Tiểu luận Nghiên cứu Enzym Amylase

Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 Trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ TP.HCM Khoa Công Nghệ Thực Phẩm  Bài tiểu luận Lớp 08DTP06 Sinh viên thực hiện : 1/ Nguyễn Lê Hoàng 2/ Hoàng Ngọc Duy Quang 3/ Nguyễn Thị Kim Vân 4/ Nguyễn Ngọc Trung 5/ Lê Nguyễn Nhân Luân Tháng 5/2010 - 1 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 MỤC LỤC Giới thiệu chung .............................................................................................3 A. Giới thiệu I. Khái niệm Enzyme ......................................................................................4 II. Enzyme Amylase là gì ...............................................................................4 III. Lịch sử phát hiện .......................................................................................5 B. Tổng quan về Enzyme Amylase I. Phân loại .....................................................................................................6 II. Hệ Enzyme Amylase ..................................................................................7 1. Enzyme α -Amylase ...............................................................................7 2. Enzyme β -Amylase ................................................................................11 3. Enzyme γ -Amylase ................................................................................13 4. Oligo 1,6-glucosidase ............................................................................14 5. Enzyme pullulanase ...............................................................................15 6. α-glucosidase hay maltase .....................................................................14 III. Cơ chất ......................................................................................................15 1. Tinh bột ..................................................................................................15 2. Glycogen ................................................................................................16 IV. Công nghệ lên men và thu nhận Enzyme Amylase ..................................17 1. Nguồn thu nhận .....................................................................................17 2. Thu nhận Enzyme Amylase từ thực vật ................................................19 3. Thu nhận Enzyme Amylase từ vi sinh vật .............................................22 V. Phương pháp xác định hoạt độ ...................................................................28 1. Đơn vị đo hoạt độ ..................................................................................28 2. Xác định hoạt độ Enzyme α-Amylase theo Rukhliadeva ......................28 3. Xác định hoạt độ Enzyme glucoamylase ( γ -Amylase ) ........................29 4. Điều kiện cần và đủ để thu nhận Amylase có hoạt lực cao ...................29 C. Ứng dụng Enzyme Amylase I.Ứng dụng trong sản xuất Bia ........................................................................3 3 II.Ứng dụng trong sản xuất Bánh mì ..............................................................3 7 III. Ứng dụng trong sản xuất Siro ....................................................................3 8 IV.Ứng dụng trong sản xuất cồn .....................................................................4 1 V. Ứng dụng trong sản xuất bánh kẹo ............................................................42 VI.Ứng dụng trong sản xuất Glucose và Mật .................................................4 3 VII.Ứng dụng trong chế biến thức ăn gia súc .................................................4 3 VIII. Ứng dụng trong công nghiệ p dệt ...........................................................43 Tài liệu tham khảo .....................................................................................4 5 - 2 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 Giới thiệu chung Tinh bột, cùng với protein và chất béo là một thành phần quan trọng bậc nhất trong chế độ dinh dưỡng của loài người cũng như nhiều loài động vật khác. Người La Mã gọi là amilum, một từ bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp (amilon ). Trong quá trình tiêu hóa chúng bị thủy phân thành đường glucose là chất tạo nên nguồn năng lượng chính trong thực phẩm. Ngoài ra tinh bột còn giữ vai trò quan trọng trong công nghiệp thực phẩm do những tính chất hóa lý của chúng. Tinh bột thường được dùng làm chất tạo độ nhớt sánh cho các thực phẩm dạng lỏng, là tác nhân làm bền cho thực phẩm dạng keo, là các yếu tố kết dính và làm đặc để tạo độ cứng, độ đàn hồi cho nhiều loại thực phẩm. Bên cạnh đó, tinh bột còn được dùng trong các ngành công nghiệp khác như sản xuất giấy, rượu, .... Nhiều nước trên thế giới sử dụng nguồn tinh bột từ khoai tây, lúa mì, ngô (sắn), còn riêng ở nước ta thì sử dụng gạo và khoai mì là nguồn tinh bột chủ yếu. Trong chế biến tinh bột và đường, công đoạn quan trọng nhất là thuỷ phân tinh bột về các đường đơn giản. Sau đó, chủ yếu trên cơ sở đường đơn nhờ lên men, người ta sẽ nhận được rất nhiều sản phẩm quan trọng như: rượu cồn, rượu vang, bia, các loại acid hữu cơ, amino acid,… Trước đây người ta hay dùng acid hoặc H2SO4 để thủy phân tinh bột. Nhưng kết quả cho thấy, thuỷ phân bằng acid rất khó kiểm soát và thường tạo nhiều sản phẩm không mong muốn và không đáp ứng tiêu chuẩn an toàn thực phẩm trong khi giá thành lại cao. Cho nên hiện nay để thủy phân tinh bột người ta thường sử dụng Enzyme Amylase thu nhận từ thực vật hoặc các loại vi sinh vật. Ngoài ra, Amylase còn có nhiều ưu điểm hơn khi sử dụng acid để thuỷ phân tinh bột như năng lượng xúc tác thấp, không yêu cầu cao về thiết bị sử dụng, giảm chi phí cho quá trình tinh sạch dịch đường. Nguồn Amylase có thể lấy từ mầm thóc, mầm đại mạch ( malt ), hạt bắp nảy mầm, hay từ nấm mốc,… Trong đó Amylase được thu nhận từ malt với số lượng nhiều nhất, chủ yếu dùng trong sản xuất bia. Nguyên liệu cho sản xuất Enzyme thường là gạo, bắp, khoai mì,… đây là những nguồn nguyên liệu rẻ tiền có thể tìm thấy dễ dàng ở nước ta. Cho nên đây là một lợi thế và là hướng phát triển mạnh có thể làm cơ sở cho nhiều ngành khác phát triển. - 3 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 A. Giới Thiệu I. Khái niệm Enzyme: Trong cơ thể sống (các tế bào) luôn luôn xảy ra quá trình trao đổi chất. Sự trao đổi chất ngừng thì sự sống không còn tồn tại. Quá trình trao đổi của một chất là tập hợp của rất nhiều các phản ứng hóa học phức tạp. Các phản ứng này có liên quan chặt chẽ với nhau và điều chỉnh lẫn nhau. Enzyme là hợp chất protein xúc tác cho các phản ứng hóa học đó. Chúng có khả năng xúc tác đặc hiệu các phản ứng hóa học nhất định và đảm bảo cho các phản ứng xảy ra theo một chiều hướng nhất định với tốc độ nhịp nhàng trong cơ thể sống. Enzyme có trong hầu hết các loại tế bào của cơ thể sống. Chính do những tác nhân xúc tác có nguồn gốc sinh học nên Enzyme còn được gọi là các chất xúc tác sinh học (biocatalysators) nhằm để phân biệt với các chất xúc tác hóa học Chúng là chất xúc tác sinh học không chỉ có vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng, phát triển của mọi sinh vật mà nó còn giữ vai trò rất quan trọng trong công nghệ chế biến thực phẩm, trong y học, trong kỹ thuật phân tích, trong công nghệ gen và bảo vệ mội trường. II. Enzyme Amylase là gì? Amylase là một hệ Enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật . Các Enzyme này thuộc nhóm Enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử trong nhóm polysaccharide với sự tham gia của nước. RR’ + H-OH  RH + R’OH Amylase thủy phân tinh bột, glycogen và dextrin thành glucose, maltose và dextrin hạn chế. Các Enzyme Amylase có trong nước bọt (còn được gọi là ptyalin), trong dịch tiêu hóa của người và động vật, trong hạt nảy mầm, nấm sợi, xạ khuẩn, nấm men và vi khuẩn. Trong nước bọt của người có ptyalin nhưng ở một số loại động vật có vú thì không có như ngựa, chó, mèo... Ptyalin bắt đầu thủy phân tinh bột từ miệng và quá trình này hoàn tất ở ruột non nhờ Amylase của tuyến tụy (còn được gọi là amylopsin). Amylase của malt thủy phân tinh bột lúa mạch thành disaccharide làm cơ chất cho quá trình lên men bởi nấm men. Amylase là một trong những loại Enzyme được ứng dụng rộng rãi nhất trong công nghiệp, y tế, và nhiều lĩnh vực kinh tế khác, đặc biệt là trong ngành công nghiệp thực phẩm. - 4 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 III. Lịch sử phát hiện 1814: Kirchoff, Saint Petercburg chứng minh hạt lúa mạch nảy mầm có tác dụng chuyển hóa tinh bột thành đường ở nhiệt độ từ 4000C – 6000C. Năm 1833, Payen và Perso (Pháp) thêm cồn vào dịch chiết này, thu được kết tủa có khả năng phân giải tinh bột thành đường, và đặt tên là Diastase (xuất phát từ tiếng Hy Lạp, diastatics, có nghĩa là phân giải, đó là Amylase). Sau này theo đề nghị của Duclo, Enzyme phân giải tinh bột được gọi là Amylase. Năm 1851: Leuchs đã phát hiện nước bọt cũng có khả năng phân giải tinh bột thành đường. Sau đó, các Enzyme Amylase trong nước bọt, trong dịch tiêu hóa của người và động vật, trong hạt nảy mầm, nấm mốc, nấm men và vi khuẩn bắt đầu được quan tâm nghiên cứu. Năm 1862, Danilevxki đã tách được Amylase của tuyến tụy bằng phương pháp hấp thụ chọn lọc. Năm 1949, Schwimmer đã xác định được số chu chuyển của α-Amylase là 19000. Năm 1950, Englard và Singer cho biết số chu chuyển của β -Amylase là 250000. Đến năm 1952, người ta đã thu được 72 Enzyme ở trạng thái kết tinh trong đó có 4 Enzyme α-Amylase. Năm 1971, Uxtinilov và cộng sự bằng phương pháp điện di trên gel poliacrylamid đã xác định được sự có mặt của một lượng lớn α-Amylase và glucoamylase trong canh trường nấm mốc và một lượng nhỏ các phân đoạn có hoạt lực dextrinase và transglucosilase. Hiện nay các nước trên thế giới sản xuất hàng trăm tấn chế phẩm Enzyme, trong đó Nhật là nước có truyền thống lâu đời nhất, sau đó đến Anh, Pháp, Mỹ, Đan Mạch, Thụy Điển,... đặc biệt hãng Novo của Đan Mạch là 1 trong những hãng sản xuất Enzyme nổi tiếng trên thế giới. Bên cạnh đó trong những năm gần đây các nước Đông Âu và Trung Quốc cũng bắt đầu nghiên cứu và sản xuất Enzyme. Nếu như ở Tây Âu mạch nha từ lúa mạch là nguồn Enzyme chủ yếu cho việc chuyển hóa tinh bột thành đường, thì ở Viễn Đông Amylase thường được sản xuất từ nấm mốc trên môi trường nuôi cấy là các loại ngũ cốc có chứa tinh bột. Như hãng Novo đã có nhiều chế phẩm Enzyme Amylase đang được sử dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp như: Công nghiệp sản xuất rượu bia, công nghiệp sản xuất bột giặt, công nghiệp giấy… - 5 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 B. Tổng quan về Enzyme Amylase I . Phân loại : Hiện nay, có sáu loại Enzyme Amylase được xếp vào 2 nhóm: Endoamylase ( Enzyme nội bào ) và Exoamylase ( Enzyme ngoại bào ). - Endoamylase : gồm có α-Amylase (EC 3.2.1.1) và nhóm Enzyme khử nhánh. Nhóm Enzyme khử nhánh này được chia thành hai loại: khử trực tiếp là pullulanase ( hay α-dextrin 6-glucanohydrolase ) (EC 3.2.1.41); khử gián tiếp là transglucosylase (hay oligo-1,6- glucosidase) (EC 3.2.1.20) và amylo-1,6-glucosidase (EC 3.2.1.10). Các Enzyme này thủy phân các liên kết bên trong của chuỗi polysaccharide. - Exoamylase. Đây là những Enzyme thủy phân tinh bột tử đầu không khử của chuỗi polysaccharide. Nhóm này gồm có: + β-Amylase (EC 3.2.1.2) + Amyloglucosidase (glucoamylase hay γ-Amylase) (EC 3.2.1.3) Các loại Enzyme endoAmylase và exoAmylase * Sự khác biệt giữa các loại Enzyme Amylase: - Các loại Enzyme Amylase không chỉ khác nhau ở đặc tính mà còn khác nhau ở pH hoạt động và tính ổn định với nhiệt - Tốc độ phản ứng của Amylase phụ thuộc vào pH, nhiệt độ, mức độ polyme hóa của cơ chất. Các Enzyme Amylase có nguồn gốc khác nhau sẽ có tính chất, cơ chế tác dụng và sản phẩm cuối cùng của quá trình thủy phân khác nhau. - 6 – Amylase Exoamylase β-Amylase γ-Amylase Endoamylase Enzym khử nhánh α-Amylase Khử trực tiếp α-dextrin 6-glucanohydrolase (pullulanase) Khử gián tiếp oligo-1,6-glucosidase (transglucosylase) Và amylo 1,6-glucosidase Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 - Amylase có nguồn gốc khác nhau sẽ có thành phần, tính chất, nhiệt độ hoạt động, pH tối ưu và các đặc điểm thủy phân khác nhau. I I. Hệ Enzyme Amylase: 1. Enzyme α-Amylase (α-1,4-glucanohydrolase) (EC 3.2.1.1): a) Cấu tạo: Enzyme α-Amylase là protein có phân tử lượng thấp, thường nằm trong khoảng 50.000 đến 60.000 Dal. Có một số trường hợp đặc biệt như α-Amylase từ loài vi khuẩn Bacillus macerans có phân tử lượng lên đến 130.000 Dal. Đến nay người ta đã biết rất rõ các chuỗi acid amin của 18 loại α-Amylase nhưng chỉ có 2 loại α-Amylase là taka-Amylase từ Apergillus orysee và α-Amylase của tụy lợn được nghiên cứu kỹ về hình thể không gian cấu trúc bậc 3. Mới đây các nghiên cứu về tính đồng nhất của chuỗi mạch acid amin và về vùng kị nước cho thấy các chuỗi mạch acid amin của tất cả các Enzyme α-Amylase đều có cấu trúc bậc 3 tương tự nhau. Cấu trúc không gian của α-Amylase b) Cơ chế tác dụng của α-Amylase: α-Amylase từ các nguồn khác nhau có nhiều điềm rất giống nhau. α-Amylase có khả năng phân cắt các liên kết α-1,4-glucoside nằm ở phía bên trong phân tử cơ chất ( tinh bột hoặc glycogen ) một cách ngẫu nhiên, không theo một trật tự nào cả. α-Amylase không chỉ thủy phân hồ tinh bột mà nó thủy phân cả hạt tinh bột nguyên song với tốc độ rất chậm. - 7 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 Quá trình thủy phân tinh bột bởi α-Amylase là quá trình đa giai đoạn: + Ở giai đoạn đầu ( giai đoạn dextrin hóa ): Chỉ một số phân tử cơ chất bị thủy phân tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp (α-dextrin ), độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh ( các amylose và amylopectin đều bị dịch hóa nhanh ). + Sang giai đoạn 2 ( giai đoạn đường hóa ): Các dextrin phân tử thấp tạo thành bị thủy phân tiếp tục tạo ra các tetra-trimaltose không cho màu với iodine. Các chất này bị thủy phân rất chậm bởi α-Amylase cho tới disaccharide và monosaccharide. Dưới tác dụng của α- Amylase, amylose bị phân giải khá nhanh thành oligosaccharide gồm 6 - 7 gốc glucose ( vì vậy, người ta cho rằng α-Amylase luôn phân cắt amylose thành từng đoạn 6 - 7 gốc glucopiranose 1 ). + Sau đó, các poliglucose này bị phân cắt tiếp tục tạo nên các mạch polyglucose colagen cứ ngắn dần và bị phân giải chậm đến maltotetrose, maltotriose và maltose. Qua một thời gian tác dụng dài, sản phẩm thủy phân của amylose chứa 13% glucose và 87% maltose. Tác dụng của α-Amylase lên amylopectin cũng xảy ra tương tự nhưng vì không phân cắt được liên kết α-1,6-glycoside ở chỗ mạch nhánh trong phân tử amylopectin nên dù có chịu tác dụng lâu thì sản phẩm cuối cùng, ngoài các đường nói trên ( 72% maltose và 19% glucose ) còn có dextrin phân tử thấp và isomaltose 8%. Tóm lại, dưới tác dụng của α-Amylase, tinh bột có thể chuyển thành maltotetrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp. Tuy nhiên, thông thường α-Amylase chỉ thủy phân tinh bột chủ yếu thành dextrin phân tử thấp không cho màu với Iodine và một ít maltose. Khả năng dextrin hóa cao của α-Amylase là tính chất đặc trưng của nó. Vì vậy, người ta thường gọi loại Amylase này là Amylase dextrin hóa hay Amylase dịch hóa. Các giai đoạn của quá trình thủy phân tinh bột của α-Amylase: + Giai đoạn dextrin hóa: Tinh bột dextrin phân tử lượng thấp + Giai đoạn đường hóa: Dextrin tetra và trimaltose di & monosaccharide Amylase oligosacharide poliglucose Maltose maltotriose maltotetrose c) Đặc tính α-Amylase α-Amylase từ các nguồn khác nhau có thành phần amino acid khác nhau, mỗi loại α- Amylase có một tổ hợp amino acid đặc hiệu riêng. α-Amylase là một protein giàu tyrosine, - 8 – α-Amylase Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 tryptophan, acid glutamic và aspartic. Các glutamic acid và aspartic acid chiếm khoảng ¼ tổng lượng amino acid cấu thành nên phân tử Enzyme: + α-Amylase có ít methionine và có khoảng 7-10 gốc cysteine. + Trọng lượng phân tử của α-Amylase nấm mốc: 45.000-50.000 Da ( Knir 1956; Fisher, Stein, 1960 ). + Amylase dễ tan trong nước, trong dung dịch muối và rượu loãng. + Protein của các α-Amylase có tính acid yếu và có tính chất của globuline. Điểm đẳng điện nằm trong vùng pH=4,2 - 5,7 ( Bernfeld P, 1951 ). α-Amylase là một metaloEnzyme. Mỗi phân tử α-Amylase đều có chứa 1-30 nguyên tử gam Ca/mol, nhưng không ít hơn 1 - 6 nguyên tử gam/mol Ca tham gia vào sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc 3 của Enzyme, duy trì hoạt động của Enzyme ( Modolova, 1965 ). Do đó, Ca còn có vai trò duy trì sự tồn tại của Enzyme khi bị tác động bởi các tác nhân gây biến tính và tác động của các Enzyme phân giải protein. Nếu phân tử α-Amylase bị loại bỏ hết Ca thì nó sẽ hoàn toàn bị mất hết khả năng thủy phân cơ chất. α-Amylase bền với nhiệt độ hơn các Enzyme khác. Đặc tính này có lẽ liên quan đến hàm lượng Ca trong phân tử và nồng độ Mg2+. Tất cả các Amylase đều bị kiềm hãm bởi các kim loại nặng như Cu2+, Ag+, Hg2+. Một số kim loại như : Li+, Na+, Cr3+, Mn2+, Zn2+, Co2+, Sn2+, Cr3+, không có ảnh hưởng mấy đến α- Amylase. Một đặc điểm cần lưu ý là hầu hết α-Amylase khá bền với tác động của protease như pepsin, trypsin, papain... Thành phần amino acid của α-Amylase ở nấm mốc Aspergillus như sau ( g/100 g protein ): alamine = 6,8 ; glycine = 6,6 ; valine = 6,9 ; leucine = 8,3 ; Isoleucine = 5,2 ; prolin = 4,2 ; phenylalanine = 4,2 ; tyrosine = 9,5 ; trytophan = 4,0; xetin = 6,5 ; trionin = 10,7 ; cystein + cystine = 1,6 ; glutamic acid = 6,9 ; amide = 1,5 ( Akabori et amilose 1954 ). Không giống các α-Amylase khác, Amylase của Asp.orysee có chứa phần phi protein là polysaccharide. Polyose này bao gồm 8 mol maltose, 1 mol glucose, 2 mol hexosemin trên 1 mol Enzyme ( Akabori et amilose, 1965 ). Vai trò của polyose này vẫn chưa rõ, song đã biết được rằng nó không tham gia vào thành phần của trung tâm hoạt động và nằm ở phía trong phân tử Enzyme. α-Amylase của nấm mốc hầu như chỉ tấn công những hạt tinh bột bị thương tổn. Sản phẩm cuối cùng của thủy phân Amylase là glucose và maltose. Đối với nấm sợi tỉ lệ là 1:3,79 ( Hanrahan, Caldwell, 1953 ) . Fenikxova và Eromsina (1991) cho biết rằng các maltopentose và maltohexose bị thủy phân theo sơ đồ sau: - 9 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 G5 G4 + G1; G6  G2 + G4 hay 2G3 ( chính ) hoặc G5 + G1 ( ít ) α-Amylase của nấm sợi không tấn công liên kết α-1,6 glucoside của amylopectin, nên khi thủy phân nó sẽ tạo thành các dextrin tới hạn phân nhánh. Đây là một cấu trúc phân tử tinh bột do Enzyme α-Amylase phân cắt tạo thành dextrin tới hạn phân nhánh. Sản phẩm thủy phân cuối cùng của tinh bột dưới tác dụng của Amylase nấm sợi chủ yếu là maltose, thứ đến là maltotriose. Nồng độ α-Amylase của VSV tương đối lớn có thể chuyển hóa 70 - 85% tinh bột thành đường lên men. Còn các α-Amylase của nấm mốc thì mức độ đường hóa đến glucose và maltose có thể lên tới 84 - 87%. Điều kiện hoạt động của α-Amylase từ các nguồn khác nhau thường không giống nhau. pH tối thích cho hoạt động của α-Amylase từ nấm sợi là 4,0 - 4,8 ( có thể hoạt động tốt trong vùng pH từ 4,5 - 5,8 ). Theo số liệu của Liphis, pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa và đường hóa của chế phẩm Amylase từ Asp.orysee trong vùng 5,6 - 6,2. Còn theo số liệu của Fenixova thì pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa của nó là 6,0 - 7,0. Độ bền đối với tác dụng của acid cũng khác khác nhau. α-Amylase của Asp.orysee bền vững đối với acid tốt hơn là α-Amylase của malt và vi khuẩn Bac.subtilis. Ở pH= 3,6 và 0oC, α-Amylase của malt bị vô hoạt hoàn toàn sau 15 - 30 phút; α-Amylase vi khuẩn bị bất hoạt đến 50%, trong khi đó hoạt lực của α-Amylase của nấm sợi hình như không giảm bao nhiêu ( Fenilxova, Rmoshinoi 1989 ). Trong dung dịch α-Amylase nấm sợi bảo quản tốt ở pH= 5,0 - 5,5 ; α-Amylase dextrin hóa của nấm sợi đen có thể chịu được pH từ 2,5-2,8. Ở 0oC và pH= 2,5 , nó chỉ bị bất hoạt hoàn toàn sau 1 giờ. - 10 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của α-Amylase từ các nguồn khác nhau cũng không đồng nhất, α-Amylase của nấm sợi rất nhạy cảm đối với tác động nhiệt. Nhiệt độ tối thích của nó là 500C và bị vô hoạt ở 700C ( Kozmina, 1991 ). Trong dung dịch đệm pH = 4,7 , α-Amylase của Asp.orysee rất nhạy với tác động của nhiệt độ cao, thậm chí ở 400C trong 3 giờ hoạt lực dextrin hóa của nó chỉ còn 22 - 29%, hoạt lực đường hóa còn 27 - 85%. Ở 500C trong 2 giờ, α-Amylase của nấm sợi này bị vô hoạt hoàn toàn ( Miller và cộng sự ). Một số tính chất của α-Amylase từ vi sinh vật Tên vi sinh vật pHopt Topt Phân tử lượng (kD) Bacillus acidocaldarius 3,5 75 68 Bacillus stearothermophilus 4,5 – 6,5 65 – 73 48 Bacillus subtilis 5,3 – 6,4 50 47 Acinetobacter sp.I 7,0 50 – 55 55 Acinetobacter sp.II 7,0 50 – 55 65 Bacteroides amylophilus 6,3 43 92 Micrococcus halobius 6,0 – 7,0 50 – 55 89 Streptomyces hygroscopicus 5,0 – 6,0 50 – 55 48 Streptomyces aureofaciens 4,6 – 5,3 40 40 Thermonospora curvata 5,5 – 6,0 65 62 Aspergillus prysee 5,5 – 5,9 40 52 Mucor pusillus 3,5 – 4,0 65 – 70 48 Lipomyces kononenkaae 5,5 40 38 Schwaniomyces castellii 6,0 60 40 2. Enzyme β-Amylase (β-1,4-glucan-maltohydrolase) (EC 3.2.1.2): a) Cấu tạo: β-Amylase hiện diện phổ biến ở thực vật, đặc biệt là hạt nảy mầm. Ở trong các hạt ngũ cốc nảy mầm, β-Amylase xúc tác sự thuỷ phân các liên kết 1,4 α-glucan trong tinh bột , glucogen và polysaccharide, phân cắt từng nhóm maltose từ đầu không khử của mạch . Maltose được tạo thành do sự xúc tác của β-Amylase có cấu hình β. Ở ngũ cốc, β-Amylase tham gia vào sự phân giải của tinh bột trong quá trình nảy mầm của hạt. Ở lúa, β-Amylase được tổng hợp trong suốt quá trình của hạt và hầu như không được tổng hợp ở hạt khô. Ở lúa mạch, Enzyme có mặt ở trong hạt khô, nó được tích lũy trong suốt quá trình phát triển của hạt, khi ở dạng liên kết, Enzyme này là một phân tử có trọng lượng phân tử là 64.000 Da và khi bị phân cắt bởi một protease sẽ được phóng thích dưới dạng tự do và có khối lượng phân tử là 59.000 Da . b) Cơ chế tác dụng của β-Amylase: - 11 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 β-Amylase là một Enzyme ngoại bào (exoenzyme). Tiến trình phân giải bắt đầu từ đầu không khử của các nhánh ngoài cùng cơ chất . β-Amylase phân cắt các liên kết α- 1,4glucoside nhưng khi gặp liên kết α-1,4 glucoside đứng kế cận liên kết α-1,6glucoside thì nó sẽ ngừng tác dụng. Phần polysaccharide còn lại là dextrin phân tử lớn có chứa rất nhiều liên kết α-1,6 glucoside và được gọi là β-dextrin. Cơ chế tác dụng của β-Amylase lên tinh bột Tinh bột - amylase β → maltose (54-58%)+ β-dextrin(42-46%) (glucogen) Tinh bột bị thuỷ phân đồng thời bởi cả α và β-Amylase thì lượng tinh bột thuỷ phân tới 95%. c) Đặc tính của β-Amylase: β-Amylase là một albumin , tâm xúc tác có chứa nhóm –SH , nhóm X-COOH và vòng imidazol của các gốc histidine và là Enzyme ngoại bào (exoEnzyme ) β-Amylase không bền khi có Ca2+, β-Amylase bị kìm hãm bởi Cu2+, Hg2+, urea, iodineoacetamide, iodine, ozon… β-Amylase chịu nhiệt kém hơn α-Amylase nhưng bền hơn với acid. β-Amylase bị bất hoạt ở nhiệt độ 700C. Nhiệt độ tối thích của β-Amylase là 550C , pH 5,1 – 5,5. Tham gia vào cơ chế tác dụng của β-Amylase thường có một nhóm caboxyl thể hiện tính chất ái nhân và một nhóm imidazol thể hiện tính chất ái electron. Sự nghịch đảo hình thể của cacbon anome (C1) được thực hiện nhờ việc tạo thành hợp chất đồng hoá trị trung gian kiểu este axetal giữa cacbon anome và nhóm cacboxyl của tâm hoạt động. Sau đó este này bị phân huỷ bởi tác động của 1 phân tử nước lên nhóm cacboxyl để giải phóng ra α-maltose và hoàn nguyên nhóm cacbxyl của Enzyme. Các đặc tính của β-Amylase Nguồn gốc Enzyme pHopt Topt Phân tử lượng (kD) Đại mạch 5,2 - 56 Lúa mì 5,2 – 5,6 55 64,2 Đỗ tương 5,4 55 57 Khoai lang 5,0 – 6,0 50 – 55 50 B.cerus 7,0 40 58 B.polymyxa 7,5 40 42 B.megaterium 6,5 40 - 65 58 3. Enzyme γ-Amylase (glucoamylase) (EC 3.2.1.3): a) Cấu tạo: γ-Amylase ( glucoamylase hay α-1,4-glucan-glucohydrolase ) là những Enzyme có thể thuỷ phân được cả hai kiểu liên kết của các mạch α-glucan để giải phóng ra ở dạng β. - 12 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 Glucoamylase hay γ-Amylase chủ yếu được tạo ra bởi các vi sinh vật. Đặc biệt là kiểu nấm mốc aspergillus, penicillium và Rhizopus Amyloglucosidase từ nấm mốc là các protein có khối lượng phân tử lượng dao động rất lớn từ 27.000 đến 112.000 Dal tuỳ thuộc vào nguồn gốc của Enzyme Nói chung thì các amyloglucosidase đều chứa các gốc mêthioni, tritophan, và một nửa gốc cystein. Tuy nhiên mối quan hệ giữa chuỗi acid amin, cấu trúc bậc 3 và hoạt động của Enzyme vẫn chưa được làm sáng tỏ tất cả các amyloglucosidase từ nấm mốc đều là glucoprotein chứa từ 5 - 20% gluxit trong đó chủ yếu là các mono saccharid glucose mannose, galactose và glucosamin Các amyloglucosidase chủ yếu được tạo nên từ hai isoEnzyme I và II khác nhau ở khả năng thuỷ phân tinh bột ở trạng thái rắn và bởi độ bền của chúng. Amyloglucosidase I tự hấp thụ và thuỷ phân tinh bột ở trạng thái rắn, ngược lại amyloglucosidase II không có cả hai tinh chất này . b) Cơ chế hoạt động: Amyloglucosidase có thể giải phóng ra β-D-glucose bằng cách thuỷ phân lặp lại nhiều lần các liên kết α-1,4 của mạch α-glucan từ đầu không khử, chúng cũng thuỷ phân được các liên kết α-1,6 và α-1,3 nhưng rất chậm (10 - 30 lần ). Tốc độ thuỷ phân cũng phụ thuộc vào bản chất của các liên kết kề cận với các liên kết glucozit được thuỷ phân , cũng như kích thuớc và cấu trúc của cơ chất bị thuỷ phân . Nhất là với các α-glucan mạch dài ( amylose và amylopectin ) thì bị thuỷ phân nhanh hơn là với các maltodextrin và các oligosaccharit. c) Tính chất: Glucoamylase có khả năng thuỷ phân các liên kết α-1,4 lẫn α-1,6 glucoside. Khi thuỷ phân liên kết α-1,4-glucan trong chuỗi polysaccharide, glucoamylase tách lần lượt từng phân tử glucose ra khỏi đầu không khử của mạch để tạo ra glucose. Enzyme này có nhiều tên gọi khác nhau: α-1,4 ; α-1,6-glucan-4; 6-glucohydrolase; glucoamylase; amyloglucosidase; taka-Amylase B; γ-Amylase… Là Enzyme ngoại bào. Ngoài các liên kết α-1,4 và α-1,6 glucoside , glucoamylase còn có khả năng thuỷ phân các liên kết α-1,2 và α-1,3 glucoside . Glucoamylase có khả năng thuỷ phân hoàn toàn tinh bột , glucogen , amylopectin , dextrin , panose , iso maltose và maltose thành glucose, mà không cần có sự tham gia cuả các loại Enzyme khác. Glucoamylase thuỷ giải các polysaccharide có phân tử lớn nhanh hơn so - 13 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 với các chất có phân tử nhỏ. Các polisaccharide có nhánh như amylopectin, glucogen, β- dextrin bị glucoamylase thủy phân khá nhanh. Đa số glucoamylase có hoạt lực cao nhất ở vùng có pH 3,5 – 5,5 và nhiệt độ 500C . Nó bền với acid hơn α-Amylase nhưng kém bền hơn trong rượu, acetone và không được bảo vệ bởi Ca2+. 4. Oligo 1,6-glucosidase (dextrinase tới hạn) (EC 3.2.1.10) Enzyme này có thể thuỷ phân liên kết α-1,6 – glucoside trong isomaltose , panose và các dextrin tới hạn thành đường có thể lên men được. Enzyme này có ở VSV nhưng đồng thời cũng có trong các hạt nảy mầm ( đại mạch, thóc nảy mầm ). Ngoài oligo–1,6–glucosidase, hệ dextrinase của hạt ngũ cốc , hạt nảy mầm còn có amylopectin–1,6–glucosidase hay R– Enzyme và dextrin–1,6–glucoside hay amylo–1,6–glucoside hay dextrin-6- glucocanhydrolase. Hai loại Enzyme này đều thuỷ phân dextrin triệt để hơn α-Amylase và β-Amylase do đó trong dung dịch thuỷ phân có nhiều maltose hơn . Nhiệt độ tối thích cho các hoạt động của các dextrinase là 400C và pH tối thích là 5,1. 5. Enzyme pullulanase (α-dextrin6-glucosidase) (EC 3.2.1.41) Enzyme này có thể thuỷ phân các liên kết α-1,6 của tinh bột, glucogen, pululan và các dextrin tới hạn. Điều đáng chú ý là sự định vị của các liên kết α-1,6 có ảnh hưởng lớn đến tác động của Enzyme. Đặc biệt là sự có mặt của hai liên kết α-1,4 nằm liền kề bên liên kết α-1,6 là điều kiện cần thiết cho Enzyme phân cắt liên kết này Pullulanase phân giải các liên kết α-1,6 glucoside bị bao quanh tứ phía bởi các liên kết α-1,4. Nó còn có khả năng thủy phân cả những dextrin phân tử thấp chỉ gồm có hai gốc maltose nối nhau bằng liên kết α-1,6 glucoside. Tác dụng hiệp đồng của α-Amylase và pullulanase làm nó bị thủy phân hoàn toàn. 6. α-glucosidase hay maltase (α-D,glucoside-glucohydrolase) (EC 3.2.1.20) Nhiều loại nấm sợi sản sinh Enzyme này. Giống như glucomylase, nó thủy phân maltose thành glucose nhưng không thủy phân tinh bột. Maltase và glucozyltranferase là một Enzyme đồng nhất vừa có khả năng thủy phân liên kết α-1,4, trong các glucopiranoside vừa có khả năng chuyển các gốc glucoside sang đường và rượu. II I. Cơ chất: Cơ chất tác dụng của Amylase là tinh bột và glucose. - 14 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 1. Tinh bột: là nhóm Cacbonhydrat ở thực vật, có chủ yếu trong các loại củ như khoai lang, khoai tây, khoai mì…, trong các hạt ngũ cốc, các loại hạt và có công thức tổng quát là (C6H12O6)n . Hạt tinh bột có hình dáng rất khác nhau với kích thước từ 2 đến 15µm. Tinh bột không nước có khối lượng riêng khoảng 1,633 – 1,648. - Tinh bột là chất keo háo nước điển hình cấu tạo từ amylose – mạch thẳng và amylopectin. Tỷ số amylose và amylopectin trong tinh bột thường vào khoảng 1 : 4. Cả hai đều tạo những gốc α-D-glucose. Amylo có cấu tạo mạch thẳng. Chúng được liên kết bởi các nối α-1,4 glucozit và α-1,6 glucozit nên tạo thành nhiều nhánh. Ngoài amylose và amylopectin trong tinh bột còn có chứa một lượng nhỏ các chất khác như muối khoáng, chất béo, protit… Hàm lượng chung của chúng khoảng 0,2 – 0,7%. - Tinh bột không hòa tan trong nước lạnh, trong rượu và ete. Amylose dễ tan trong nước nóng và tạo nên độ nhớt của dung dịch. Amylopectin khi hòa tan trong nước nóng tạo dung dịch rất nhớt. - Trong nước nóng tinh bột sẽ hút nước trương nở và tạo dạng gel. Mức độ trương của tinh bột phụ thuộc nhiệt độ. Khi tăng dần nhiệt độ, dịch tinh bột sẽ biến thành dạng keo và gọi là hồ tinh bột. Nhiệt độ làm cho hồ tinh bột có độ nhớt cực đại gọi là nhiệt độ hồ hóa của tinh bột. Trong thực tế luôn luôn tồn tại một giới hạn nhiệt độ hồ hóa, vì tinh bột của nguyên liệu bất kì đều gồm nhiều hạt có kích thước khác nhau. + Amylose: có cấu tạo chuỗi không phân nhánh, mạch thẳng cấu tạo từ các gốc α–D- glucopyranosyl, liên kết với nhau bởi gốc α-1,4 glucoside, dài khoảng 300 – 1000 gốc glucose, xoắn theo chiều lò xo mỗi xoắn có 6 gốc glucose tạo thành hình lục giác. Cấu trúc xoắn được giữ vững nhờ các liên kết hidro được tạo thành giữa các nhóm OH tự do . Bên trong xoắn có thể kết hợp với các nguyên tử khác. Cùng với amylopectin, các phân tử amylose tham gia tạo nên cấu hình hạt tinh bột ở thực vật. Ví dụ Amylose tạo thành màu xanh khi tác dụng với Iodine, nếu đun nóng liên kết hidro bị cắt đứt, chuỗi amylose bị duỗi thẳng do bị tách ra khỏi amylose dung dịch mất màu xanh. Amilose thường được phân bố ở phần bên trong của hạt tinh bột. Dung dịch amylose có độ nhớt thấp hơn dung dịch amilopectin. Amylose bị kết tủa bởi ancol butylic. + Amylopectin: Là một polyme mạch nhánh, được cấu tạo từ các gốc α-D- glucopyranosyl liên kết với nhau bởi α-1,4 và α-1,6 glucozit. Mức độ polyme hóa tử amylopectin có thể lên đến giá trị hàng triệu. Cấu trúc phân mạch của nó bao gồm 1 nhánh trung tâm ( chứa liên kết 1-4 ) từ nhánh này phát ra các nhánh phụ có chiều dài khoảng vài chục gốc glucose . Khối lượng phân tử của amylopectin khoảng 500000 - 1 triệu. Amylopectin được phân bố mặt ngoài hạt tinh bột. Dung dịch amylopectin có độ nhớt cao, - 15 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 khi đun nóng làm thay đổi sâu sắc và không thuận ngịch cấu trúc phân tử amilopectin gây ra trạng thái hồ hoá tinh bột. Tinh bột có thể bị thuỷ phân dưới tác dụng của Enzyme Amylase hoặc acid tạo thành các sản phẩm có khối lượng phân tử thấp hơn gọi là dextrin. Các dextrin này có thể bị thuỷ phân hoàn toàn tạo thành các gốc glucose. Như vậy sản phẩm thuỷ phân hoàn toàn tinh bột là glucose tuy nhiên ở những điều kiện xác định, dưới tác dụng của Enzyme disaccharit mantose lại là sản phẩm chủ yếu trong sản phẩm thuỷ phân tinh bột. Cấu trúc của Amylose và Amylopectin 2. Glycogen : Glycogen cũng thuộc glucan, là polysaccharide dự trữ ở người và động vật. Phân tử glycogen có công thức chung là (C6H10O5)n cũng phân nhánh giống như phân tử amilopectin nhưng mức độ phân nhánh nhiều hơn. Phần lớn các gốc glucose trong phân tử kết hợp với nhau qua liên kết α -1,4 glucozit , liên kết α-1,6-glucozit ở chỗ phân nhánh của phân tử. Glycogen bị thuỷ phân dưới tác dụng của Enzyme amylase hoặc acid. Khi thuỷ phân hoàn toàn glycogen nhận được α-D-glucose. Glycogen hoà tan trong nước nóng, cho màu đỏ tím hoặc đỏ nâu với iot Glycogen có số mạch nhiều hơn tinh bột. Phân tử lượng ở trong khoảng 2 – 3 triệu Da. Glycogen dễ tan trong nước, nếu như chúng ta ăn quá nhiều Carbohydrate thì cơ thể chúng ta sẽ chuyển hóa chúng thành chất béo dự trữ. Ở động vật và người glucogen chủ yếu tập trung ở gan. - 16 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 Quá trình thủy phân tinh bột của các Enzyme Amylase IV. Công nghệ lên men và thu nhận Enzyme Amylase: 1. Nguồn thu nhận: Enzyme Amylase có trong các tế bào sinh vật , động thực vật , các loại nấm mốc. Muốn thu nhận Enzyme cần chiết rút ra khỏi tế bào. Trong cơ thể sinh vật, Enzyme ở trong tế bào chất và các cấu tử tạo nên tế bào như nhân microsom … Enzyme không có khả năng đi qua màng tế bào, để đi vào dung dịch chiết. Vì vậy việc đầu tiên là cần phải phá vỡ màng tế bào. Việc phá vỡ cấu trúc tế bào có thể sử dụng một số cách sau : + Biện pháp cơ học như nghiền xay với bột thuỷ tinh , cát thạch anh hoặc máy xay đồng hoá… + Bằng dung môi hữu cơ như butanol, axeton, glycerin, etyl axetat … + Bằng sóng siêu âm, tia X, tia UV… Sau khi nghiền nhỏ Enzyme được chiết rút bằng nuớc hay dung dịch đệm thích hợp, hoặc dung dịch muối trung tính … Dung dịch thu được sau khi chiết ngoài Enzyme còn có các tạp chất khác như protein phi Enzyme, muối, gluxit … Chúng ta cần loại bỏ để thu nhận Enzyme có độ tinh khiết cao. Có rất nhiều phương pháp tinh sạch Enzyme sau đây là một số phương pháp cơ bản được sử dụng rộng rãi và có hiệu quả : - 17 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 + Để loại muối và tạp chất có trọng lượng phân tử nhỏ ta dùng phương pháp thẩm tích qua màng bán thấm. Tinh chất của màng này sẽ cho chất có trọng lượng phân tử nhỏ đi qua . Các chất có trọng lượng phân tử lớn bị giữ lại (Enzyme , protein... ). + Để loại prôtein lạ và tạp chất có trọng lượng phân tử cao ta dùng phối hợp nhiều phương pháp khác nhau như sắc kí hấp phụ , sắc kí trao đổi ion , điện di lọc gel… a) Động vật: Enzyme Amylase có trong tụy tạng của động vật. Tụy tạng là ống dạng chùm, dài, lớn, nằm ngang phía sau dạ dày, giữa lá lách và tá tràng. Chiều dài của tụy tạng khoảng 30-35cm, và nặng khoảng 80-150g. Bên trong có những vách ngăn nhỏ chia tụy tạng thành nhiều thùy nhỏ. Tụy tạng vừa có chức năng nội tiết vừa có chức năng ngoại tiết. Thu nhận Amylase từ động vật phần lớn là từ dịch tụy tạng. 98% tụy tạng được cấu tạo từ các tế bào ngoại tiết hoặc là tế bào tuyến. Các tế bào này tiết Enzyme tiêu hoá vào trong tá tràng. b) Thực vật: Được lấy từ nhiều nguồn như: - Đại mạch (Hordeum sativum): có giống hai hàng và giống nhiều hàng (4,6 hàng), trong đó người ta sử dụng loại hai hàng để sản xuất malt làm bia, những loại còn lại để làm thức ăn cho gia súc. - Lúa (Oryse sativa L): Chủ yếu ở vùng Đông Nam Á - Ngô (Zea mays): có nhiều loại ngô: ngô đá, ngô bột, ngô răng ngựa. Hạt ngô có màu trắng, màu vàng hay màu hồng. Ngô màu vàng do có sự hiện diện của carotenoid và zeaxanthine ở trong nội nhũ, ngô màu hồng là do trong nội nhũ của ngô có anthocyanin c) Vi sinh vật: Ngày nay do ưu thế về nhiều mặt, VSV trở thành nguồn thu Enzyme Amylase chủ đạo. Những chủng VSV tạo nhiều Amylase thường được phân lập từ các nguồn tự nhiên. VSV tạo Amylase được dùng nhiều hơn cả là nấm sợi, giả nấm men và vi khuẩn, còn xạ khuẩn thì ít hơn. - Các giống nấm sợi thường dùng là giống nấm sợi Aspergillus, Rhizopus - Nấm men và giả nấm men thuộc các giống Candida, Saccharomyces. Endomycopsy, Endomyces cũng tạo Amylase. - Nhiều vi khuẩn có khả năng tạo lượng lớn Amylase như: Bac. Polymyxa, Phytomonas destructans, Bact. cassavanum, Clostridium acetobutylium, Pseudomonas saccharophila… Các vi khuẩn ưa nhiệt có khả năng sinh trưởng nhanh và phát triển tốt ở nhiệt độ cao nên khi - 18 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 nuôi chúng ít bị nhiễm VSV khác. Đáng chú ý là Bac. diastaticus, Bac. stearothermophilus, Bac. coagulans, Bac. circulans - Trong nhóm xạ khuẩn rất hiếm gặp loại tạo Amylase mạnh mẽ, tuy nhiên cũng có một số chẳng hạn như xạ khuẩn ưa nhiệt. Micromonospora vulgaris 42 có khả năng tạo một lượng nhỏ α-Amylase hoạt động ở 650C cùng với proteinase và các Enzyme khác. 2. Thu nhận Enzyme từ thực vật: a) Malt đại mạch: Malt là từ chỉ trạng thái hạt nảy mầm . Quá trình sản xuất malt gồm các bước sau : Ngâm hạt, ủ hạt cho nảy mầm, sấy malt tươi, tách mầm, bảo quản malt khô . * Yêu cầu về nguồn nguyên liệu - Hạt có màu vàng vàng óng ánh , thơm mùi rạ tươi . - Hạt phải thuần , tỷ lệ hạt ngoại lai chỉ được chiếm 5% . Không có hạt bị bệnh - Vỏ hạt < 7-9% trọng lượng hạt . Trọng lượng 1000 hạt khoảng 40-44g . - Sức nảy mầm ( qua ngày thứ 3 của quá trình nảy mầm ) : 80 -90% - Khả năng nảy mầm ( tính đến ngày thứ 5 của quá trình nảy mầm : > 95% ) - Độ ẩm của hạt khoảng 15% - Dung trọng : 650 – 680g/l - Hàm lượng protein : 9 – 12% - Hàm lượng tinh bột > 63 – 65% * Sản xuất Malt Các bước trong quy trình sản xuất malt đại mạch : Đại mạch ----- > làm sạch ------ > sấy bảo quản ------ > ngâm hạt ------- > ủ mầm ------ > malt tươi ------ > sấy malt ----- > tách mầm rễ ------ > malt khô Ngâm Hạt : Đại mạch được ngâm trong nước sạch cho đến khi đạt đến sự cân bàng về độ ẩm. Chú ý đến sự thông khí trong khối hạt bằng cách đảo trộn khối hạt thường xuyên. Mục đích của giai đoạn này là tạo độ ẩm cho hạt có điều kiện lấy đủ oxy, đẩy CO2 và các sản phẩm bất lợi cho quá trình nảy mầm của hạt ra ngoài khối hạt . Khi ngâm hạt, nước sẽ ngấm vào hạt làm cho thể tích hạt tăng nên, các Enzyme đang ở trạng thái không hoạt động chuyển sang trạng thái hoạt động và hoạt tính của Enzyme sẽ mạnh dần và thuỷ phân các chất dự trữ có phân tử lượng cao ở trong hạt thành các chất có phân tử lượng nhỏ hơn như đường , amino acid . Vì vậy , cần phải luôn luôn chú ý đến sự thông khí , độ ẩm của hạt và nhiệt độ . - 19 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 Hạt đại mạch khô hầu như không có hoạt lực của α-Amylase. Khi hạt chuẩn bị nảy mầm thì xuất hiện hoạt lực của α-Amylase và hoạt lực này tăng dần. Đến ngày thứ 7 và thứ 8 của quá trình nảy mầm ( nhiệt độ18 – 200C), hoạt lực này đạt đến mức độ tối đa, sau đó giảm xuống. Vào lúc hoạt lực của Enzyme đạt đến mức tối đa thì phải ngừng quá trình nảy mầm bằng cách sấy hạt đang nảy mầm ở nhiệt độ thích hợp . Các bước quy trình sản xuất malt khô b) Malt thóc: Đại mạch là loại ngũ cốc trồng ở vùng ôn đới có khí hậu lạnh. Ở những vùng nhiệt đới người ta nghiên cứu việc sử dụng malt thóc, bắp để thay thế một phần hay toàn bộ malt đại mạch. * Các bước trong quy trình sản xuất malt thóc Hạt lúa ------- > làm sạch, phân loại -------- > sấy bảo quản --------- > ngâm hạt ---- > ủ mầm ------- > malt tươi ---------> sấy malt --------- > tách mầm rễ ------ > malt khô Trong qúa trình nảy mầm của hạt, các Enzyme như Amylase, protease,… hoạt động mạnh xúc tác cho các biến đổi sinh lý, sinh hoá trong hạt như thuỷ phân các chất cao phân tử như tinh bột và cellulose, protein thành những chất đơn giản hơn. Quá trình nảy mầm xảy ra khi hạt có đầy đủ các điều kiện thích hợp về độ ẩm, nhiệt độ. Ngâm Hạt : trong hạt lúa có sẵn một lượng nước ở dạng liên kết. Nước từ bên ngoài khi thấm vào hạt sẽ hoà tan các chất dự trữ, hoạt hóa các Enzyme xúc tác quá trình phân giải các hợp chất cao phân tử trong hạt thành những chất đơn giản cung cấp cho hoạt động tăng - 20 – Sấy khô Thu nhận, xử lý, làm sạch, phân loại Mầm rễ khô Tách mầm rễ Sấy khôNảy mầmNgâm Không khí Malt khô sản xuất bia Malt khô bảo quản Bảo quản Đại mạch Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 trưởng của phôi để hình thành cây mầm. Phôi là nơi hút nước mạnh nhất. Tốc độ hút nước rất mạnh ở thời gian đầu do có sự chênh lệch áp suất thẩm thấu rất lớn giữa môi trường bên ngoài và các tế bào bên trong hạt, đồng thời các chất keo háo nước trương nở rất mạnh, càng về sau, sức hút nước của hạt càng giảm . Ủ hạt : việc ủ hạt trải qua 3 giai đoạn + Giai đoạn 1 : kéo dài 3 ngày. Ở ngày thứ ba bắt đầu nảy mầm, nhiệt độ của khối hạt tăng nhanh do hoạt động hô hấp mạnh. Khối hạt cần được đảo 2 - 3 lần/ngày . + Giai đoạn 2 : kéo dài 3 ngày . Lúc này chồi mầm và rễ mầm tăng trưởng nhanh , nhiệt độ khối hạt cũng tăng nhanh do hoạt động hô hấp cao. Khối hạt cần được đảo 2 - 3 lần/ngày . + Giai đoạn 3 : những ngày sau quá trình nảy mầm xảy ra chậm dầm, nhiệt độ tăng yếu và khối hạt cũng cần được đảo 2 - 3 lần/ngày. * Các quá trình xảy ra trong quá trình nảy mầm của Hạt Khi nước ở bên ngoài thấm vào hạt, các hợp chất cao phân tử bên trong hạt thấm nước và trương lên, các Enzyme thuỷ phân hoạt động, phân cắt các chất này thành những chất đơn giản hơn ở trạng thái hoà tan. Các chất này một phần được chuyển đến để nuôi phôi, một phần bị tiêu hao do hoạt động hô hấp và phần lớn được sử dụng để chuyển hoá thành những chất cao phân tử mới ở các mô của cây nảy mầm. Hoạt động hô hấp trong hạt cần được cung cấp oxy đồng thời thải ra khí CO2 và toả nhiệt làm cho nhiệt độ của khối tăng lên, do đó cần phải chú ý tới đảo trộn khối hạt. Hoạt động của Enzyme : trong khối hạt, Enzyme ở dạng liên kết và chúng được chuyển sang trạng thái hoạt động khi hạt nảy mầm. Ngoài ra còn có một số Enzyme được tổng hợp mới. Các Enzyme hoạt động trong quá trình nảy mầm của hạt lúa . - α-Amylase : Enzyme này không hoàn toàn hoạt động ở hạt chín. Hoạt tính của Enzyme α-Amylase tăng dần trong quá trình nảy mầm của hạt. Ở nhiệt độ 15 - 170C, hoạt tính của α-Amylase đạt đến cực đại vào ngày thứ 10 – 12 của quá trình nảy mầm; Ở nhiệt độ 28 – 300C, hoạt tính của α-Amylase đạt cực đại vào ngày 5 – 8 . - β-Amylase : Enzyme β-Amylase tồn tại ở dạng liên kết và một số ít hoạt động rất yếu trong hạt chín hoàn toàn. Hoạt động này tăng nên trong quá trình hạt nảy mầm. Thời gian để hoạt động của Enzyme này đạt đến cực đại cũng tuỳ thuộc vào nhiệt độ . - Enzyme Oxy Hoá Khử : Trong quá trình nảy mầm , hoạt động của các ezyme này tăng nên mạnh do đó hoạt động hô hấp của hạt cũng gia tăng. Hoạt động hô hấp của hạt mạnh nhất vào ngày thứ 4–6 ở nhiệt độ 27 - 280C và cường độ hô hấp phụ thuộc vào độ ẩm của hạt, nhiệt độ vào lượng O2 cung cấp. - 21 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 * Phương pháp tinh sạch Amylase: Có hai phương pháp - Tinh sạch Enzyme Amylase bằng phương pháp sắc ký - Thu nhận Enzyme Amylase bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide (polyacrylamide Gel Electrophoresis – PAGE) 3. Thu nhận Enzyme từ vi sinh vật: Nguồn thu nhận chủ yếu là : nấm mốc, xạ khuẩn, nấm men và vi khuẩn… Khi nuôi VSV tạo Amylase có hai quá trình liên quan mật thiết với nhau. Quá trình tổng hợp sinh khối VSV và quá trình tích tụ Enzyme trong tế bào hay ngoài môi trường. Ở một số VSV, quá trình tổng hợp Amylase tiến hành song song với quá trình sinh trưởng, nghĩa là sự tích tụ Enzyme phụ thuộc vào tuyến tính của sự tăng khối. * Yêu cầu chung Muốn thu nhận các Enzyme Amylase với hiệu suất cao cần phải tiến hành phân lập, và chọn giống VSV để tuyển lấy những chủng hoạt động mạnh, đồng thời phải tiến hành lựa chọn cơ chất cảm ứng và thành phần môi trường tối thích cũng như tiêu chuẩn hoá các điều kiện nuôi. Như vậy sự tổng hợp Enzyme Amylase không những phụ thuộc vào tính chất di truyền của VSV mà còn phụ thuộc vào việc tuyển chọn các điều kiện nuôi đặc hiệu. Ngoài các yếu tố hoá học (thành phần môi trường) ra, thì các điều kiện lý hoá của quá trình nuôi cấy cũng có một ý nghĩa rất lớn đối với sinh tổng hợp Enzyme Amylase. Trong các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp các Enzyme Amylase trong quá trình nuôi VSV, thì thành phần môi trường , tính chất cơ lý của môi trường, độ tiệt trùng, độ ẩm ban đầu, độ thoáng khí, nhiệt độ nuôi và pH môi trường… Là những yếu tố cơ bản tối quan trọng * Nuôi VSV tạo Amylase bằng phương pháp bề mặt: • Yêu cầu đối với môi trường thành phần dinh dưỡng. Yêu cầu cơ bản đối với thành phần của môi trường nuôi VSV tạo Amylase cũng giống như yêu cầu đối với môi trường nuôi VSV tạo Enzyme khác là tính hoàn thiện. Hầu hết các VSV tạo Amylase đều hấp thụ carbon chủ yếu ở các dạng hợp chất hữu cơ (tinh bột, dextrin…), hyđro ở dạng H2O và của các hợp chất hữu cơ, oxy ở trong thành phần cấu tử cơ bản của môi trường và ở dạng oxy phân tử. Cấu tử chính của môi trường VSV tạo Amylase bằng phương pháp lên men bề mặt là cám mì, cám gạo. Cám mì, cám gạo là nguyên liệu hoàn hảo và có thể là một cấu tử duy nhất của môi trường để nuôi VSV không cần bổ sung thêm các chất khác nữa. Cám mì có 16–22% - 22 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 tinh bột, 10 – 12% protein, trong đó các amino acid quan trọng như methionine (0,19%), cystine (0,3%), arginine (1%), lysine (6%), tryptophan (0,3%), 3 – 4% chất béo, 10,3% celulose, các nguyên tố trơ (Na – 0.09% , K – 1% , Ca – 0.16% , P - 0.94% ) và các nguyên tố vi lượng cùng các chất khác. Cám gạo có khoảng 20% tinh bột 10 –15% chất béo, 10 – 14% protein, 8–16% celulose, các chất hoà tan không chứa nitơ (37 –5 9 %) Chất lượng của cám gạo, cám mì có ảnh hưởng lớn tới hoạt lực của enzyme. Cám không được chứa tinh bột dưới 20 – 30%. Nên dùng cám tốt, cám mới không có vị chua hay vị đắng, không hôi mùi mốc. Độ ẩm của cám không quá 15%, tạp chất độc không quá 0,05%... Tuy là phế liệu của công nghiệp xay xát, nhưng cám cũng tương đối đắt tiền, hơn nữa trong quá trình nuôi VSV, các chất dinh dưỡng không được sử dụng hết, vì thế có thể thay cám bằng một số cấu tử rẻ tiền hơn. Cấu tử này thường là mầm mạch (15 – 20 %), trấu (2 – 5%), mùn cưa (5 - 10%)… Có thể dùng cặn bã canh trường rắn (sau khi cách ly Enzyme) là cấu tử chính của môi trường (Silova, Fenikxov) 1967, đảm bảo chế độ tiệt trùng. Cám và các chất phụ gia chứa nhiều bào tử VSV khác nên cần phải tiệt trùng để đảm bảo chủng nuôi phát triển bình thường và canh trường sản xuất không chứa VSV ngoại lai. Cần thanh trùng dưới áp suất hơi 1 - 5atm trong vòng 4 -6 giờ, có thể thanh trùng bằng hơi nóng ở nhiệt độ 1200C trong 90 phút. Khi thanh trùng cho vào 0,2% formalin (40%) và 0,8% HCl kỹ thuật theo khối lượng môi trường. • Độ ẩm tối thích cuả môi trường : Trong điều kiện sản xuất, độ ẩm ban đầu tối thích (đối với Asp.niger , Asp.awamort, Asp.flavus , Asp.arysee) của môi trường là 58 – 60% và phải giữ cho môi trường có độ ẩm đó trong suốt quá trình nuôi. Độ ẩm mà tăng quá 55 – 70% sẽ làm giảm độ thoáng khí, còn thấp hơn 50 – 55% thì kìm hãm sự sinh trưởng và phát triển của VSV cũng như sự tạo Enzyme Amylase. Trong điều kiện tiệt trùng tốt (môi trường trong bình tam giác, trong tủ ấm phòng thí nghiệm hoạt lực Amylase cao nhất thu ở độ ẩm 65 –68%). Cần nhớ rằng khi nuôi trong điều kiện không được vô trùng tuyệt đối (trên các khay), thì độ ẩm môi trường không được vượt quá 60%, vì cao hơn nữa sẽ dễ bị nhiễm khuẩn. Tuy vậy, việc giữ được độ ẩm cao (việc phòng ngừa và hạn chế sự hư hỏng của canh trường) trong suốt quá trình sinh trưởng của nấm sợi lại còn có ý nghĩa to lớn hơn đối với sự tạo thành Enzyme. Ảnh hưởng của độ ẩm môi trường đến sinh tổng hợp Enzyme Amylase như sau : - 23 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 Ảnh hưởng của việc giữ độ ẩm trong quá trình sinh trưởng tới sự tạo α-Amylase của Asp.ozysee nuôi bằng phương pháp bề mặt . Phương án thí nghiệm 20 giờ 34 giờ 42 giờ Độ ẩm % Hoạt độ của Amylase đv/g canh trường khô Độ ẩm % Hoạt độ của Amylase đv/g canh trường khô Độ ẩm % Hoạt độ của Amylase đv/g canh trường khô Khay để hở 27,8 15.0 23.8 18.0 22.0 20.5 Khay đậy nắp 46,4 20.4 42.4 32.9 42.4 36.7 Qua bảng số liệu trên thấy rõ là hoạt lực α-Amylase của canh trường nuôi nấm sợi , khi bị hong khô giảm gần hai lần. Điều đó khẳng định sự cần thiết phải giữ ẩm cho môi trường ở mức độ tối thích. Cần thông khí liên tục trong suốt thời kì sinh trưởng của VSV. Trong quá trình sinh trưởng của mình VSV tiêu thụ 25 – 35% chất dinh dưỡng của môi trường và thải ra một lượng lớn nhiệt sinh lý và CO2 . Vì vậy cần phải thải nhiệt này bằng thông gió với không khí vô trùng có độ ẩm tương đối khoảng 100%. Chế độ thông khí có thể liên tục , gián đoạn (hoặc không khí tự nhiên) tuỳ thuộc vào chiều dày của lớp môi trường nuôi , vào khoảng cách giữa các tầng khay và đĩa khay. Thường là giai đoạn sinh trưởng thứ nhất phải thông khí vào phòng nuôi khoảng 4 - 5 lần thể tích không khí trên một thể tích phòng trong 1 giờ , còn ở giai đoạn thứ 2 là 30 – 60 thể tích không khí trên thể tích phòng nuôi/1 giờ, còn ở giai đoạn thứ 3 giảm đi chỉ còn 10 – 12 thể tích không khí . • Nhiệt độ nuôi : Toàn bộ chu kì sinh trưởng của nấm mốc trên cám có thể chia làm 3 thời kỳ : + Thời kỳ trương và nảy mầm của đính bào tử (đối với nấm mốc 10 – 11 giờ đầu tiên, đối với vi khuẩn 3 – 4 giờ). Trong thời kỳ này phải đốt nóng không khí phòng nuôi và giữ cho nhiệt độ phòng nuôi không thấp hơn 23 – 300C đối với nấm mốc và duy trì nhiệt độ 32– 380C cho vi khuẩn. Độ ẩm tương đối của không khí là 96 - 100% . + Thời kỳ sinh trưởng nhanh của hệ sợi (kéo dài trong vòng 4- 18giờ). Ở giai đoạn này nấm mốc hô hấp rất mạnh và tạo ra một lượng nhiệt sinh lý rất lớn. Kết quả là trong lớp sợi nấm đang mọc nhiệt độ tăng lên đến 37 - 400C , đôi khi cao hơn tới 470C. Vì vậy cần phải hạ nhiệt độ phòng nuôi giúp cho sợi nấm mọc đều và đẹp. Ở nhà máy người ta thổi không khí vô trùng có nhiệt độ 28 – 290C và độ ẩm cao vào phòng nuôi. + Thời kỳ tạo Enzyme Amylase mạnh mẽ (kéo dài từ 10 - 20 giờ). Trong thời kỳ này các quá trình trao đổi chất dần dần yếu đi, sự toả nhiệt giảm mạnh. Các Enzyme Amylase được tổng hợp mạnh mẽ. Theo Rodxevits (Pozerur, 1967) trong một ngày đầu ở giai đoạn - 24 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 sinh trưởng thứ nhất, thứ hai, nấm mốc Asp.ozysee chỉ được tạo được 7,5 – 8% Enzyme , trong vòng 12h sau, hoạt lực của oligo–1,6– glucosidase tăng lên gấp 10 lần. Đối với đa số VSV ở giai đoạn này nên hạ nhiệt độ xuống 3 – 40C so với giai đoạn đầu. Nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng của đa số nấm mốc trên môi trường rắn là 28 - 300C , cho Bac.subtilis là 35– 370C. Thời gian nuôi để có lượng Amylase cực lớn thường được xác định bằng thực nghiệm. Tuỳ thuộc vào tính chất của chủng VSV và sự ngừng tổng hợp Enzyme mà có thể ngừng sinh trưởng của nấm mốc vào bất kỳ lúc nào thấy cần thiết. Sự tạo bào tử là hiện tượng không mong muốn vì thường làm giảm hoạt lực của Enzyme. Đối với đa số nấm mốc Aspergillus, sự tạo Enzyme Amylase cực đại thường kết thúc khi nấm mốc bắt đầu sinh đính bào tử. Trong điều kiện sản xuất thoáng khí tốt thì thời gian nuôi để có thể tích luỹ Amylase cực đại đối với từng loại nấm sợi và vi khuẩn như sau : Chủng Thời gian nuôi ( giờ ) - Asp.orysee – 476 24 -25 - Asp.oryae – KC 30 – 36 - Asp.oryae 8F1 24 – 30 - Asp.awamori 22 36 - Bac.subtilis 68 – 72 ( ở 300C ) * Nuôi VSV tạo Amylase bằng phương pháp bề sâu: • Môi trường dinh dưỡng : Đặc điểm chung cho mọi môi trường nuôi VSV tạo Enzyme Amylase là có chất cảm ứng: tinh bột, dextrin hay maltose. Nguồn nitơ dinh dưỡng thường dùng là nitơ vô cơ (NaNO3). Sinh tổng hợp α-Amylase hoạt động của chủng Aspergillus thường chỉ thấy trong các môi trường có các muối của acid sulfuric. Đối với sinh trưởng của một số nấm sợi tạo maltase và oligo–1,6–glucoamylase hoạt động lại rất cần có sự có mặt của Mg trong môi trường. Để tạo điều kiện cho VSV phát triển tốt và sinh nhiều Amylase người ta cho thêm vào môi trường các loại nước chiết như nước chiết mầm mạch, nước chiết ngô, nước chiết đậu nành,… đó là nguồn bổ sung amino acid, vitamin và các tạp chất sinh trưởng. Dưới đây là một số môi trường lỏng dùng để VSV tạo các Enzyme Amylase. Đối với Aspergillus, người ta thường nuôi bằng môi trường Sapeck cải tiến gồm : 6% tinh bột ; 0,9% NaNO3 ; 0,001% FeSO4 ; 0,1% KH2PO4 ; 0,05%MgSO4; 0,05% KCl và nước máy. Để tăng cường khả năng sinh trưởng của VSV và khả năng tạo Enzyme có thể thêm nước chiết mầm mạch, nước chiết ngô, nước cám nấu, nước chiết bột đậu nành . - 25 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 • Nhiệt độ nuôi : Nhiệt độ nuôi là một trong những yếu tố quan trọng với sinh trưởng của VSV và sự tạo thành các Enzyme Amylase. Không tuân thủ đầy đủ chế độ nhiệt độ sẽ dẫn tới giảm hoạt lực các Amylase. Nhiệt độ nuôi tối thích đối với nấm sợi thuộc giống Aspergillus là 30 – 320C (trong đó có Asp.orysee 3–9–15 và Asp.awamori 22), Bacillus. Môi trường thích hợp nhất và tạo nhiều Amylase ở nhiệt độ 370C. Một số vi khuẩn khác thì lại có nhiệt độ tối thích cao hơn. Bac.circulans phát triển mạnh ở nhiệt độ 65 – 700C song lại tạo nhiều Amylase ở nhiệt độ 500C vì vậy người ta thường cấy giống ở 700C sau đó tiến hành cho tích luỹ ở nhiệt độ 500C nuôi chủng này bằng môi trường nước lỏng gồm nước nấu khoai tây, pepton và phấn. Nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn tới độ bền của Enzyme tạo thành Amylase của Bac.coagulans và Bac.searothermophilus được nuôi ở 350C và 550C có độ bền nhiệt khác xa nhau. Khi giữ nhiệt ở 900C trong 1 giờ thì Amylase của chủng sinh trưởng ở nhiệt độ 350C bị mất 90 – 94% hoạt độ ban đầu ; trong lúc đó Amylase của chủng được nuôi ở nhiệt độ 550C chỉ bị vô hoạt có 10 - 12%. Các VSV ưa nhiệt thì sinh tổng hợp nên các Amylase bền nhiệt. Enzyme với độ bền nhiệt cao có ưu thế lớn trong nhiều lĩnh vực sản xuất. Ngoài ra nuôi vi khuẩn ưa nhiệt lại rất tiện lợi cho việc sản xuất công nghiệp, vì nuôi ở nhiệt độ cao tạo ra điều kiện chọn lọc và cho phép giảm bớt yêu cầu khắt khe về độ tuyệt trùng, đồng thời khi nuôi đỡ bị nhiễm tạp khuẩn. • Sục khí và khuấy trộn Phần lớn vi sinh vật tạo Amylase là những VSV hiếu khí. Vì vậy sinh trưởng cuả chúng phụ thuộc vào lượng oxy phân tử hoà tan trong dịch nuôi cấy. Trong quá trình sinh trưởng của mình, VSV sử dụng oxy phân tử cho hoạt động sống nên lượng oxy hoà tan trong môi trường lỏng phải luôn luôn được bổ sung. Chính vì lẽ đó, việc sục khí và khuấy đảo môi trường có tác dụng tốt tới quá trình sinh trưởng và tích luỹ sinh khối cũng như sinh tổng hợp các Enzyme của VSV : Việc khuấy đảo bằng các cách như sau : + Sục không khí vô trùng vào thiết bị nuôi + Bằng máy móc chuyên dùng + Bằng tác dụng hiệp đồng của cả sục khí lẫn máy khuấy + Bằng tác dụng của các khí sinh ra khi lên men * Đối với nấm sợi, chế độ sục khí thích hợp là 10 – 12m3 không khí vô trùng ( có nhiệt độ không quá 400C ) trên 1m3 môi trường trong 1 giờ với thời gian nuôi trong khoảng 68 – 72giờ. Với thời gian nuôi ngắn hơn ở các thùng lên men nhân giống ( 48giờ ) và trong các thùng lên men sản xuất (48 – 52giờ) thì lượng không khí cần sục vào môi trường để nuôi - 26 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 Asp.orysee (3-9-15) phải là 30m3/m3 môi trường /giờ đối với thùng nhân giống và 40m3/m3 môi trường/giờ cho thùng sản xuất. Mức độ sục khí tối ưu để nuôi Asp.orysee (3-9-15) tương ứng với 180 micromol O2/lít môi trường (nồng độ oxy hoà tan đo bằng máy cực phổ với điện cực kiểu clark). Chủng này có vận tốc tiêu thụ oxy hoà tan cực lớn vào cuối pha sinh trưởng logarithm. Vận tốc tiêu thụ O2 giảm dần từ lúc bắt đầu pha ổn định. Nuôi VSV ưa nhiệt đòi hỏi nhiều không khí hơn là nuôi VSV ưa ẩm. Nhiệt độ và pH của một số Enzyme Amylase do VSV tổng hợp Vi sinh vật Enzyme pHoppt Toopt Aspa.wamori α-Amylase 4,5 – 6,2 40 β-Amlylase 3,5 – 7,0 50 Glucoamylase 4,5 – 4,7 55-75 Asp.niger α-Amylase 4,7 – 6,0 65Glucoamylase 3,8 50 Asp.asami α-Amylase 3,8 50Glucoamylase 5,0 55 Asp.orysee α-Amylase 5,5 – 5,9 50 – 57 β-Amlylase 4,8 30 Glucoamylase 4,8 50 Bac.amyloliquefaciens α-Amylase 5,7 – 6,0 55 – 60 Bac.diastaticus α-Amylase 5,8 70 Bac.subtilis α-Amylase 4,6 – 5,1 37 Endomyces sp Glucoamylase 4,8 55 Phizopase doleamar Glucoamylase 5,5 45 V. Phương pháp xác định hoạt độ: 1. Đơn vị đo hoạt độ: Mức độ hoạt động trong chế phẩm là thông tin quan trọng về lượng Enzyme trong đối tượng nghiên cứu, vì trong những điều kiện xác định, tốc độ phản ứng Enzyme tỉ lệ với lượng Enzyme trong hỗn hợp phản ứng. Lượng Enzyme theo quy ước quốc tế được biểu diễn bằng đơn vị Enzyme. Đơn vị Enzyme quốc tế ( UI ) là lượng Enzyme có khả năng xúc tác chuyển hóa được 1 micromol cơ chất sau 1 phút ở điều kiện tiêu chuẩn. Trong những điều kiện xác định ( bão hòa cơ chất ), tốc độ phản ứng do Enzyme xúc tác tỷ lệ với lượng Enzyme trong hỗn hợp phản ứng - 27 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 Hoạt độ riêng của 1 chế phẩm Enzyme đặc trưng cho độ thuần khiết của chế phẩm Enzyme. Hoạt độ phân tử của Enzyme là số phân tử cơ chất ( hoặc số đương lượng các liên kết bị phân giải ) được chuyển hóa bởi 1 phân tử Enzyme sau 1 phút. Hoạt độ của trung tâm xúc tác Enzyme là số cơ chất ( hoặc số đương lượng các liên kết bị phân giải ) được chuyển hóa trên 1 trung tâm hoạt động sau 1 phút. Hoạt độ xúc tác của Enzyme càng mạnh thì lượng cơ chất bị chuyển hóa hoặc lượng sản phẩm phản ứng tạo thành trên 1 đơn vị thời gian càng lớn. Bằng cách xác định tốc độ chuyển hóa của cơ chất hoặc tốc độ tích lũy sản phẩm phản ứng ta có thể đánh giá hoạt độ xúc tác của Enzyme. Có 3 nhóm phương pháp: - Đo lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trong 1 thời gian nhất định ứng với 1 nồng độ Enzyme nhất định. - Đo thời gian cần thiết để thu được 1 lượng biến thiên nhất định của cơ chất hay sản phẩm ứng với 1 nồng độ Enzyme nhất định. - Chọn nồng độ Enzyme như thế nào để trong 1 thời gian nhất định thu được sự biến thiên nhất định về cơ chất hay sản phẩm. * Phương pháp xác định hoạt độ Enzyme có rất nhiều. Ở mỗi nước và mỗi phòng thí nghiệm có thể dùng phương pháp này hay phương pháp khác là tùy thuộc điều kiện và thói quen. Nhưng khi so sánh chất lượng giữa các chế phẩm với nhau thì phải theo phương pháp thống nhất. 2. Xác định hoạt độ Enzyme α-Amylase theo Rukhliadeva: Phương pháp dựa trên cơ sở thủy phân tinh bột bởi Enzyme có trong dịch chế phẩm nghiên cứu với các dextrin có phân tử lượng khác nhau. Đo cường độ màu tạo thành giữa tinh bột và các sản phẩm thủy phân của nó với iodine bằng máy so màu quang điện sẽ tính được hoạt độ Enzyme Đơn vị hoạt độ Amylase là lượng Enzyme chuyển hóa được 1 g tinh bột tan thành các dextrin có phân tử lượng khác nhau ở 300C trong thời gian 1 giờ ( pH cho Amylase của malt là 4,8 – 4,9; của nấm là 4,7; của vi khuẩn là 6,0 …) 3. Xác định hoạt độ Enzyme glucoamylase ( γ-Amylase) a/ Phương pháp vi lượng của V.Y.Rodzevich, O.P.Korenbiakina Phương pháp dựa trên cơ sở thủy phân tinh bột bởi Enzyme glucoamylase có trong chế phẩm nghiên cứu. Xác định lượng glucose tạo thành sẽ tính được hoạt độ Enzyme. - 28 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 Đơn vị hoạt độ glucoamylase là lượng Enzyme tác dụng lên dung dịch tinh bột tan pH= 4,7 ở nhiệt độ 300C trong 1 giờ giải phóng được 1 mg glucose. b/ Phương pháp sử dụng Enzyme glucosidase: Phương pháp dựa trên cơ sở thủy phân tinh bột bởi Enzyme glucoamylase có trong dịch chế phẩm nghiên cứu. Xác định lượng glucose tạo thành qua phản ứng xúc tác đặc hiệu của Enzyme glucosidase sẽ xác định được hoạt độ Enzyme. Đơn vị hoạt độ glucoamylase là lượng Enzyme tác dụng lên dung dịch tinh bột tan pH = 4,7 ở nhiệt độ 300C trong thời gian 1 phút giải phóng được 1 μmol glucose. 4. Điều kiện cần và đủ để thu nhận chế phẩm Amylase có hoạt lực cao a) Chủng giống vi sinh vật: Muốn nhận chế phẩm Amylase có hoạt độ cao, trước hết phải tuyển chọn, nghiên cứu xem chủng, giống nào có khả năng tích tụ nhiều Amylase. Khi đã tuyển chọn được giống tốt tức là đã có được điều kiện cần thiết để tạo ra chế phẩm Amylase có hoạt độ cao. Nhưng giống tốt chỉ có tính chất tương đối với thời gian và điều kiện nhất định nào đó. Loài người luôn tìm cách phân lập và tạo ra các giống mới có hoạt lực ngày càng cao hơn bằng nhiều biện pháp khác nhau như lai tạo, gây đột biến, tách và cấy gen. Bằng con đường kết hợp giữa etylenimin và tia tử ngoại Ghendina đã tạo được chủng Asp.awamori 78 - 2 và Asp.awamori 22 có hoạt lực Amylase cao hơn 2 - 3 lần so với ban đầu. b) Môi trường dinh dưỡng: Trong sản xuất chế phẩm Amylase theo phương pháp nuôi cấy bề mặt trên canh trường rắn người ta hay dùng nhất là cám lúa mì. Đây là môi trường tự nhiên tốt nhất để sinh tổng hợp Amylase. Cám lúa mì thường chứa khoảng 20 - 30% tinh bột, 10 - 12% protit. Ngoài ra còn chứa muối khoáng, các nguyên tố vi lượng, vitamin... Để tiết kiệm cám người ta còn trộn thêm các nguyên liệu khác vào môi trường như trấu, mùn cưa, bã khoai tây, bã bia... Ở nước ta do không có cám lúa mì nên trong sản xuất người ta hay dùng nhất là bột ngô vàng, cám gạo và trấu đem trộn lẫn với nhau. Thành phần tối ưu để thu được chế phẩm Amylase có hoạt độ cao từ Asp.awamori là cám 75% ( hàm lượng tinh bột 29% ) bột ngô 6% ( hàm lượng tinh bột 55% ) và 19% trấu. Hàm lượng tinh bột chung là 25%. Điều kiện tối ưu khi nuôi cấy là: to 32OC, độ ẩm 57% và nuôi trong 42 giờ. - 29 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 Ngoài tinh bột, môi trường cần chứa maltose và dextrin. Sự có mặt của glucose, fructose và saccarose có tác dụng giúp cho sự phát triển của nấm mốc nhưng lại hạn chế sự tích tụ Amylase. Ngược lại khi thêm lactose và MgO vào môi trường lỏng thì nấm mốc phát triển kém nhưng lại tạo nhiều Amylase. Ngoài gluxit, để tổng hợp Enzyme, vi sinh vật nói chung và nấm mốc nói riêng đều cần đến chất chứa nitơ. Nguồn nitơ có thể có sẵn trong cám, bột ngô, khi cần thiết có thể bổ sung thêm từ khô lạc, khô đậu tương hoặc từ các muối amin hoặc ure. Theo kết quả nghiên cứu của giáo sư Phenicxôva, nấm mốc Asp.awamori có thể phát triển tốt trong môi trường chứa 0,05% đạm vô cơ nhưng để tạo α-Amylose thì cần tăng nồng độ tới 0,15%; để tạo glucoamylase cần tăng tới 0,4%. Nhiều nguồn đạm hữu cơ cũng có tác dụng tốt đến sinh trưởng và phát triển của nấm mốc nhưng ít có hiệu quả về phương diện tích tụ Enzyme. Ví dụ khi bổ sung gelatin casein và ngay cả cao ngô vào canh trường thì việc tích tụ Enzyme vẫn thua kém so với nguồn đạm vô cơ. Ngược lại, nếu ta thêm mầm, rễ của hạt ươm mầm vào canh trường lại có tác dụng tốt đến tích tụ Enzyme. Sự tạo thành và tích tụ Amylase còn gắn với sự có mặt của các ion Mg2+, Ca2+ và photpho, đặc biệt là magie. Trong môi trường thiếu MgSO4, Amylase hầu như không đc tạo thành, hàm lượng chỉ vào khoảng 0,05% - Sau magie là photpho, ion P đóng vai trò quan trọng trong việc tạo thành acid nucleic. Hàm lượng của muối KH2PO4 vào khoảng 0,1 - 0,2%. Canxi có trong thành phần của α-Amylase. Một phân tử α-Amylase có tới 2 hoặc 3 ion canxi. Người ta cho rằng tính chịu nhiệt của Enzyme này phụ thuộc số ion canxi có trong phân tử; nhưng cũng có ý kiến cho rằng tính bền nhiệt của Enzyme này còn phụ thuộc vào thành phần acid amin, nhất là hàm lượng của acid glutamic. Lưu huỳnh cũng đóng vai trò quan trọng không kém. Hoạt độ Amylase gắn liền với sự có mặt của nhóm –SH; mặt khác còn tham gia vào thành phần của acid amin cấu tạo thành Enzyme. Hàm lượng lưu huỳnh trong canh trường chứa 0,04g/100ml đảm bảo cho hoạt độ Amylase đạt cực đại và bằng 360 đv/100ml. Nếu giảm tới 0,004% hoạt độ Amylase của Asp.orysee chỉ còn 50% và bằng 180 đv/100ml. Hoạt độ của một số chủng nuôi trên môi trường cám lúa mì theo phương pháp bề mặt Chủng Vi sinh vật Hoạt độ dv/g chất khôHoạt độ Amylase Hoạt độ D Hoạt độ Glu Hoạt độ Pr Asp.oryae KC 70.0 450.0 30.0 50.0 Asp.oryae U476 85.0 665.0 80.0 40.0 Asp.niger S4-10-111 0.65 437.0 70.0 0.5 Asp.awamori 14.5 850.0 30.0 0 - 30 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 c) Điều kiện nuôi cấy Chủng giống và môi trường nuôi cấy là tiền đề quan trọng, bên cạnh đó ta còn phải chú ý đến những điều kiện tối ưu cho nấm mốc phát triển và tích tụ Enzyme. Bao gồm: • Nhiệt độ Cần phải có trang bị phù hợp để duy trì và ổn định nhiệt độ canh trường. Bằng cách quạt không khí lạnh và ẩm vào canh trường. Nếu nuôi cấy trong môi trường lỏng thì cần làm lạnh đồng thời kết hợp với sục khí. Nhiệt độ không khí trước khi đưa vào phòng nuôi phải vào khoảng 22 – 250C, còn độ ẩm tương đối của không khí là 98 - 100%. • Độ ẩm canh trường Trong điều kiện vô trùng ở phòng thí nghiệm, độ ẩm tối ưu để nấm mốc phát triển nằm trong giới hạn 65 - 70%. Trong thực tế sản xuất, mức độ vô trùng không thể đạt được như trong phòng thí nghiệm nên người ta thường nuôi cấy trong canh trường có độ ẩm thấp hơn, nhằm hạn chế sự phát triển của tạp khuẩn.Tùy theo điều kiện trang thiết bị ở mỗi nơi mà độ ẩm có thể khống chế ở 50 - 60%. Độ ẩm canh trường thấp thì hạn chế được sự phát triển của tạp khuẩn, nhưng nấm mốc cũng phát triển chậm dẫn đến tích tụ Enzyme ít và phải kéo dài thời gian. Do đó vấn đề cần đặt ra là phải bằng mọi biện pháp thực hiện tốt công việc vệ sinh. Muốn vậy trước hết phải tiệt trùng môi trường ở áp suất và thời gian thích hợp nhằm tiêu diệt các tế bào và bào tử vi sinh vật có sẵn trong nguyên liệu dùng làm môi trường. Do trong quá trình sinh trưởng và phát triển nấm mốc thải ra một lượng nhiệt khá lớn nên canh trường bị nóng và làm giảm độ ẩm. Đổ nước lạnh xuống nền và phun nước quanh tường sẽ góp phần giảm nhiệt và giúp cho canh trường đỡ bị khô. • pH môi trường Khi nuôi cấy theo phương pháp bề mặt trên canh trường rắn, pH ít ảnh hưởng tới sinh trưởng và phát triển của nấm mốc, thường áp dụng pH tự nhiên của môi trường vào khoảng 5,5 - 6,0. pH thấp thì hạn chế được sự phát triển của tạp khuẩn nhưng sẽ ảnh hưởng tới tích tụ Enzyme. Khi nuôi cấy trong môi trường lỏng: pH ban đầu thường vào khoảng 6 - 7. Đối với Asp.orysee sau 3 ngày nuôi cấy pH giảm còn 5,5 - 6,0. Ngược lại khi nuôi Asp.awamori để nhận glucoamylase, sau 52 giờ pH tăng tới 7,6 - 7,8. Thực tế pH có ảnh hưởng nhiều tới tích tụ Enzyme, vì thế trong sản xuất người ta sử dụng acid hoặc amoniac để điều chỉnh, giữ cho pH luôn trong giới hạn tối ưu. - 31 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 • Cung cấp oxy Trong quá trình phát triển và tích tụ Enzyme, nấm mốc rất cần oxy. Trong sản xuất sinh học, sự phát triển của tế bào và tích tụ Enzyme có liên quan mật thiết tới sự có mặt của oxy. Khi nuôi cấy theo phương pháp bề mặt, nấm mốc dễ dàng tiếp xúc với oxy của không khí qua sợi nấm và mixen. Vì thế canh trường phải xốp, giúp cho nấm mốc tạo nhiều sợi và tích tụ Enzyme. Nếu môi trường dính bết, không khí ít tiếp xúc thì sẽ xảy ra hô hấp yếm khí, ảnh hưởng xấu đến tích tụ Enzyme. Vì vậy ở mỗi giai đoạn của sự phát triển, tùy vào lượng oxy cần cho quá trình trao đổi chất và lượng nhiệt nấm mốc tỏa ra mà điều chỉnh lượng không khí vào phòng nuôi cho thích hợp. Yêu cầu về lượng không khí và cung cấp oxy trong môi trường lỏng có những khác biệt. Yêu cầu đặt ra là phải làm sao để oxy của không khí hòa tan vào canh trường càng nhiều càng tốt. Trong canh trường lỏng tế bào nấm mốc phân tán trong dịch thể, sự tiếp xúc của chúng với oxy phải thông qua canh trường – khuấy và sục khí là biện pháp tốt để oxy có thể hòa tan vào dung dịch. Lượng oxy hòa tan trong canh trường phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố: nhiệt độ, áp suất, công nghệ sục khí cũng như hàm lượng và tính chất của các chất hòa tan trong dung dịch. C. Ứng dụng Enzyme Amylase Amylase là nhóm Enzyme được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như: công nghệ sản xuất rượu bia, công nghệ thực phẩm…đặc biệt là trong lĩnh vực sản xuất bia. Trong lĩnh vực sản xuất bia Amylase được sử dụng để đường hóa tinh bột thành maltose, glucose dùng làm cơ chất cho quá trình lên men bia. + Trong công nghiệp sản xuất rượu bia (giai đoạn đường hoá tinh bột ) + Trong công nghiệp sản xuất tương , mạch nha , mật, đường glucose …. + Từ tinh bột có thể làm cơm rượu làm thức ăn cho gia súc rất giàu chất dinh dưỡng + Amylase còn được ứng dụng trong sản xuất làm bánh mì , làm cho bánh nở xốp thơm ngon hơn . + Trong công nghiệp dệt chế phẩm Enzyme Amylase còn dùng để rũ hồ vải là tẩy lớp hồ bột trên mặt vải. Làm cho vải mềm mịn , dễ tẩy trắng dễ bắt màu khi nhuộm . + Trong công nghiệp chế biến dược phẩm - 32 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 + Trong công nghiệp sản xuất bột ngọt I. Ứng dụng trong sản xuất Bia Bia là loại đồ uống có độ cồn thấp, giàu dinh dưỡng. Ngoài việc cung cấp một lượng calori khá lớn, trong bia còn chứa một hệ Enzyme khá phong phú, đặc biệt là nhóm Enzyme kích thích tiêu hóa Nguyên liệu sử dụng : Ngũ cốc , hoa Houblon, nước , Nấm men, chất phụ gia Các chủng vi sinh vật sử dụng: + Saccharomyces cerevisisae ( Lên men nổi) + Saccharomyces cerevisidae (Lên men chìm) Tinh bột là thành phần chiếm vị trí số một của hạt đại mạch cả về số lượng lẫn vai trò của nó trong sản xuất bia. Trong công nghệ sản xuất bia, người ta thường sử dụng Enzyme Amylase có trong mầm đại mạch. Ngoài ra, còn sử dụng các Enzyme khác có trong mầm đại mạch để thủy phân và chuyển hoá các chất không tan sang trạng thái tan như chuyển protein, cellulose… sang amino acid và glucose . Các quá trình công nghệ này đã được thực hiện ở nhiều nước trên thế giới. So với các loại Enzyme Amylase từ các nguồn khác, Amylase từ thóc đại mạch đã được nảy mầm được sử dụng với số lượng nhiều nhất hiện nay. Quá trình hạt đại mạch nảy mầm là quá trình sinh tổng hợp Enzyme Amylase và nhiều Enzyme khác Nhờ sự tổng hợp ra những Enzyme này, hạt tiến hành quá trình tự phân hủy tinh bột, protein và các hợp chất khác để cung cấp nguyên liệu và năng lượng cho hạt nảy mầm Enzyme Amylase tác động vào giai đoạn đường hóa: Biến đổi tinh bột đã qua giai đoạn dịch hóa thành Dextrin và Maltose tác động tạo Dextrin hóa, β - Amylase tác động tạo mantose. α -Amylase Tinh bột Dextrin + maltose + glucose Thủy phân α -1,4 của amylose β -Amylase Tinh bột Maltose + β - Dextrin (Glucogen) - 33 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 Trong gian đoạn lên men tiếp theo, các chất đường, dextrin có phân tử thấp sẽ được chuyển hóa thành rượu etylic, CO2 và một số sản phẩm phụ khác tạo thành bia theo yêu cầu kỹ thuật và chất lượng sản phẩm. 1. Đường hóa nguyên liệu: a. Chuẩn bị nguyên liệu: Malt là nguyên liệu chính cung cấp tinh bột và Amylase cho đường hóa. Malt: là tên gọi ngũ cốc nảy mầm ( Đại mạch, tiểu mạch, thóc gạo, lúa mì đen, thóc nếp…). Trong sản xuất bia, người ta dùng chủ yếu là đại mạch nảy mầm. Hạt đại mạch là nguồn cung cấp nguyên liệu cho đường hóa , tạo đường cho sự lên men về sau . Trong quá trình nảy mầm của hạt sẽ tích tụ được nhiều men mới, tăng hoạt tính hàng loạt men và Amylase tăng hoạt tính đáng kể, cần thiết cho quá trình đường hóa. Hoạt lực của α-Amylase có thể ghi nhận được vào những thời điểm đầu tiên của quá trình ươm mầm, còn đến ngày thứ ba hoặc ngày thứ tư thì hoạt lực của chúng sẽ tăng một cách đáng kể. Thời gian để α-Amylase đạt được hoạt lực cực đại phụ thuộc vào nhiệt độ ươm mầm. Ví dụ ở nhiệt độ 12 – 140C hoạt lực đạt cực đại sau 11 – 12 ngày đêm, nếu ở nhiệt độ 18 – 200C hoạt lực đạt cực đại sau 6 – 7 ngày đêm. Còn nếu nhiệt độ 25 – 280C thì chỉ cần sau 4 ngày là Enzyme này đạt được hoạt độ tối đa. Ngoài Amylase hoạt độ của protease, sitase, maltase, phosphatase cũng tăng lên. Quá trình oxy hóa – khử lượng men tạo thành tập trung phần lớn ở gần phôi và nội nhũ. Phần trên nội nhũ chứa 25% lượng men có trong malt. Trong quá trình nảy mầm có một số quá trình sinh hóa xảy ra như sau: Thủy phân một phần tinh bột ( 20 – 25% ) ra đường đơn giản hơn. Đường oligo - polysaccharide có bị phân giải một phần thành monosaccharide và trisaccharide. Lipase thủy phân một phần lipid thành acid béo và glycerine Do việc tạo thành acid hữu cơ và vô cơ nên độ chua của hạt này mầm tăng cao , pH 5,6 – 5,9. b. Đường hóa: Đường hóa là công đoạn sản xuất bia rất quan trọng, trong đó lượng đường được tạo thành sẽ quyết định khả năng lên men và chất lượng bia sau này. Chính vì thế, nhiều nhà máy bia trên thế giới đã cho thêm Enzyme với số lượng lớn trong giai đoạn này. Các Enzyme vào trong giai đoạn này là những Enzyme vi khuẩn chịu nhiệt. Biến đổi sinh hóa của quá trình đường hóa là thủy phân tinh bột thành dextrin và đường đơn giản (maltose, glucose…) dễ tan và lên men dưới tác dụng của Amylase trong malt, ở nhiệt độ và pH tối ưu . - 34 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 Có quá trình thủy phân protid – peptid , peptone, acid amin hòa tan được trong dung dịch nhờ Enzyme protease, peptidase có trong malt. Cellulose, peptin cũng bị thủy phân, tạo thành sản phẩm hòa tan được trong dung dịch, tamin bị oxy hóa tạo ra Flobafel tạo thêm màu cho bia Malt xay nhỏ trộn với nước thành dịch hồ, nâng nhiệt độ lên 60 – 700C giữ trong 30 đến 40 phút, sau đó nâng lên nhiệt độ 750C và giữ ở nhiệt độ này cho đến khi đường hóa xong (PH 4,6 - 5,8 ) Hiện nay có nhiều phương pháp đường hóa, nâng nhiệt độ nhiều đợt 2 - 3 lần hoặc nâng nhiều đợt từng phần riêng rồi pha trộn lẫn nhau Với nguyên liệu fi-malt giàu bột (ngũ cốc) trước khi đường hóa và trộn malt cần xay nhỏ trộn nước nấu sơ bột thành hồ hoặc cháo loãng, dung dịch đường hóa gọi là dịch đường maltose, lọc xong ta có nước “mout”. Nước “mout” được đun sôi với hoa houblon ( 18 -26g/10 lít bia ở Việt Nam) . Trong nước “mout”, sau khi đường hóa có chứa 90% là các chất Carbohydrate, trong số này có đến 75% đường có khả năng lên men. Phần còn lại 25% là các loại dextrin mạch thẳng và mạch nhánh. Trong nhiều trường hợp, lượng đường tạo thành không đạt được mức độ trên do nhiều nguyên nhân. Trong đó nguyên nhân chính là chất lượng malt kém. Có ba cách để làm tăng lượng đường trong nước “mout”: + Kéo dài thời gian đường hóa + Sử dụng thêm đường + Sử dụng Enzyme để đường hóa hết lượng tinh bột Trước đây người ta thường áp dụng hai cách trên. Sau này, việc sử dụng Enzyme thường được sử dụng hơn. Người ta thường sử dụng các loại chế phẩm Enzyme sau: Các loại Enzyme thủy phân tinh bột sử dụng trong sản xuất bia Loại Enzyme và vi sinh sản xuất Điều kiện sử dụng Kiểu tác động và sản phẩm tạo rapH 0C Amylase vi khuẩn a) B.subtillis b) B.licheniformis 6,5 6,5 85 105/95 Endo, nối α-1,4 Dextrin α-Amylase nấm mốc Asp.orysee 5,0 55 Endo, nối α-1,4 Maltoz Amylglucosidase Asp.niger 4,3 6,0 Exo, nối α-1,4; α-1,6 Glucoz Pullulnase 4,3 60 Endo, nối α-1,6 - 35 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 Loài Bacillus Dextrin Glucose isomerase B.coaglucanz 8,0 60 Endo, nối α-1,4 Glucoz + Fructoz Các loại Enzyme khi cho thêm vào trong sản xuất bia thường nhằm vào những mục đích sau: + Nâng cao chất lượng dịch đường hóa + Nâng cao khả năng lên men bia + Nâng cao chất lượng và ổn định chất lượng bia. + Giảm giá thành sản phẩm khi tiến hành thay malt bằng những nguyên liệu phi malt. Những ưu điểm của Enzyme từ nguồn VSV được sử dụng trong sản xuất bia như sau: + Các chế phẩm Enzyme từ VSV thường có hoạt tính xúc tác rất mạnh và chứa khá đầy đủ các loại Enzyme cần thiết cho sự chuyển hóa tinh bột thành các loại đường, đặc biệt là tạo ra được loại đường có khả năng lên men với số lượng lớn. + Các chế phẩm Enzyme từ VSV thường có khả năng hoạt động ở nhiệt độ rất cao. Điều này rất thuận lợi cho việc vận hành quá trình dịch hóa và đường hóa. 2. Lên men bia Là giai đoạn quan trọng quyết định cho chất lượng bia và hiệu suất sản xuất. Cơ sở sinh hóa ( Saccharomyces cerevisiae ) C 6H 12O 6 C 2H 5OH + CO2 Quá trình tạo acid hữu cơ và tạo rượu cao tác dụng với nhau tạo ra ester ảnh hưởng đến mùi vị bia.Trong quá trình lên men PH giảm dần , lúc đầu dịch lên men 5,3 -5,6 sau lên men chính còn 4,2 – 4,4. Quá trình sinh lý đặc trưng trong giai đoạn đầu thời kỳ lên men là sinh trưởng , tăng sinh khối. II. Ứng dụng trong sản xuất bánh mì: Các chế phẩm Enzyme tinh khiết được dùng để tăng cường và điều chỉnh công nghệ của nhiều loại sản phẩm trong đó có sản xuất bánh mì. Nguồn Enzyme thường sử dụng là malt. Tuy nhiên trong những năm gần đây, nguồn nguyên liệu malt dần dần được thay thế bằng nguồn nguyên liệu từ nấm sợi, trong đó có Amylase làm tăng chất lượng bánh mì. Chế phẩm Enzyme từ nấm sợi chủ yếu thu nhận từ Asp.orysee có pH tối ưu là 4,5 – 5,5. - 36 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 Trong công nghiệp sản xuất bánh mì Enzyme Amylase có tác dụng làm giảm độ dính, tăng độ đàn hồi của bột nhào, tăng mùi thơm, tăng nhanh thể tích bánh và rút ngắn thời gian nhào α-Amylase của nấm sơi, chịu acid hơn và nhạy cảm với nhiệt độ hơn là α-Amylase của hạt và của vi khuẩn. Sự tác động tương hỗ khả năng chuyển hóa của Enzyme cho vào trong quá trình chế biến và sự hoạt động của nấm men sẽ làm tăng nhanh chất lượng bánh và đảm bảo được những mục đích trên. Nhiệt độ thích hợp đối với tác dụng của α-Amylase nấm sợi là 500C và bị ức chế ở nhiệt độ 65 - 680C. Do hoàn toàn bị ức chế ở các giai đoạn khác nhau của quá trình nướng nên α-Amylase nấm mốc không kịp phát huy tác dụng dextrin hóa tinh bột và vì vậy không làm giảm chất lượng ruột bánh. Đồng thời α-Amylase nấm sợi lại có tác dụng đường hóa và tạo khí mạnh nên rút ngắn được quá trình chuẩn bị bột nhào và làm chất lượng bánh được tốt hơn. Khi ta sử dụng chế phẩm Enzyme từ nấm sợi Asp.orysee hay Asp.awamori, lượng đường khử và các amino acid tự do tăng lên. Đây chính là nguyên nhân chính dẫn tới sự tạo thành màu và mùi trong sản xuất bánh mì. Ý nghĩa quan trọng của việc sử dụng chế phẩm Enzyme trong sản xuất bánh mì là khi ta sử dụng Enzyme, nhờ hoạt động của nó mà lượng đường được tạo thành từ từ, không tập trung quá nhiều ở giai đoạn đầu hoặc ở giai đoạn cuối của quá trình nhào bột. Chính vì thế, Enzyme như một chất điều hòa rất có hiệu quả cho quá trình lên men, tạo CO2 trong suốt quá trình kỹ thuật. Như vậy, ở một góc độ nào đó ta sử dụng Enzyme trong sản xuất bánh mì như một yếu tố điều khiển kỹ thuật cho quá trình sản xuất này. Dextrinase và maltose của nấm sợi có tác dụng hỗ trợ cho α-Amylase. Dextrinase thủy phân các dextrin cuối cùng cho đến maltose. So với β-Amylase thì dextrinase tạo thành đường nhiều hơn. Maltose thủy phân dextrin và maltose đến glucose. Hoạt độ của Enzyme được đặc trưng bằng lượng đối chất bị thủy phân ứng với 1 gram chế phẩm Enzyme trong 1 đơn vị thời gian. III. Ứng dụng trong sản xuất Siro: Enzyme Amylase được ứng dụng trong giai đoạn thủy phân tinh bột của quy trình sản xuất siro. Trong phương pháp thủy phân bằng acid và Enzyme. Enzyme Amylase là Enzyme quan trọng để chuyển hóa tinh bột  đường. Enzyme α-Amylase tạo maltose từ Asp.orysee. Enzyme β-Amylase tạo maltose từ malt đại mạch. - 37 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 Quá trình đường hóa xảy ra ở pH 4,8 - 5,2, nhiệt độ 55 - 600C, thời gian phản ứng đến 2 ngày. 1. Siro maltose: Siro maltose được sản xuất chủ yếu bằng phương pháp Enzyme sử dụng duy nhất Enzyme Amylase tạo maltose. Trong quy trình đặc trưng, dung dịch cơ chất 35 - 45% chất khô DE 10-20 được đường hóa bằng Enzyme tạo maltose. Trong trường hợp này pH = 5, nhiệt độ 50 - 550C, trong 24 - 48h. Nồng độ maltose trong sản phẩm thu được khoảng 40 - 60%. Lượng cao hơn 80% maltose có thể thu được nhờ sử dụng Enzyme thủy phân liên kết nhánh trong quá trình đường hóa để thủy phân các liên kết α-1,6 tạo thêm đoạn mạch thẳng làm cơ chất cho Amylase tạo maltose. 2. San̉ xuất siro giàu fructose HFS: Hiện nay, các nước châu Âu và châu Mỹ sản xuất siro đường fructose từ bột bắp bằng phương pháp Enzyme phát triển rất mạnh. Theo phương pháp này, phôi bắp được xử lý bằng SO2 và vi khuẩn lactic để hạt tinh bột mềm ra khỏi khối bột bằng ly tâm. Enzyme chỉ được sử dụng sau khi bột đã hòa vào nước. Đặc tính Enzyme từ các nguồn VSV khác nhau Stt Enzyme Nguồn Enzyme Khoả ng pH Khoảng nhiệt độ pH, nhiệt độ phổ biến Chất hoạt hóa Chức năng 1 α- Amylase nấm sợi Asp.niger Asp.orysee Asp.awamori 4-6 50-70 4,5-6,5 Thủy phân hạn chế tinh bột 2 α- Amylase vi khuẩn ưa ẩm Bac.subtilis Bac.amylo liquefaciens 6-7 40-80 6-7,5 Ca2+ Thủy phân hạn chế tinh bột 3 α- Amylase vi khuẩn ưa nhiệt Bac.licheniformis Bac.stearothermo -philus 5,5-6,5 4,5-6,5 90-120 5,8 ; 100 6 ; 115 Ca2+ Thủy phân tinh bột ở t0 cao 4 β- Amylase Bac.polymyxa 4,7 55-75 5 ; 60 Tao siro co DE thấp 5 Pullulase Bacillus sp 3,5-4,5 55-65 4 ; 60 Ca2+ Phân cắt - 38 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 mạch nhánh 6 Amyloglu co-sidase Asp.niger 3-4,5 55-65 4 ; 60 Đường hóa, phân cắt lk 1,4 glucoside HFS được sản xuất quy mô lớn từ những năm 1970 sử dụng α-Amylase bền nhiệt của hãng Novo trong quá trình dịch hóa và glucose-isomerase cố định để chuyển hóa glucose thành fructose. Glucose-isomerase được cố định và được tạo thành các hạt có kích thước trong khoảng 0,3 - 1,0 mm. Enzyme cố định được nhồi vào các cột có chiều cao khoảng 6m, đường kính 1,5m và tiếp xúc với dung dịch glucose DE 93 - 96 có nồng độ chất khô 40 - 60%. Trong quá trình phản ứng E cố định mất dần hoạt tính, cột phản ứng thông thường phải thay bằng Enzyme mới khi glucose-isomerase bị mất đi khoảng 12,5% hoạt tính. Cột thủy phân bền vững nhất trong thực tế có thể sử dụng trong 200 ngày. 3. Siro chứa đường oligo khác: Sản phẩm siro chứa 50 - 72% maltotetrose được sản xuất bằng quá trình thủy phân liên tục sử dụng hệ Enzyme Amylase tạo DP4 cố định từ Pseudomonas stutzeri 4. San̉ xuất siro và đường tinh thể: • Quá trình đường hóa: Trong quá trình thủy phân bằng Enzyme, dịch sau khi dịch hóa có nồng độ chất khô 30 - 35%, pH 4 - 4,5 nhiệt độ 600C được cho phản ứng với Glucoamylase. Quá trình đường hóa được tiến hành gián đoạn hoặc liên tục trong các thùng phản ứng lớn dung tích từ 200 ngàn tới vài triệu lit ở quy mô công nghiệp. Tùy thuộc vào nồng độ Enzyme sử dụng mà thời gian phản ứng có thể kéo dài từ 1 - 4 ngày. Cho tới khi đạt được nồng độ glucose cao nhất. Nồng độ glucoamylase ảnh hưởng trực tiếp tới thời gian phản ứng, tăng gấp đôi nồng đô ̣ Enzyme sẽ giảm một nửa thời gian đạt đến lượng glucose cao nhất. Nồng độ cơ chất thấp lượng maltose và isomaltose sinh ra sẽ giảm dẫn đến hiệu suất thu glucose sẽ tăng, theo nhiều nghiên cứu của Hebecta (1993) : hiệu suất thu glucose đạt 98,8 ; 98,2 ; 97,5 ; 96,9% khi nồng độ chất khô của cơ chất ban đầu tương ứng là 10, 15, 20, 25%, tuy nhiên nồng độ cơ chất thấp lại dễ gây nhiễm khuẩn và tăng chi phí cô đặc sản phẩm. Maltulose: 1-0-α-D-gluconopyranosyl-D-fructose được tạo ra trong dung dịch thủy phân ở giá trị pH cao trong quá trình dịch hóa gốc glucose cuối cùng, một đoạn Oligo bị chuyển thành fructose do phản ứng isomer hóa, sự có mặt của fructose ngăn chặn sự thủy - 39 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 phân liên kết α-1,4 của glucoamylase trong giai đoạn đường hóa và tạo ra maltulose trong sản phẩm sau thủy phân. Để tránh hiện tượng này, pH của quá trình dịch hóa cần được giữ ở giá trị 6,0 hoặc thấp hơn. Ở pH cao maltulose có thể tạo ra gây giảm hiệu suất thu glucose, các đường oligo DP3 và cao hơn còn lại trong dung dịch sau thủy phân thường phân nhánh và vì thế khó bị thủy phân tiếp tục bởi glucoamylase. Hiệu suất glucose có thể được nâng cao nhờ sử dụng pullulanase từ β-megaterium trong giai đoạn đường hóa. Sử dụng Enzyme có 2 ưu điểm sau: các oligo mạch nhánh có thể bị thủy phân nhanh hơn, lượng glucose Amylase cần ít hơn dẫn tới giảm các phản ứng ngược tạo ra isomaltose nhờ vậy lượng glucose tăng lên khoảng 0,5 - 1,5%. Amylase từ Bacillus.megaterium (tên thương mại là megatex) cũng thủy phân các đường oligo mạch nhánh thành Panosyl sau đó chuyển thành glucose để tạo ra DP4 mạch thẳng, đường oligo này dễ dàng bị thủy phân bởi glucoamylase thành glucose. Kết quả thời gian phản ứng và nồng độ glucoamylase sử dụng giảm, lượng isomaltose và các oligo mạch dài tạo ra ít hơn, lượng glucose tăng 1,0%, pH phản ứng khi sử dụng glucoamylase kết hợp với pullulanase và Amylase từ B.megaterium tương ứng là 4,5 - 4,8 và 5,0 - 5,2. • Quá trình thủy phân liên tục: Enzyme sử dụng là amyloglucosidase, từ Asp.niger, ở 550C và pH 4,5 với nồng đô ̣ 0,5% thể tích cao hơn 15 lần so với nồng độ Enzyme sử dụng trong thiết bị gián đoạn với thời gian thủy phân khoảng 40 - 70h. Với thời gian phản ứng trên màng là 1h, hằng số KM là 562g/l, cao hơn 2 - 7 lần so với KM gián đoạn. IV. Ứng dụng trong sản xuất Cồn: Nguyên liệu chủ yếu mà các nhà máy rượu nước ta thường dùng là sắn, sau đó là ngô và một phần gạo hoặc tấm. Đối với sản xuất rượu thì thành phần quan trọng nhất là gluxit lên men được, gồm tinh bột và một số đường. Trong đa số gluxit nói chung thì tỷ lệ giữa H và O đều tương tự như trong nước. Ví dụ ramnose – C6H12O5. * Vai trò của α-Amylase và β -Amylase trong sản xuất cồn từ hydro carbon: - Trước đây người ta dùng Enzyme Amylase của malt, nhưng ngày nay đã thay thế bằng Enzyme Amylase của nấm sợi. - Trong sản xuất cồn từ nguyên liệu chứa tinh bột, Enzyme Amylase được sử dụng ở các giai đoạn đường hóa: + Chuyển hóa tinh bột bằng α-Amylase để tạo thành dextrin. - 40 – Đường hóa Làm nguội Nấu chín ở nhiệt độ cao Nguyên liệu chứa tinh bột Amyloglucosidase hoạt động ở 550C Amylase hoạt động ở 550C Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 + Chuyển hóa dextrin bằng β -Amylase hay amyloglucosidase để tạo ra đường có khả năng lên men. Sơ đồ Quá trình chuyển hóa tinh bột + Quá trình đường hóa đóng vai trò quyết định đến khả năng lên men và hiệu suất cồn thu được. Các chế phẩm Enzyme được sử dụng trong sản xuất cồn bao gồm những chế phẩm thô được thu nhận từ phương pháp nuôi cấy bề mặt, nuôi chìm hoặc các chế phẩm đậm đặc, tinh khiết. Chủ yếu là sử dụng chế phẩm dạng thô vì tính chất kinh tế. + Vì sử dụng chế phẩm dạng thô, do đó để tránh các phản ứng không mong muốn trong quá trình đường hóa, trước khi đường hóa phải xác định họat tính Enzyme của từng lọai Enzyme từ đó điều chỉnh họat động cuả chúng. + Trong giai đoạn dịch hóa Enzyme α-Amylase tham gia thực hiện các phản ứng sinh hóa cần thiết và quyết định đến hiệu suất sản xuất cồn. Trong khi đó cũng trong giai đọan này Enzyme β -Amylase lại tạo ra các sản phẩm không mong muốn, làm cản trở quá trình lên men. + Trong giai đoạn đường hóa dịch đường, Enzyme α-Amylase tham gia thực hiện các phản ứng sinh hóa cần thiết và quyết định đến hiệu suất sản xuất cồn. Còn Enzyme β - Amylase tham gia những biến đổi cơ bản cơ chất để tăng cường quá trình chuyển hóa cơ bản. + Khi thủy phân tinh bột, Enzyme α-Amylase tác động vào liên kết α-1,4 glucoside và sản phẩm tạo ra là mantose và dextrin mà mạch của chúng gần bằng C6. Các dextrin sau đó sẽ phân hủy chủ yếu theo o C6 C5 + C1. o C7 C6 + C1 hay C5 + C2. o C8 C6 + C2 hay C5 + C3. + Enzyme α-Amylase của vi khuẩn thủy phân tinh bột tạo ra lượng glucose và maltose theo tỷ lệ 1 : 5,45. Enzyme α-Amylase của nấm sợi thủy phân tinh bột tạo ra lượng glucose - 41 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 và maltose theo tỷ lệ 1 : 3,79. Enzyme α-Amylase của vi khuẩn và nấm sợi đều không có khả năng phân giải α-1,6 glucoside của cơ chất. Như vậy, vai trò cơ bản của α-Amylase trong sản xuất rượu, cồn là làm dịch hóa nhanh ở giai đoạn nấu và cả ở giai đoạn đầu của sự đường hóa, dextrin hóa và tích tụ đường. * Vai trò của glucoamylase: Glucoamylase thủy phân liên kết α-1,4 glucoside trong các polysaccharide, chúng liên tiếp phân cắt các gốc glucose không khử trong mạch polysaccharide. Ngoài ra glucoamylase còn có khả năng phân cắt liên kết α-1,6 glucoside. Sản phẩm cuối cùng tạo thành là glucose. V. Ứng dụng trong sản xuất Bánh kẹo Mục đích của việc sử dụng Enzyme vào sản xuất các loại bánh quy là làm tăng mùi và vị bánh, khi chế biến bột thành các loại bánh quy các Enzyme protease và Amylase của bột hoạt động làm tăng hàm lượng các amino acid tự do và làm tăng lượng đường khử. Đường khử và các amino acid tự do có trong khối bột sẽ cùng tham gia vào các phản ứng oxy hóa khử và kết quả tạo cho bánh quy có mùi, vị màu hấp dẫn. Tuy nhiên nếu chỉ tận dụng lượng Enzyme có sẵn trong tinh bột thì phản ứng trên xảy ra không mạnh, nhất là khi sử dụng lọai bột xấu để sản xuất bánh. Do đó người ta thường bổ sung thêm Enzyme protease và Amylase vào chế biến bột trong quá trình sản xuất bánh quy. Khi đó lượng đường khử và lượng amino acid tự do sẽ tăng lên, phản ứng oxi hóa khử cũng được tăng cường. VI. Ứng dụng trong sản xuất glucose và Mật: Chúng ta đã biết từ tinh bột có thể thu được các phẩm vật đường khác nhau khi thủy phân tinh bột bằng acid cũng như bằng Enzyme Amylase sẽ thu được mật. Mật glucose hay mật maltose thường được dùng trong sản xuất bánh kẹo và trong sản xuất các sản phẩm cho trẻ em và người bệnh. Hiện nay nhiều nước như: Nhật, Mỹ.… đã sản xuất glucose đi từ tinh bột bằng Enzyme glucoamylase, nhưng trong các chế phẩm Enzyme glucoamylase luôn luôn chứa cả glucozyltransferase do đó sẽ làm giảm tính chất của glucose, làm cho glucose khó kết tinh và ảnh hưởng xấu đến chất lượng thực phẩm. Vì vậy tốt hơn hết là nên chọn những chủng nấm mốc không tạo ra glucozyltransferase (ta có thể hấp phụ nó bằng đất sét chua hoặc bằng cách khử họat tính của nó bằng acid hoặc kiềm) - 42 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 Glucoamylase bền trong một khoảng pH rộng, những nấm mốc chứa nhiều glucoamilase như Asp.warner, Rhizopus, đặc biệt là Rhizopus ở Nhật đã sản xuất chế phẩm glucoamylase từ canh trường bề mặt của nấm mốc này. VII. Ứng dụng trong chế biến thức ăn gia súc: Trong chế biến thức ăn gia súc, thành phần ngũ cốc chiếm một khối lượng rất lớn. Trong khối lượng này, thành phần tinh bột rất cao. Ðể tăng hiệu suất sử dụng năng lượng từ nguồn tinh bột, người ta thường cho thêm Enzyme Amylase vào. Enzyme Amylase sẽ tham gia phân giải tinh bột tạo thành đường, giúp cho quá trình chuyển hóa tinh bột tốt hơn. VIII. Ứng dụng trong công nghiệp dệt: Trong công nghiệp dệt, người ta thường sử dụng Enzyme Amylase của vi khuẩn để tẩy tinh bột và làm cho vải mềm. Trong vải thô thường chứa khỏang 5% tinh bột và các tạp chất khác. Do đó, khi sử dụng chế phẩm Enzyme Amylase của vi khuẩn vải sẽ tốt hơn. Người ta thường sử dụng lượng chế phẩm Amylase khỏang 0,3 - 0,6 g/l dung dịch và thời gian xử lý 5 - 15 phút ở nhiệt độ 900C. Tuy nhiên ngoài chế phẩm Enzyme Amylase có nguồn gốc từ vi khuẩn, hiện nay người ta đã quan tâm đến việc sử dụng Amylase từ nấm sợi. Cho đến nay có rất nhiều nước đã sử dụng Enzyme trong công nghiệp dệt để tăng khả năng cạnh tranh các hàng vải, sợi. Các nước sử dụng lượng Enzyme Amylase nhiều nhất trong lĩnh vực này là Mỹ, Nhật, Pháp, Ðan Mạch. Một số loại Enzyme Amylase được sử dụng trong công nghiệp dệt Stt Loại Enzyme Khoảng pH hoạt động Nhiệt độ tối ưu Chất hoạt hóa, chất làm ổn định 1 α-Amylase của malt 4,5 – 5,5 55- 65 Ca2+ 2 Amylase pancreatin 6,7 – 7,5 45 – 50 NaCl, Ca2+ 3 α-Amylase nấm sợi 4,5 – 5,5 55 – 65 Ca2+ 4 α-Amylase vi khuẩn 5,5 – 7,5 75 – 85 NaCl, Ca2+ 5 α-Amylase vi khuẩn chịu nhiệt 5,0 – 7,0 90 - 105 NaCl, Ca2+ - 43 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 Tài Liệu Tham Khảo 1. Công nghệ Enzyme – Nguyễn Đức Lượng . Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia Tp.HCM – 2008 2. Công nghệ vi sinh-Tập 2: Vi sinh vật Công Nghiệp – Nguyễn Đức Lượng. Nhà xuất bản Đại Học Quốc Gia Tp.HCM – 2008 3. Công nghệ lên men ứng dụng trong Công Nghệ Thực Phẩm – Bùi Ái. Nhà xuất bản Đại Học Quốc Gia Tp.HCM – 2008 4. Động lực các quá trình xúc tác sinh học – Trần Đình Toại, Nguyễn Thị Văn Hân. Nhà xuất bản Khoa Học – Kỹ Thuật – 2005 5. Tinh bột sắn và các sản phẩm từ tinh bột sắn – Hoàng Kim Anh, Ngô Kế Sương, Nguyễn Xích Liên. Nhà xuất bản Khoa Học – Kỹ Thuật – 2005 6. Công nghệ sản xuất Malt và Bia – Hoàng Đình Hoài. Nhà xuất bản Khoa Học – Kỹ Thuật – 2005 7. Công nghệ sản xuất kiểm tra cồn etylen – Nguyễn Đìng Thương. Nhà xuất bản Khoa Học – Kỹ Thuật – 2005 - 44 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 8. Hóa học Thực Phẩm – Hoàng Kim Anh. Nhà xuất bản Khoa Học – Kỹ Thuật – 2007 9. Hóa sinh học - Phạm Thị Trân Châu, Trần Thị Áng. Nhà xuất bản Giáo dục Việt Nam. 10. Enzyme và xúc tác sinh học – Nguyễn Hữu Chấn. Nhà xuất bản Y học – 1983 11. 12. 13. 14. 15. - 45 –