn giản. Nuôi cấy hạt phấn: Tạo ra giống cây trồng sạch bệnh. Giống tạo ra có phẩm chất di truyền đồng đều. Phát sinh phôi dễ dàng trong quá trình nuôi cấy. Tạo cây đơn bội thuận lợi cho việc nghiên cứu di truyền Tóm lại: Nuôi cấy bao phấn,hạt phấn ra đời đã làm giảm thời gian, đồng thời làm tăng vọt số lượng các cá thể đơn bội thu được. 2. Nhược điểm: Nuôi cấy hạt phấn: Khó thao tác do hạt phấn có kích thước nhỏ. Các giai đoạn phát triển của hạt phấn không đồng đều nên hiệu suất tạo cây đơn bội không cao. Hạt phấn là vật liệu quan trọng để gây đột biến và chuyển nạp gen, tuy nhiên nó ít được sử dụng vì làm giảm tỉ lệ tái sinh cây. Nuôi cấy bao phấn: Khó sàng lọc cây đơn bội. Khi nuôi cấy bao phấn thường gặp hiện tượng bạch tạng Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn, hạt phấn tạo cây đơn bội phức tạp, phụ thuộc nhiều yếu tố: tuổi hạt phấn, trạng thái sinh lý của bao phấn và hạt phấn, kiểu gen, kinh nghiệm…