Tiểu luận Môn công nghệ lên men

MỤC LỤC 1. GIỚI THIỆU VỀ SCLEROGLUCAN ............................................................................... 3 1.1. Cấu trúc hóa học ........................................................................................................ 3 1.2. Tính chất của scleroglucan......................................................................................... 3 2. NGUYÊN LIỆU VÀ CON GIỐNG .................................................................................. 5 2.1. Mật rĩ .......................................................................................................................... 5 2.2. Nước ........................................................................................................................... 7 2.3. Phụ liệu: ..................................................................................................................... 9 2.3.1. Acid citric........................................................................................................... 9 2.3.2. Acid sulfuric H2SO4 ........................................................................................... 9 2.3.3. NaOH ................................................................................................................. 9 2.3.4. Ammonium sulfate (NH4)2SO4 .......................................................................... 9 2.3.5. Potassium chloride KCl ..................................................................................... 9 2.3.6. Ferrous sulfate FeSO4.7H2O ............................................................................ 10 2.3.7. K2HPO4 ............................................................................................................ 10 2.3.8. Sodium nitrate NaNO3 ..................................................................................... 10 2.3.9. Manganese Sulfate MgSO4·7H2O.................................................................... 10 2.3.10. Sucrose ............................................................................................................. 10 2.3.11. Ethanol ............................................................................................................. 11 2.3.12. Dịch chiết malt ................................................................................................. 11 2.3.13. Dịch chiết nấm men ......................................................................................... 11 2.4. Vi sinh vật sử dụng .................................................................................................. 11 3. QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ ........................................................................................... 14 3.1. Quy trình .................................................................................................................. 14 3.2. Giải thích quy trình .................................................................................................. 15 3.2.1. Xử lý mật rĩ ...................................................................................................... 15 3.2.2. Chuẩn bị môi trường ........................................................................................ 16 3.2.3. Nhân giống ....................................................................................................... 17 3.2.4. Lên men ........................................................................................................... 18 3.2.5. Trung hòa, pha loãng, gia nhiệt ....................................................................... 24 3.2.6. Đồng hóa .......................................................................................................... 24 3.2.7. Ly tâm .............................................................................................................. 25 3.2.8. Tinh sạch: ......................................................................................................... 26 3.2.9. Sấy.................................................................................................................... 27 3.2.10. Nghiền .............................................................................................................. 28 4. SẢN PHẨM ..................................................................................................................... 30 5. THÀNH TỰU .................................................................................................................. 31 5.1. Tăng cường sự tổng hợp scleroglucan với Sclerotium rolfsii bằng cách sử dụng tiền chất .................................................................................................................................. 31 5.2. Hoàn lưu sinh khối nấm men kết hợp giới hạn lượng oxy cung cấp để tăng lượng scleroglucan tổng hợp được cũng như giảm lượng oxalic acid hình thành. ........................ 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................................... 33 DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Thành phần hóa học trong rỉ đường mía (có 80% chất khô) ........................................ 5 Bảng 2: Thành phần vitamin chứa trong rỉ đường mía và rỉ đường củ cải (tính theo mg/ 100 g rỉ đường) .................................................................................................................................... 6 Bảng 3: Một số chỉ tiêu mật rĩ ................................................................................................... 6 Bảng 4: Các chỉ tiêu cảm quan và hóa lý của nước ................................................................... 8 Bảng 5: Chỉ tiêu vi sinh của nước uống (quy định số 80/778/EEC) .......................................... 8 Bảng 6: Ảnh hưởng của nồng độ UMP, UDPG và thời gian bổ sung lên luộng scleroglucan và sinh khối tạo thành bởi S.rolfsii ............................................................................................... 32 DANH MỤC HÌNH Hình 1: Cấu trúc phân tử của scleroglucan ................................................................................ 3 Hình 2: Rỉ đường từ mía ............................................................................................................ 5 Hình 3: Hình thái sợi nấm S.rolfsii .......................................................................................... 12 Hình 4: Thiết bị xử lý nhiệt mật rĩ. .......................................................................................... 15 Hình 5: Thiết bị ly tâm làm sạch mật rĩ. .................................................................................. 16 Hình 6: Thiết bị phối trộn ........................................................................................................ 17 Hình 7: Con đường sinh tổng hợp scleroglucan ...................................................................... 19 Hình 8: Quá trình dị hóa glucose và hình thành oxalate. ......................................................... 20 Hình 9: Thiết bị lên men bề sâu. .............................................................................................. 23 Hình 10: Thiết bị đồng hóa bằng cánh khấy ............................................................................ 25 Hình 11: Máy ly tâm lắng nằm ngang. .................................................................................... 26 Hình 12: Thiết bị lọc khung bản .............................................................................................. 27 Hình 13: Thiết bị sấy chân không ............................................................................................ 28 Hình 14: Thiết bị nghiền búa ................................................................................................... 29 Hình 15: Ảnh hưởng tiền chất nồng độ lên lượng sclerglucan và sinh khối tạo thành bởi S.rolfsii ..................................................................................................................................... 31 Tiểu luận môn công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Page 3 1. GIỚI THIỆU VỀ SCLEROGLUCAN Scleroglucan là polymer sinh học, là polysaccharide ngoại bào được nghiên cứu, do giống Sclerotium tiết ra. Tên thương mại là polytran® (Pullsbury Co.), biopolymer CS® (CECA S.E, France)… Scleroglucan được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau, một trong những lĩnh vực đó là thực phẩm. 1.1. Cấu trúc hóa học Scleroglucan là một polysaccharide trung tính mà khi thủy phân hoàn toàn sẽ tạo ra D-glucose. Polymer này là một chuỗi β-D-(1,3)-glucopyranosyl, và cứ mỗi ba phân tử đường có 1 nhánh β-D-(1,6)-glucopyranosyl. Hình 1: Cấu trúc phân tử của scleroglucan Khối lượng phân tử và chiều dài chuỗi polymer phụ thuộc vào canh trường vi sinh vật sử dụng. Thông thường phân tử khối trung bình từ (1,3 ÷ 3,2)x105 tới (0,3 ÷ 6,0)x106Da. 1.2. Tính chất của scleroglucan Tính chất của scleroglucan ảnh hưởng bởi khối lượng phân tử và phương pháp thu nhận. Thêm nữa, tính chất của dung dịch scleroglucan cũng khác nhau tùy thuộc vào mức độ sử dụng. Biopolymer CS-6 chứa 60 ÷ 70% scleroglucan, trong khi CS-11 là sản phẩm đã tinh chế, chứa 85 ÷ 90% polysaccharide. Tính hòa tan: Scleroglucan phân tán trong nước tương đối dễ ở nhiệt độ phòng do sự hiện diện của nhóm β-D-(1,6)-glucopyranosyl và giảm khả năng tạo gel. Scleroglucan được tinh chế tan tốt trong nước nóng và cả nước lạnh để hình thành dung dịch giả dẻo chịu được nhiệt độ cao, khoảng pH rộng và nhiều chất điện giải, trong khi nếu tách sản phẩm thô từ canh trường lên men sẽ có độ nhớt thấp. Sự khuấy trộn, nhiệt độ, pH, và nồng độ ảnh hưởng tới tốc độ hình thành độ nhớt. Độ nhớt của dung dịch chịu rất ít ảnh hưởng bởi sự biến động của nhiệt độ. Trong khoảng nhiệt độ 10 ÷ 90oC, độ nhớt của nó chỉ biến đổi 0,5 ÷ 2%. Độ nhớt của dung dịch scleroglucan không bị ảnh hưởng khi pH = 1 ÷ 11. Trong dung dịch có dimethylsulphoxide, hay dung dịch có pH= 12,5 hoặc cao hơn, hay có nhiệt độ lớn hơn 900C, thì độ nhớt giảm do cấu trúc xoắn bậc 3 bị phá vỡ hình thành các chuỗi xoắn đơn. Scleroglucan hình thành gel bền khi có mặt muối Crom và borax ở pH = 10 ÷ 11, có thể bị kết tủa khi thêm muối ammonium bậc 4 khi trong điều kiện kiềm Khả năng tương thích với các ion: Tiểu luận môn công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Page 4 Scleroglucan hydrate sơ bộ tương thích với chất điện ly như NaCl 5%, Na2SO4 5%, CaCl2 20%, Na2HPO4 10%. Tuy nghiên khi nồng độ các chất điện ly tăng cao, dung dịch có thể gel hóa và kết chùm lại. Scleroglucan có tính tương thích với hầu hết các chất làm đông như alginate, xanthan, dẫn xuất cellulose. Scleroglucan vẫn giữ được tính hòa tan khi dung dịch chứa 50% glycol và polyol, độ nhớt của dung dịch tăng cao chỉ khi nồng độ polyol trên 20%. Tính lưu biến: Giả dẻo là đặc tính quan trọng của dung dịch scleroglucan, tính lưu biến của dung dịch scleroglucan 0,8% không đáng kể, trừ khi nhiệt độ giảm xuống dưới 10oC. Vì tính giả dẻo cao đó mà trạng thái keo của dung dịch được giữ vững. Theo đó, dung dịch 1,2 ÷ 1,5% gum tinh khiết sẽ gel hóa ở khoảng 25oC, nhưng ở dưới 10oC, ngay cả những dung dịch rất loãng từ chất tạo gel có cấu trúc phức tạp sẽ đông kết khi để yên trong một thời gian dài. Cấu trúc gel rối rắm này sẽ nhanh chóng bị phân tán khi khuấy trộn. Tính lơ lửng: Bản thân trong hệ giả dẻo đã có kết hợp khả năng làm lơ lửng những chất tinh khiết với sự chảy dễ dàng của huyền phù. Scleroglucan sạch với 0,1 ÷ 0,2% làm bền huyền phù 5 ÷ 10% những chất tinh khiết như kẽm oxit, kết tủa calci carbonate, và sulphamerazine. Độ nhớt huyền phù kết hợp scleroglucan với bentonite là sự điều phối. Theo đó, độ nhớt biểu kiến của 0,15% gum tinh khiết và 5% bentonite là khoảng 300cps, nhưng khi trộn cả hai cái đó có độ nhớt > 4000. Mặc dù không phải chất tạo nhũ tương bậc một trong các chất hoạt động bề mặt, scleroglucan làm giảm năng lượng phân tán khi hình thành độ bền nhũ tương. Thêm nữa, việc ngăn cản sự đông tụ là cơ sở cho tính bền này. Sinh lý học: Những nghiên cứu khi cho chó và chuột ăn thử trong thời gian dài không cho thấy biểu hiện của việc ngộ độc, máu bất thường, hay những bệnh lý ở các mô. Những kiểm tra về mắt và da trên heo, thỏ và người không chứng tỏ những phản ứng đáng kể hoặc gây kích ứng. với gà và chó, scleroglucan trong bữa ăn làm giảm lượng cholesterol và tăng cường sự bài tiết chất béo. Giống những β-glucan khác, scleroglucan thể hiện khả năng chống ung thư, nhưng nó hiệu quả hơn những polysaccharide khác như curdlan và β-glucan. Tiểu luận môn công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Page 5 2. NGUYÊN LIỆU VÀ CON GIỐNG 2.1. Mật rĩ 2.1.1. Giới thiệu: Rỉ đường là thứ phẩm của công nghiệp đường thu được ở công đoạn kết tinh đường. Có hai loại rỉ đường: rỉ đường mía và rỉ đường củ cải. Ở Việt Nam chỉ dùng rỉ đường mía. So với rỉ đường củ cải thì rỉ đường mía có lượng saccharose thấp hơn nhưng lượng đường khử cao hơn. Thành phần của rỉ đường mía phụ thuộc vào giống mía, thổ nhưỡng, điều kiện canh tác và công nghệ sản xuất. Lượng chất khô trong rỉ đường mía chiếm 75 ÷ 85% khối lượng; trong đó chất khô đường chiếm tới 60% (chủ yếu là saccharose và đường khử, một lượng nhỏ raffinose, 5% acid niconitic và không có betain). Số còn lại là các hợp chất vô cơ và hữu cơ. Trong các hợp chất vô cơ có các ion: K+, Na+, Cl- , Ca2+, Mg2+, SO32-…, các hợp chất hữu cơ có pectin, furfurol, acid hữu cơ, các chất màu, acid amin, vitamin. Tuy nhiên hàm lượng các chất chứa nitơ là rất thấp, cần bổ sung khi sử dụng. Hình 2: Rỉ đường từ mía Rỉ đường mía thường có màu nâu sẫm, mùi thơm ngọt hơi chua giống như mùi trái cây, có chứa acid bay hơi 0,6 ÷ 0,9 % khối lượng. Rỉ đường mía khác với rỉ đường củ cải về thành phần hóa học. Rỉ đường mía chứa ít đường saccharose hơn và nhiều đường nghịch đảo hơn, chứa ít hàm lượng Nitơ, chứa ít đường raffinose hơn và có màu sậm hơn so với rỉ đường từ củ cải. Hàm lượng khoáng trong rỉ đường từ củ cải chiếm 8,5 ÷ 14% khối lượng. Thành phần chính trong tro là K2O (chiếm 60 ÷ 70%), CaO (4,5 ÷ 7%), MgO (1%), P2O5 thấp (0,2 ÷ 0,6%) do phần lớn phospho đã được tách ra khỏi củ cải trong quá trình trích ly đường. Hàm lượng vitamin (mg/100 g rỉ đường) trong rỉ đường mía và củ cải lần lượt là 10,5 và 10,4. Bảng 1: Thành phần hóa học trong rỉ đường mía (có 80% chất khô) Các chất thành phần Hàm lượng % trong rỉ đường Các chất thành phần Hàm lượng % trong rỉ đường Saccharose 42 SiO2 0,5 Đường khử 30 SO3 1,6 Chất hữu cơ phi đường 10 Cl2 0,4 Chất tro 8 Na2O + Fe2O3 + Al2O3 0,2 Tiểu luận môn công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Page 6 Trong đó: K2O 3,5 P2O5 0,2 CaO 1,5 N tổng 0,5 ÷ 2,2 MgO 1 N amin (không thủy phân) 0,2 ÷ 0,5 Các chất keo 0,2 ÷ 1,0 Bảng 2: Thành phần vitamin chứa trong rỉ đường mía và rỉ đường củ cải (tính theo mg/ 100 g rỉ đường) Thành phần Rỉ đường mía Rỉ đường củ cải Thiamine Riboflavine Pyridoxine Nicotinic acid Pantothenic acid Folic acid Biotin Inositol 0,16 0,3 1,15 2,1 3,6 0,06 0,13 158 0,18 ÷ 0,26 0,02 ÷ 0,08 0,3 ÷ 0,45 3,9 ÷ 5,2 0,06 ÷ 0,08 0,01 ÷ 0,03 0,0035 ÷ 0,006 90 ÷ 120 Những đặc tính quan trọng của rỉ đường phù hợp với quá trình lên men ứng dụng trong công nghiệp: - Chứa hàm lượng đường cao. - Ngoài đường saccharose còn chứa nhiều chất hữu cơ, vô cơ, các vitamin và các chất kích thích sinh trưởng, đặc biệt là vitamin H - Ngoài ra xét về mặt kinh tế, rỉ đường là thứ phẩm của ngành công nghiệp đường nên giá thành nguyên liệu rẻ, nguồn cung cấp dồi dào. Vì rỉ đường là môi trường dinh dưỡng khá lý tưởng nên dễ bị vi sinh vật xâm nhập và phát triển, thường gặp nhất là những vi sinh vật gây màng và gây chua, dẫn tới làm giảm chất lượng của rỉ đường. Đôi khi, số lượng vi sinh vật có thể lên đến trên 104VSV/g rỉ đường. Thông thường, vi sinh vật trong rỉ đường gồm có Bacillus (chiếm trên 90% số lượng vi sinh vật), vi khuẩn sinh acid như E.Coli, Pseudomonas..., 1 vài loài nấm men như Candida, và đôi khi có nấm mốc như Penicillium, Aspergillus... Vi sinh vật ảnh hưởng xấu đến hiệu suất lên men. Vì vậy, trong sản xuất ta hay dùng fluosilicate natri 2‰ so với trọng lượng mật rỉ để bảo quản. 2.1.2. Chỉ tiêu chất lượng mật rỉ Bảng 3: Một số chỉ tiêu mật rĩ Thành phần Chỉ tiêu Chất khô ≥ 75% khối lượng Hàm lượng saccharose 31 ÷ 50% pH 4,5 ÷ 6,0 Hàm lượng Nitơ tổng ≥ 1,4% Số lượng vi sinh vật ≤ 15000 VSV/ 1g nguyên liệu Xử lý rỉ đường: Tiểu luận môn công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Page 7 Rỉ đường trước khi đem sử dụng cần phải được xử lý: - Acid hóa bằng H2SO4 tới pH bằng 2,8 ÷ 3 và gia nhiệt trong 6 giờ, ở nhiệt độ 90 ÷ 95oC. Lượng acid cho vào khoảng 5% khối lượng. Hoặc có thể gia nhiệt có thể tới 120oC trong 10 phút, 110oC trong 30 phút, hoặc 80 ÷ 95oC trong vòng 45 ÷ 60 phút, khi gia nhiệt thì khuấy đều. - Bổ sung nguồn N cùng các chất kháng khuẩn, khuấy đều. Nguồn N là urê hoặc amonium sulfate. - Để yên khoảng 4 giờ để lắng cặn. 2.2. Nước Nước ảnh hưởng rất lớn đến hiệu suất lên men cùng chất lượng sản phẩm thu được và thường cần một lượng rất lớn trong quá trình lên men. Tính chất: • Nhiệt độ đông đặc: 0oC • Nhiệt độ sôi: 100oC • Chỉ số khúc xạ (ở 20oC) so với không khí: 1,333 • Nhiệt nóng chảy: 6,012 KJ/mol • Nhiệt hóa hơi: 44,01 KJ/mol • Độ nhớt: 1,004 MPa.s • Nhiệt dung riêng ở áp suất 0,101 MPa của: o Nước đá (0oC): 1,039 J/kg.K o Nước (15oC): 4,185 J/kg.K o Hơi (100oC): 2,039 J/kg.K • Độ dẫn nhiệt của: o Nước đá (0oC): 2,34 W/m.K o Nước (45oC): 64,5 W/m.K o Hơi (100oC): 0,0231 W/m.K Những chỉ tiêu quan trong của nước cần quan tâm là chỉ tiêu hóa lý, chỉ tiêu cảm quan và chỉ tiêu vi sinh. 2.2.1. Chỉ tiêu hóa lý và cảm quan Tiểu luận môn công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Page 8 Bảng 4: Các chỉ tiêu cảm quan và hóa lý của nước 2.2.2. Chỉ tiêu vi sinh vật Bảng 5: Chỉ tiêu vi sinh của nước uống (quy định số 80/778/EEC) Stt Chỉ tiêu Thể tích mẫu phân tích Mức khuyến cáo Mức cao nhất cho phép Phương pháp đổ hộp (sử dụng membrance vi lọc) Phương pháp MPN 1 Tổng số vi khuẩn hiếu khí 1000 10 cfu (ở 37oC) 100 cfu (ở 27oC) 2 Coliforms tổng số 100 0 MPN < 1 3 Coliform phân 100 0 MPN < 1 4 Faecal streptococci 100 0 MPN < 1 5 Sulphite reducing clostridia 20 0 MPN < 1 Tiểu luận môn công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Page 9 2.3. Phụ liệu: 2.3.1. Acid citric • Mô tả: Tinh thể không màu hay bột trắng, đối với acid citric hạng 1 cho phép có ánh vàng. Dung dịch acid citric trong nước cất nồng độ khối lượng khoảng 20g/dm3, phải trong suốt.Vị chua, không có vị lạ, không mùi. • Độ tinh sạch: > 99,5%. • Ẩm: < 0,5%. • Kim loại nặng: < 5ppm • Sắt: < 50ppm. • Oxalic: < 100ppm. • Chloride: < 50ppm. • Sulfate: <150ppm • Tạp chất cơ học: không cho phép. 2.3.2. Acid sulfuric H2SO4 Mô tả: là một acid mạnh, dạng lỏng, màu từ trắng sang vàng ngà cho đến vàng nâu. Tan vô hạn trong nước. • Độ tinh sạch: > 98% • Sắt: < 50ppm 2.3.3. NaOH Mô tả: dạng rắn hoặc tinh thể • Độ tinh sạch: > 99%. • Na2CO3: < 0,5%. • NaCl: < 0,05%. • Fe: < 6ppm. 2.3.4. Ammonium sulfate (NH4)2SO4 Mô tả: Tinh thể không màu hoặc trắng, bị phân hủy ở 280oC, 1 gram tinh thể hòa tan được trong 1,5 ml nước, không tan trong cồn, pH dung dịch 0,1M khoảng 4,5 ÷ 6. • Độ tinh sạch: > 99%. • Kim loại nặng: <10 mg/kg. • Hàm lượng tro: < 0,25%. • Selenium: < 0,003%. 2.3.5. Potassium chloride KCl Mô tả: Tinh thể không màu hoặc bột trắng, không mùi, vị mặn. Dung dịch trung tính, 1 gram tan đươc trong 2,8ml nước ở 25oC và khoảng 2ml nước sôi, không tan trong cồn. • Độ tinh sạch: >99%. • Kim loại nặng: < 5mg/kg. • Iodine và/hoặc bromide: pass test. • Natri: pass test. Tiểu luận môn công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Page 10 2.3.6. Ferrous sulfate FeSO4.7H2O Mô tả: Tinh thể xanh nhạt, không mùi, vị mặn. trong không khí ẩm, nó bị oxy hóa thành dạng ferric sulfate có màu vàng nâu. Dung dịch có tính acid, pH khoảng 3,7. 1 gram tan trong 1,5ml nước và trong 0,5ml nước nóng, không tan trong cồn. • Độ tinh sạch: > 99,5%. • Chì: <10mg/kg. • Thủy ngân: < 3mg/kg. 2.3.7. K2HPO4 Mô tả: Hạt không màu hoặc trắng, tan khi để trong không khí ẩm. 1 gram tan trong khoảng 3ml nước, không tan trong cồn. pH dung dịch 1% là khoảng 9. • Độ tinh sạch: > 98%. • Arsenic: < 3mg/kg. • Chì: < 5mg/kg. • Kiem loại nặng: < 0,0015%. • Flouride: < 10mg/kg. • Hàm lượng chất không tan: < 0,2%. 2.3.8. Sodium nitrate NaNO3 Mô tả: Tinh thể không màu, không mùi, hoặc bột tinh thể, tan trong không khí ẩm. Tan vô hạn trong nước, tan ít trong cồn. • Độ tinh sạch: > 99%. • Arsenic: < 3mg/kg. • Kim loại nặng: < 10mg/kg. • Chlorine: pass test (khoảng 0,2%). 2.3.9. Manganese Sulfate MgSO4·7H2O Mô tả: Tinh thể không màu, vị đắng. • Độ tinh sạch: > 99% MgSO4. • Fe: < 0,0015%. • Pb: < 0,0005%. • Cl: < 0,01%. • As: < 0,0004%. • pH: 6,5 2.3.10. Sucrose Mô tả: Dạng rắn màu trắng, không mùi, vị ngọt; tan tốt trong nước, trong formamide, trong dimethyl sulfoxidem, tan ít trong cồn. • Độ tinh sạch: > 99,8%. • Arsenic: < 1mg/kg. • Kim loại nặng: < 5mg/kg. • Lượng đường nghịch đảo: < 0,1%. • Lượng tro: < 0,15%. Tiểu luận môn công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Page 11 • Chì: < 0,5%. • Gốc quay cực: giữa +65,9o và +66,7o. 2.3.11. Ethanol Mô tả: dạng lỏng trong suốt, không lợn cợn. • Độ tinh sạch: > 95% thể tích. • Acetaldehyde: < 0,0003g/ 100ml. • Methanol: < 0,001g/ 100ml. • Acid acetic: < 0,001g/ 100 ml. • Kim loại nặng: < 1mg/l 2.3.12. Dịch chiết malt Tan tốt trong nước, pH dung dịch 3% là 4,8 ÷ 5.8. • Đường khử (maltose): ≥ 60%. • Tro: ≤ 4,5% • Chlorine: < 1% • Vi sinh vật hiếu khí: < 104 CFU/g • E.coli: không có trong 10g • Salmonella: không có trong 25g • Nấm men và nấm mốc: < 20 CFU/g 2.3.13. Dịch chiết nấm men Dịch chiết nấm men bao gồm nước, các chất trong tế bào nấm men tan trong nước như amino acid, peptide, carbonhydrate và muối. Dịch chiết nấm men được sản xuất thông qua thủy phân liên kết peptide bằng enzyme có sẵn trong nấm men hoặc enzyme bổ sung vào. Sản phẩm có thể ở dạng lỏng, paste, bột hoặc rắn. • Hàm lượng protein: > 42% • Tỷ số phần trăm nitơ α-amino/nitơ tổng: 15 ÷ 55% • Nitơ ammoni: < 2%, tính trên lượng muối khô • Glutamic acid: < 12% C5H9NO4 và < 28% tổng acid amin. • Kim loại nặng (as Pb): < 10 mg/kg • Phần không tan: < 2% • Chì: < 3mg/kg • Thủy ngân: < 3 mg/kg • Giới hạn vi sinh vật: vi sinh vật hiếu khí < 50000 CFU/ g Coliform < 10 CFU/g Nấm men và nấm mốc < 50 CFU/g Salmonella không có trong 25g 2.4. Vi sinh vật sử dụng Con giống thường dùng là nấm Sclerotium rolfsii MTCC 2156, được giữ trên môi trường đông khô và được hoạt hóa trên môi trường Czapek malt agar, nó được ủ ở 28oC trong 5 ngày. Tiểu luận môn công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Page 12 Hình 3: Hình thái sợi nấm S.rolfsii 2.4.1. Hình thái, sinh lý: S.rolfsii có khả năng thích nghi cao, có thể sinh trưởng trong khoảng pH rộng, nhưng tốt nhất là trong môi trường acid. Khoảng pH tối ưu để sợi nấm phát triển là 3 ÷ 5. quá trình sinh trưởng bị ức chế ở pH lớn hơn 7. Sợi nấm phát triển tốt nhất ở 25 ÷ 35oC, ở 10 hoặc 40oC sợi nấm ít hoặc không có, và sợi nấm chết ở 0oC. Sự hình thành hạch nấm cũng tốt nhất ở gần nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển sợi nấm, nhưng hạch nấm vẫn sống sót ở nhiệt độ thấp -10oC. Độ ẩm cần thiết cho sự phát triển của sợi nấm. Hạch nấm không phát triển được khi độ ẩm tương đối quá thấp so với điểm bão hòa. Tuy nhiên một số nghiên cứu lại cho rằng hạch nấm phát triển tốt nhất ở độ ẩm tương đối 25 ÷ 35%. Sợi nấm và hạch nấm phát triển nhanh chóng trong điều kiện ánh sáng liên tục, mặc dù nó vẫn xảy ra trong bóng tối nếu thỏa mãn những điều kiện khác. Những chủng S.rolfsii đã được nghiên cứu để sản xuất polysaccharide ngoại bào (EPS) là những chủng được tách ra từ những cây bị bệnh ở những khu vực khác nhau của Pakistan. Những chủng này được giữ lạnh ở 5oC và được cấy chuyền định kỳ hàng tháng để giữ được đặc tính của chúng. 2.4.2. Tiêu chuẩn chọn giống: • Không có khả năng sinh tổng hợp độc tố. • Có khả năng sinh tổng hợp các sản phẩm chính cao. • Có khả năng thích nghi cao, bảo toàn hoạt tính. Tốc độ sinh trưởng càng nhanh càng tốt nhằm lấn át sự phát triển của những vi sinh vật nhiễm, rút ngắn thời gian lên men, cho hiệu quả kinh tế cao. • Điều kiện nuôi cấy đơn giản. Môi trường nuôi cấy rẻ tiền, dễ kiếm. Giống phải có khả năng sử dụng các nguồn nguyên liệu rẻ tiền như các phụ phẩm, các nguyên liệu thô... 2.4.3. Nhu cầu dinh dưỡng của S.rolfsii Nguồn Carbon Glucose và sucrose là những nguồn carbon thường được sử dụng để sản xuất các polyme sinh học, mặc dù các nguồn carbon khác cũng có thể được sử dụng. Hầu như các nghiên cứu về Scleroglucan đều kết luận rằng: nồng độ của glucose hay sucrose là khoảng 30g/l đến 35g/l. Dưới những điều kiện trên, lượng sản phẩm Scleroglucan tối đa thu được là 8.5 ÷ 10g/l. Lượng sản phẩm này thì thấp hơn nhiều so với lượng xanthan cao nhất thu được là 27g/l. Tiểu luận môn công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Page 13 Nồng độ sucrose trên 45g/l thì sẽ có ảnh hưởng ức chế đến sự phát triển của Sclerotium glucanicum và xa hơn nữa là sẽ hạn chế lại quá trình tạo thành Scleroglucan. Ngược lại, Farine et al. đã nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ sucrose cao lên quá trình sản xuất Scleroglucan từ S.rolfsii và kết luận rằng: việc tăng thêm sucrose sẽ dẫn đến sự cải thiện rõ ràng việc tạo sản phẩm glucan. Trong khi chỉ 7g/l Scleroglucan được sản xuất bởi 30g/l đường sucrose. Nhưng khi thu được 1 lượng Scleroglucan gấp 3 lần (21g/l) thì lại cần tới 150g/l sucrose cung cấp cho canh trường. Mặc dù sự cải thiện này, lượng sucrose còn dư vào cuối quá trình lên men rất cao khoảng 100g/l. Vì vậy, do những đòi hỏi của lợi nhuận kinh tế, Survase et al. đã chứng minh lượng sản phẩm Scleroglucan cao nhất thu được là 16.5g/l với nồng độ sucrose là 80g/l. Nguồn Nitơ Nitơ chiếm 8 ÷ 14% hàm lượng chất khô của bacterium và nấm. Nó là thành phần của protein và enzyme, và nó cần thiết cho sự trao đổi chất của tế bào. Nó tồn tại rộng rãi dưới dạng hợp chất vô cơ và hữu cơ, ví dụ như muối vô cơ +4NH và − 3NO , hay phức tạp hơn nữa là những sản phẩm tự nhiên như chiết nấm men, sản phẩm thủy phân của casein, sản phẩm thủy phân đậu nành và dung dịch nước chiết bắp có thể được sử dụng để đáp ứng yêu cầu của nhân tố này. Nói chung việc thêm nitơ sẽ làm tăng nồng độ sinh khối, nhưng làm giảm sự hình thành glucan. Hàm lượng nitơ cao tồn tại dưới dạng (NH4)2SO4 sẽ làm giảm lượng Scleroglucan. Vì vậy cung cấp nitơ dưới dạng nitrate thì tốt hơn là dưới dạng ammonium sulfate (ammonium sẽ gây ức chế sự tổng hợp enzyme). Hàm lượng tốt nhất của muối nitrate (NaNO3) là 2.25 g/l để thu được scleroglucan cao nhất. Các nguyên tố khác Phospho là một nhân tố quan trọng của quá trình trao đổi chất bậc hai. Phospho cũng điều chỉnh quá trình hấp thu lipit và cacbonhydrat của tế bào. Muối phosphat, như K2HPO4 hay KH2PO4 cũng được sử dụng như một dung dịch đệm pH trong canh trường lên men. Farina et al. chỉ ra rằng khi tổng hàm lượng phospho tăng từ 0.12 lên 0.28g/l, điều này cũng làm tăng lượng sản phẩm Scleroglucan (từ 4 lên 5g/l). Mặc dù không có sự giải thích rõ ràng, có thể hiểu rằng phospho có thể làm tăng khả năng hấp thụ glucose và tăng quá trình trao đổi chất. Kali là một cation vô cơ có ý nghĩa hết sức quan trọng đối với tế bào; Kali cũng thường tồn tại dưới dạng muối (như K2HPO4, KH2PO4 hay K2SO4). Kali là một cofactor cho nhiều loại enzyme, cần cho quá trình chuyển hóa cacbohydrat và nhiều quá trình vận chuyển khác. Magie cũng cần cho nấm, chức năng của nó như là một cofactor của enzyme, và tồn tại trong vách tế bào và membranes. Magie được cung cấp dưới dạng MgSO4.7H2O. Pilz et al. đã nói rằng việc bổ sung thiamin và kẽm vào môi trường có thể được thay thế bởi nước chiết nấm men. Những kết quả của họ chỉ ra tầm quan trọng khi có mặt kẽm đối với vi sinh vật. S.rolfsii cần Zn2+ cho quá trình trao đổi chất bậc một và cho việc sản xuất Scleroglucan. Tiểu luận môn công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Page 14 3. QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ 3.1. Quy trình Mật rĩ Xử lý nguyên liệu Chuẩn bị môi trường Lên men Trung hòa, pha loãng, gia nhiệt Cấy giống Đồng hóa Ly tâm Tinh sạch Sấy Giống Chất dinh dưỡng Chất chỉnh pH Sản phẩm Nghiền NaOH Nước cất Ethanol H2SO4 Nước cất Tiểu luận môn công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Page 15 3.2. Giải thích quy trình 3.2.1. Xử lý mật rĩ Mục đích công nghệ • Chuẩn bị cho quá trình lên men: • Vô hoạt các chất ức chế vi sinh vật trong mật rĩ. • Tiêu diệt hoặc ức chế hệ vi sinh vật có trong mật rĩ. • Tách các cấu tử không hòa tan ra khỏi mật rĩ. Các biến đổi: • Vật lý: thể tích tăng do có sự pha loãng mật rĩ. Có sự thay đổi về gradient nhiệt độ. • Hóa học: pH của dung dịch giảm mạnh. • Hóa lý: có sự tách pha, các cấu tử không tan sẽ kết tủa. • Sinh vật: vi sinh vật bị ức chế và tiêu diệt. Phương pháp thực hiện: Hình 4: Thiết bị xử lý nhiệt mật rĩ. Cấu tạo: Thiết bị hình trụ, đáy côn, làm bằng thép không rỉ. Bên trong có hệ thống ống xoắn để gia nhiệt, bên ngoài có lớp vỏ áo để làm nguội. Động cơ gắn với cánh khuấy giúp cho quá trình đảo trộn nguyên liệu. Thực hiện: Cho mật rĩ vào thiết bị, bổ sung nước, bổ sung lượng H2SO4 cần thiết, bật cánh khuấy đồng thời gia nhiệt. Sau 45 ÷ 60 phút, làm nguội nguyên liệu để đưa qua thiết bị ly tâm tách cặn. Tiểu luận môn công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Page 16 Hình 5: Thiết bị ly tâm làm sạch mật rĩ. Cấu tạo: thiết bị có dạng hình trụ, bên trong có bố trí các thanh chặn. Khi động cơ truyền động cho rotor bên trong quay, dưới tác động của lực ly tâm các cấu tử không tan sẽ bị văng ra, giữ lại trên các thanh chặn. Thông số công nghệ: • Tỷ lệ nước : mật rĩ là 3 : 1. • Lượng H2SO4 bổ sung: 5% khối lượng mật rĩ. • pH: 2,8 ÷ 3. • Nhiệt độ : 90 ÷ 100oC. • Giữ ở nhiệt độ đó trong khoảng thời gian 45 ÷ 60 phút. • Tốc độ quay: 1500 rpm. 3.2.2. Chuẩn bị môi trường Mục đích công nghệ: Chuẩn bị: bổ sung các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển và sinh tổng hợp sản phẩm của nấm mốc trong quá trình lên men. Thành phần hóa học của môi trường lên men: % khối lượng • Sucrose: 8% • Chất chiết nấm men: 0,1% • NaNO3: 0,3% • K2HPO4: 0,13% • NaCl: 0,05% • MgSO4: 0,025% • FeSO4: 0,005% • Acid citric: 0,07% Các biến đổi: • Hóa học: thành phần hóa học của các chất trong nguyên liệu thay đổi. Tiểu luận môn công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Page 17 • Hóa lý: sự hòa tan các chất rắn vào dung dịch. Phương pháp thực hiện: Sử dụng thiết bị phối trộn có cấu tạo gồm 1 thùng khuấy, bên trong có gắn 2 cánh khuấy mái chèo được đặt lệch tâm, thành thùng khuấy đặt các thanh chặn. Thiết bị này dùng cho chất lỏng có độ nhớt trung bình. Hình 6: Thiết bị phối trộn Thực hiện: các chất dinh dưỡng cần bổ sung được hòa tan trong nước vô khuẩn, sau đó dung dịch được bơm vào thiết bị phối trộn. Sau đó bổ sung NaOH để điều chỉnh về pH phù hợp cho sự phát triển của nấm mốc. Thông số công nghệ: • Tốc độ khuấy: 200 rpm • pH ra: 4,5 ± 0,2 3.2.3. Nhân giống Mục đích công nghệ Quá trình nhân giống tạo điều kiện cho nấm mốc tăng sinh khối để chuẩn bị cho quá trình lên men. Các biến đổi: • Vật lý: nhiệt độ của môi trường tăng một chút do quá trình hô hấp của nấm mốc. • Hóa học: thành phần chất dinh dưỡng trong môi trường sẽ giảm. • Hóa sinh: các phản ứng trao đổi chất của vi sinh vật. • Sinh học: trong quá trình nhân giống, nấm mốc sinh trưởng để tăng sinh khối. Phương pháp thực hiện: Giống cấy mua về ở dạng đông khô cần hoạt hóa. Môi trường sử dụng để hoạt hóa là Czapek malt agar. Thành phần Czapek malt agar: • Chất chiết malt: 40g/l • Sucrose: 30g/l • NaNO3: 2g/l Tiểu luận môn công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Page 18 • KCl: 0,5g/l • MgSO4: 0,5g/l • FeSO4: 0,01g/l • K2HPO4: 1g/l • Agar: 20g/l • pH (25oC) = 6,8 ± 0,2 Nấm mốc sau khi hoạt hóa sẽ nhân giống trong môi trường lỏng PM20. Quá trình nhân giống được thực hiện trong bồn có cánh khuấy, có vỏ áo để giữ nhiệt. Thành phần hóa học của môi trường PM20: • Sucrose: 20g/l • NaNO3: 3g/l • K2HPO4.3H2O: 1,3g/l • Chất chiết ấm men: 1g/l • KCl: 0,5g/l • MgSO4.7H2O: 0,5g/l • FeSO4.7H2O: 0,05g/l • Acid citric: 0,7g/l • pH = 4,5 Thông số công nghệ: • Nhiệt độ: 28oC. • Thời gian hoạt hóa: 5 ngày. • Thời gian nhân giống: 2 ngày. • Tốc độ cánh khuấy trong quá trình nhân giống: 250 rpm. 3.2.4. Lên men Mục đích công nghệ: Nấm mốc phát triển tăng một phần sinh khối, đồng thời sinh tổng hợp scleroglucan cần thu nhận. Các biến đổi • Vật lý: quá trình lên men sinh nhiệt nên nhiệt độ của thùng lên men có tăng lên, cần có thiết bị điều chỉnh nhiệt độ để giữ ổn định nhiệt độ phù hợp với sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật. Ngoài ra, quá trình sinh tổng hợp nên scleroglucan cũng tăng độ nhớt của dung dịch. • Hóa lý: pH của canh trường giảm do sự tổng hợp acid oxalic (sản phẩm không mong muốn của quá trình lên men). • Hóa học: nồng độ đường đơn trong dung dịch giảm, nồng độ sản phẩm tăng lên. • Hóa sinh: các phản ứng do enzyme xúc tác rất đa dạng, đó là các phản ứng trong quá trình trao đổi chất của vi sinh vật. • Sinh học: sự sinh trưởng, phát triển và sự trao đổi chất của vi sinh vật trong dung dịch. Tiểu luận môn công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Page 19 Con đường sinh tổng hợp scleroglucan: Hình 7: Con đường sinh tổng hợp scleroglucan 1. Hexokinase 2. Phosphoglucomutase 3. UTP-glucose-1-phosphate-uridilyltransferase 4. (1→3)-beta-glucan-synthase 5. Glycosyltransferase/glucosidase Có rất ít thông tin về việc hình thành scleroglucan từ Sclerotium glucanicum và S.rolfsii, nhưng nói chung nó cũng tương tự các bước tổng hợp các glucan khác. Trước tiên glucose được chuyển vào trong tế bào thông qua hexokinase và được phosphoryl hóa bằng enzyme phosphoglucomutase (PGM) và phosphoglucoisomerase (PMI). Pyrophosphorylase xúc tác cho sự hình thành uridine diphosphate glucose (UDP-glucose), sau đó nó tương tác với chất mang lipid và bắt đầu quá trình polymer hóa. Con đường dự kiến trong sản xuất được mô tả như sơ đồ trên. Sự hình thành sản phẩm phụ: Oxalic acid là sản phẩm phụ chủ yếu trong sản xuất scleroglucan, đó là sản phẩm không mong muốn. Oxalic acid là một sản phẩm trao đổi chất của nấm, nó liên quan đến điều Tiểu luận môn công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Page 20 kiện canh trường và nguồn dinh dưỡng. Lượng oxalic acid là khác nhau tùy vào chủng giống nấm, nguồn carbon và nitơ, pH ban đầu và cũng bị ảnh hưởng bởi sự hiện diện của chất đệm hay chất hóa học khác trong việc phát triển của canh trường. Những điều kiện tối ưu nhất cho sự hình thành oxalic acid bao gồm nồng độ carbohydrate cao và sự thoáng khí phù hợp, giới hạn của nguồn dinh dưởng vô cơ, pH cao. Maxwell và Bateman cho rằng enzyme glyoxalate dehydrogenase có liên quan đến sinh tổng hợp oxalate bởi S.rolfsii, và cho rằng pH của môi trường bên ngoài là nhân tố chính ảnh hưởng sự tích lũy oxalate. Thành phần của canh trường lên men cũng có ảnh hưởng mạnh mẽ đến việc hình thành oxalate. Việc bổ sung L-threonine vào môi trường sẽ làm giảm mức độ tiết oxalic acid. Việc hình thành oxalate cũng phụ thuộc vào nguồn carbon tự nhiên dùng trong môi trường. Maxwell và Bateman cũng tìm ra rằng không có sự phát triển hay sự tích lũy oxalate xảy ra khi D-glucose, pyruvate, citrate, fumarate, glycolate, glyoxylate, L-aspatate, glycine hay glycerol được dùng như nguồn carbon duy nhất. Nhiều nhà nghiên cứu xem xét cơ chế sinh tổng hơp oxalate bởi vi sinh vật. Họ kết luận rằng sinh tổng hợp oxalate có thể xảy ra theo một số con đường khác nhau như phân tách bằng thủy phân oxaloacetate thành oxalate và acetate hay oxi hóa glyoxalate thành oxalate. Con đường hình thành oxalate được thể hiện ở sơ đồ sau. Hình 8: Quá trình dị hóa glucose và hình thành oxalate. Sự hình thành oxalate trong suốt quá trình lên men gây ra hai khó khăn. Thứ nhất, nó làm giảm nguồn carbon dẫn đến sự hình thành exopolysaccharide cũng giảm. Thứ hai, tách oxalate ra khỏi sản phẩm là cần thiết. Herve đã nghiên cứu những phương pháp để làm giảm Tiểu luận môn công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Page 21 sự hình thành oxalate và tìm ra được: việc điều chỉnh pH ban đầu và điều khiển sự bổ sung NH4Cl trong suốt quá trình lên men có thể làm giảm sự hình thành oxalic acid mà không làm giảm sản lượng glucan. pH thấp sẽ làm hoạt hóa quá trình decacboxyl oxalate thành formate và CO2. Schilling et al. đề xuất pH thấp làm giảm sinh tổng hợp enzyme, và từ đó đã đưa ra mức pH = 2 để làm giảm thiểu nguồn carbon mất cho việc tạo thành oxalate. Những tác giả đó cũng phát hiện rằng việc giới hạn lượng oxy để làm giảm sản phẩm oxalate, vì sự sinh tổng hợp enzyme glycolateoxidase sẽ bị ức chế trong điều kiện kỵ khí và đề nghị rằng nếu hạn chế cung cấp oxy từ ban đầu có thế có lợi cho sản xuất glucan. Các yếu tố ảnh hưởng: Vi sinh vật phản ứng nhanh chóng với sự thay đổi của môi trường bằng nhiều cách khác nhau như là tăng hoặc giảm sinh tổng hợp protein, thay đổi hình thái tế bào, hay ức chế hay kích hoạt enzyme. Trong bình lên men, những thông số môi trường chình cần quan tâm là pH, nhiệt độ, oxy hòa tan, và tốc độ khuấy. Nhiệt độ: Nhiệt độ bên trong của vi sinh vật phải bằng với nhiệt độ của môi trường. Như những phản ứng hóa học khác, hoạt động của vi sinh vật rất nhạy cảm với nhiệt độ của môi trường. Nhiệt độ là thông số quan trọng ảnh hưởng tới quá trình sinh trưởng cũng như quá trình sản xuất polysaccharide. Tuy nhiên, nhiệt độ tối ưu cho quá trình tổng hợp polysaccharide ngoại bào (20 ÷ 37oC) và nhiệt độ tối ưu cho quá trình sinh trưởng (28oC) là rất khác nhau. Dưới 28oC, sự hình thành acid oxalic sẽ tăng cường và có ảnh hưởng xấu tới sự tổng hợp scleroglucan. pH: pH hưởng đáng kể tới sinh lý vi sinh vật vì nó ảnh hưởng tới khả năng hòa tan và hấp thu, hoạt tính enzyme, hình dạng màng tế bào và các phản ứng oxy hóa khử. pH môi trường có ảnh hưởng sâu sắc tới cả tốc độ sản xuất và sự tổng hợp polysaccharide. Cũng như nhiệt độ, pH thích hợp cho sản xuất polysaccharide có thể khác với sinh trưởng. Trong trường hợp sản xuất xanthan, Moraine và Rogovin nhận thấy pH môi trường ảnh hưởng tới sản xuất polysaccharide nhiều hơn sinh trưởng tế bào. Kang và Cottrell thì nói rằng việc tổng hợp polymer sinh học từ các loại nấm có thể tối ưu trong khoảng pH là 4,0 ÷ 5,5. dựa vào những nhận định này, những nhà nghiên cứu đã phát triển quá trình lên men 2 giai đoạn, giai đoạn đầu tạo điều kiện tối ưu cho sinh trưởng và giai đoạn sau là tạo điều kiện để tổng hợp polysaccharide. Lacroix et la tiến hành lên men lấy pullulan, 1 glucan khác từ nấm, thì trong giai đoạn đầu, pH 2,0 cho sinh khối nấm men và tốc độ sinh trưởng cao nhất. khi lượng sinh khối đã đủ lớn thì điều chỉnh pH về 5,5 để thu sản phẩm pullulan lớn nhất. Cũng bằng cách tương tự, Wang và Mcneil đã chứng minh rằng lượng scleroglucan nhiều hơn theo con đường 2 giai đoạn. ở giai đoạn đầu tiên, pH được điều khiển ở 3,5 để tăng sinh trưởng, sau đó được điều chỉnh về pH = 4,5 để tăng cường tổng hợp polysaccharide. Sự tăng tổng hợp polysaccharide đạt được dưới những điều kiện này được kết hợp với việc hình thành phụ phẩm giảm 10%. Điều này cho thấy rằng, khi pH cao hơn so với khi tăng trưởng, carbon tới để tổng hợp polymer tăng. Trong một số nghiên cứu, để đơn giản hóa quá trình và giảm giá thành, pH không được điều khiển sau điều chỉnh ban đầu, mà lượng scleroglucan sản phẩm là tương đối thấp. Để giữ được pH tối ưu cho sản xuất polysaccharide, điều chỉnh pH trong quá Tiểu luận môn công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Page 22 trình lên men là cần thiết, đặc biệt là đối với S.rolfsii phản ứng khác nhau khi một giai đoạn bất kỳ bị biến đổi phụ thuộc vào việc nuôi trong bình lắc hay trong bình phản ứng có khấy đảo. Oxy hòa tan: Oxy giữ vai trò trọng yếu trong đời sống của vi sinh vật hiếu khí bằng cách kích thích hay kiềm hãm những hệ enzyme của trao đổi chất bậc một hay bậc hai, và kích hoạt những phản ứng oxy hóa khi sử dụng chất dinh dưỡng và sinh năng lượng. Nó cũng ảnh hưởng tiêu cực tới trao đổi chất tế bào như sinh ra các gốc peroxide hay superoxide. Nghiên cứu ảnh hưởng của oxy hòa tan lên việc tổng hợp polymer sinh học trên S.glucanicum và S.rolfsii chỉ ra rằng khi lượng oxy đột ngột tăng cao, nó giảm sự hình thành glucan. Tuy nhiên trong sản xuất một số polysaccharide nhu pullulan và gellan, oxy vừa kích thích vừa cần cho sự sống để tổng hợp polymer. Ngược lại, canh trường nuôi Sclerotium lại phản ứng với lượng oxy hạn chế được cung cấp như việc hạn chế sinh trưởng và đặc biệt kích thích sự hình thành glucan. Đây là điều không được trông đợi ở vi sinh vật hiếu khí, nhưng có thể giảm lượng oxy hòa tan ảnh hưởng đến hình thái của nấm mốc và cấu trúc của dịch lên men, cái mà sẽ ảnh hưởng đến sự tăng trưởng tế bào và trao đổi chất. Nguyên nhân khác, hô hấp được tăng cường ở mức oxy hòa tan cao, do đó sẽ chuyển đổi nhiều carbon thành carbon dioxide và giảm cung cấp cho tổng hợp scleroglucan. Wang và McNeil đề nghị kích thích việc tổng hợp glucan trong điều kiện oxy hòa tan thấp có thể dẫn đến giảm sự sinh trưởng tế bào. Dưới những điều kiện này, nhiều carbon từ cơ chất cung cấp cho hình thành scleroglucan hơn. Thêm nữa, giảm oxy hòa tan dẫn đến giảm hình thành các phụ phẩm nên ức chế sự tổng hợp enzyme oxidase, do đó ưu tiên chuyển carbon cho việc tổng hợp glucan. Sự thoáng khí và khuấy trộn: Sự thoáng khí và khuấy trộn quyết định chất dinh dưỡng và oxy hòa tan trong môi trường, và điều khiển tốc độ chất trao đổi giải phóng ra khỏi tế bào, bao gồm polymer sinh học, phụ phẩm và carbon dioxide. Trong sản xuất polysaccharide, canh trường lên men trở nên đặc và biểu hiện tính phi Newton (tính giả dẻo). Với nấm sợi, ngoài ảnh hưởng từ nồng độ polysaccharide ra, sinh khối cũng đóng góp một phần đáng kể đến tính lưu biến của dịch nuôi cấy. Những hiện tượng này giới hạn quá trình đảo trộn trong bình lên men, và thay đổi trạng thái môi trường lên men. Khi tốc độ khuấy lớn, khuẩn ty nấm men có thể bị phá vỡ, làm giảm độ nhớt của dung dịch. Ngược lại nếu tốc độ khuấy thấp thì sẽ hình thành các thể nấm men dạng viên nhỏ. Tốc độ khuấy và thoáng khí thường có lợi cho quá trình hình thành polysaccharide mặc dù vẫn có một số trường hợp bác bỏ. McNeil và Kristiansen đã chỉ ra rằng tăng tốc độ khuấy làm tăng sự tổng hợp glucan bởi Aureobasidium pullulan cũng như chất lượng của polymer (phân tử khối lớn), và có thể ảnh hưởng đến trạng thái canh trường vì nó đẩy mạnh hình thành tế bào dạng “nấm men” (thay vì dạng sợi nấm), cái mà có thể sản xuất nhiều glucan hơn. Đối với S.glucanicum, khi tăng tốc độ khuấy lên 600rpm thì tốc độ tăng trưởng cũng tăng, nhưng tốc độ giảm lại sinh nhiều glucan hơn. Khi tốc độ khuấy cao, glucan bị phá vỡ, đồng thời tế bào cũng bị tổn thương, nhưng nếu tốc độ quay trong bình lên men không đủ thì chỉ những glucan phân tử lượng thấp được giải phóng khỏi tế bào, những glucan lớn hơn vẫn bám trên bề mặt tế bào. Tiểu luận môn công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Page 23 Tác nhân khác: Một số hoạt động có thể ảnh hưởng đến việc sản xuất polysaccharide. Theo Rau et al., lên men tĩnh có bổ sung cơ chất thu được nhiều glucan hơn nuôi cấy tĩnh. Lên men tĩnh có bổ sung cơ chất được Shin et al. nghiên cứu trong sản xuất pullulan, khi bổ sung nguồn carbon ở giai đoạn sau của quá trình nuôi cấy thì lượng pullulan thu được nhiều hơn. Taurhesia và McNeil tìm thấy rằng trong sản xuất scleroglucan bằng S.glucanicum, nếu bổ sung thêm đường trong phase cân bằng có thể tăng cường hình thành polysaccharide. Nhưng nhiều lúc, nếu chỉ bổ sung lượng đường trong một lần thì sẽ có nguy cơ là nồng độ đường trong dung dịch sẽ đột ngột tăng lên dẫn đến ức chế ở những mức độ khác nhau. Sự sinh trưởng của vi sinh vật cũng như việc giải phóng chất trao đổi có thể bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố khác nhu ánh sáng, bức xạ và áp lực thủy tĩnh. Miller và Lierta nhận thấy ánh sáng xanh và trắng kích thích sự tích lũy β-1,3-glucan trong S.rolfsii. Phương pháp thực hiện: Sử dụng thiết bị lên men bề sâu, lên men gián đoạn. Hình 9: Thiết bị lên men bề sâu. Các bộ phận của thiết bị: 1. Động cơ 2. Hộp giảm tốc 3. Khớp nối 4. Ổ bi 5. Vòng bít kín 6. Trục 7. Thành thiết bị 8. Máy khuấy trộn tuabin Tiểu luận môn công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Page 24 9. Bộ trao đổi nhiệt dạng ống xoắn 10. Khớp nối 11. Ống nạp không khí 12. Máy trộn kiểu cánh quạt 13. Bộ sủi bọt 14. Máy khuấy dạng vit 15. Ổ đỡ 16. Khớp để tháo 17. Áo 18. Khớp nạp liệu 19. Khớp tháo không khí Cấu tạo: thiết bị này có cấu tạo là một thùng hình trụ đứng được cấu tạo từ thép không rỉ hay lớp kim loại kép có đáy và nắp hình nón, trên nắp có gắn động cơ chuyển đảo và các ống nối cho môi trường và các tác nhân hỗ trợ quá trình lên men, van bảo hiểm và các khớp nối để gắn các dụng cụ kiểm tra. Xử lý thiết bị với H2SO4 và HNO3 loãng, thông khí trong 24h Tiệt trùng thiết bị bằng hơi nước (0,2 bar), làm nguội bằng tác nhân lạnh thông qua vỏ áo. Thông số công nghệ: • Nhiệt độ lên men 25 ÷ 30oC. • pH dao động 4,5. • Lưu lượng khí 0,5 vvm. • Thời gian lên men 72h. • Tỷ lệ giống cấy: huyền phù tế bào chiếm 10% thể tích làm việc củng thùng lên men. 3.2.5. Trung hòa, pha loãng, gia nhiệt Mục đích công nghệ: Các quá trình trung hoà, pha loãng, gia nhiệt trên đều có tác dụng chấm dứt quá trình lên men đồng thời làm giảm độ nhớt của dung dịch để chuẩn bị cho quá trình ly tâm tách sinh khối. Các biến đổi: • Vật lý: thể tích dung dịch tăng, độ nhớt giảm • Hóa lý: pH thay đổi. • Hóa sinh và Sinh học: vi sinh vật và enzyme trong canh trường lên men ức chế vì pH thay đổi, do nhiệt độ cao. Phương pháp thực hiện: Thực hiện trong một thiết bị khuấy trộn có vỏ áo. Canh trường sau lên men được bơm vào thiết bị khuấy trộn, bổ sung NaOH để điều chỉnh về pH trung tính. Sau đó pha loãng với nước cất vô khuẩn đồng thời gia nhiệt lên 80oC, giữ trong 30 phút. Thông số công nghệ: • Nhiệt độ: 80oC. • Thời gian giữ nhiệt: 30 phút. • Tỷ lệ nước : nguyên liệu: 1 : 3 hoặc 4 3.2.6. Đồng hóa Tiểu luận môn công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Page 25 Mục đích công nghệ: Sau quá trình lên men, scleroglucan còn bám lại trên thành tế bào rất nhiều. Quá trình đồng hóa làm scleroglucan tách khỏi thành tế bào, chuẩn bị cho quá trình thu nhận sản phẩm tiếp theo. Các biến đổi: • Vật lý: pha phân tán giảm kích thước. • Hóa học: scleroglucan tách khỏi thành tế bào và đi vào canh trường làm nồng độ scleroglucan trong dung dịch tăng. Phương pháp thực hiện: Sử dụng máy đồng hóa bằng cánh khuấy. Thiết bị phải kín để tránh sự nhiễm vi sinh vật. Thiết bị có vỏ áo để giữ nhiệt cho nguyên liệu. Hình 10: Thiết bị đồng hóa bằng cánh khấy Canh trường sau khi lên men được đưa vào thiết bị, bật cánh khuấy với tốc độ vửa phải để scleroglucan bám trên thành tế bào bị tách ra do lực ly tâm và ma sát. Thông số công nghệ: • Tốc độ khuấy: 1000 rpm 3.2.7. Ly tâm Mục đích công nghệ: Tách sinh khối nấm men ra khỏi canh trường, thu được dung dịch không còn chứa tế bào để chuẩn bị cho quá trình thu nhận sản phẩm. Các biến đổi: • Hóa lý: sự tách sinh khối • Sinh học: số lượng vi sinh vật trong canh trường giảm. Phương pháp thực hiện: Sử dụng máy ly tâm lắng nằm ngang. Tiểu luận môn công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Page 26 Hình 11: Máy ly tâm lắng nằm ngang. Thông số công nghệ: • Tốc độ quay: 10000 rpm. • Thời gian: 30 phút. 3.2.8. Tinh sạch: Mục đích công nghệ: Tách tạp chất, hoàn thiện để thu sản phẩm scleroglucan. Các biến đổi: • Vật lý: sự giảm nhiệt độ trong các quá trình. • Hóa lý: scleroglucan kết tủa khi bổ sung ethanol 96% vào dung dịch. • Hóa học và hóa sinh: không có phản ứng xảy ra trong quá trình tinh sạch. Phương pháp thực hiện: Dịch lỏng thu được sau quá trình ly tâm (đã tách sinh khối) được tập trung trong một bồn chứa và làm lạnh xuống 5oC. Ethanol 96% được bổ sung vào bồn. Hỗn hợp sau đó được để yên ở nhiệt độ 5oC trong 8 giờ để quá trình kết tủa scleroglucan được xảy ra hoàn toàn. Sau đó huyền phù được bơm qua thiết bị lọc để thu phần rắn (scleroglucan). Phần rắn thu được sẽ hòa tan lại vào nước vô khuẩn thành dung dịch và thực hiện lại quá trình trên một lần nửa để thu được sản phẩm có độ tinh sạch cao hơn. phần rắn sau khi lọc lần 2 được đưa qua thiết bị sấy và nghiền để thu sản phẩm. Sử dụng thiết bị lọc khung bản để lọc huyền phù. Sau đó tháo bã, sử dụng bã (là scleroglucan kết tủa) cho các quá trình tiếp theo. Tiểu luận môn công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Page 27 Hình 12: Thiết bị lọc khung bản Thông số công nghệ: • Lượng ethanol sử dụng: gấp 2 lần thể tích dung dịch. • Nhiệt độ: 5oC. • Kích thước lỗ màng lọc: 74 µm 3.2.9. Sấy Mục đích công nghệ: Sấy chân không làm giảm độ ẩm của kết tủa scleroglucan để chuẩn bị cho quá trình nghiền. Vì độ ẩm giảm nên hạn chế vi sinh vật, do đó sấy còn có mục đích là bảo quản. Các biến đổi: • Vật lý: nhiệt độ nguyên liệu tăng, khối lượng giảm. • Hóa lý: có sự thoát hơi nước từ nguyên liệu. • Các biến đổi khác không đáng kể. Phương pháp thực hiện: Sử dụng thiết bị sấy chân không để giảm nhiệt độ sấy, tránh làm ảnh hưởng đến chất lượng nguyên liệu. Tiểu luận môn công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Page 28 Hình 13: Thiết bị sấy chân không Thiết bị sử dụng bơm hút chân không và hút ẩm, buồng làm việc ở trạng thái chân không. Nguyên liệu sau khi lọc được cho vào thiết bị sấy, đóng nắp, bật bơm chân không để hút tạo chân không trong buồng sấy. Tác nhân gia nhiệt là hơi. Thông số công nghệ: • Áp suất: 650 mmHg. • Nhiệt độ: 60oC. • Thời gian: 2 giờ. • Độ ẩm sau khi sấy: khoảng 10% 3.2.10. Nghiền Mục đích công nghệ: Hoàn thiện: nghiền để thu được sản phẩm ở dạng mong muốn. Các biến đổi: • Vật lý: kích thước nguyên liệu giảm, từ dạng rắn chuyển sang dạng bột. • Các phản ứng khác không đáng kể. Phương pháp thực hiện: Sử dụng thiết bị nghiền búa có gắn màng rây ở đầu ra sản phẩm. Nguyên liệu sau khi sấy ở dạng rắn, từng mảng, được cho vào thiết bị nghiền. Nguyên liệu được nghiền nhỏ nhờ ma sát giữa búa và nguyên liệu, giữa nguyên liệu và thành thiết bị. Sau quá trình nghiền, những hạt nào có kích thước đạt yêu cầu sẽ đi qua rây và thu nhận ở đầu ra. Tiểu luận môn công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Page 29 Hình 14: Thiết bị nghiền búa Thông số công nghệ: • Kích thước hạt ra: 0,2 mm Tiểu luận môn công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Page 30 4. SẢN PHẨM Trong công nghệ thực phẩm trên thế giới mỗi năm sử dụng 70 nghin tấn polysaccharide làm chất tạo độ nhớt, làm bến và tạo hình. Khi các sản phẩm thực phẩm ngày càng đa dạng và phong phú., yêu cầu những chất phụ gia linh hoạt càng lớn. ngày nay, các polysaccharide khác nhau được dùng làm chất tạo nhớt và tạo hình dạng cho thực phẩm. Thêm nữa, gum polysaccharide có thể đóng vai trò nhứ chất xơ thực phẩm hòa tan với tác dụng tốt cho sức khỏe khi sử dụng ở mức thấp. Scleroglucan trong thực phẩm có thể dùng làm chất tạo độ nhớt, tạo gel. Tuy nhiên, xanthan cũng có những tính chất và ứng dụng tương tự, và đang thống trị thị trường. Nếu giải quyết được bài toán về giá thành và sản lượng thì scleroglucan hoàn toàn có thể thay thế xanthan trong thực phẩm như làm jam, mứt cam, soup, các sản phẩm bánh kẹo, thực phẩm đông lạnh, sản phẩm từ sữa như yogurt hay kem, những sản phẩm không béo và nghèo năng lượng, hoặc trong thực phẩm giả, thực phẩm cấu trúc. Scleroglucan đặc biệt được dùng trong công nghiệp thực phẩm khi trong quy trình có sử dụng các quá trình nhiệt, đó là nhờ đặc tính bền nhiệt của nó. Ngoài ra, Vinara et al đã nghiên cứu về khả năng của exopolysaccharide sản xuất bởi Sclerotium rolfsii để hạn chế sự tách pha (sự đông đặc) xảy ra trong quá trình làm lạnh khối tinh bột nấu. Nhờ tính lưu biến của dung dịch exopolysaccharide như tăng độ nhớt, tính phi Newton, tính giả dẻo, nó có thể ngăn cản sự đông đặc mà không ảnh hưởng đến pH, độ cứng, độ màu. Kết quả còn cho thấy scleroglucan có thể trở thành chất giữ nước trong thực phẩm, tạo độ bến keo cho thực phẩm và tránh mất nước. Chỉ tiêu Mô tả: Dạng bột, màu trắng đục, không mùi. Hòa tan được trong nước lạnh. Dung dịch có pH= 6 ÷ 9. • Phân hủy ở 200oC • Độ ẩm: < 13% • Khối lượng riêng (25oC): 0,6 ÷ 0,7g/cm3 • Kim loại nặng: < 10ppm. • Chì: < 3ppm. • Arsenic: < 3ppm. • Tồng khuẩn lạc đếm được trên đĩa: < 2000 cfu/g. • Nấm men và nấm mốc: < 100 cfu/g. • Coliform: không có trong 1 gram. • Salmonella: không có trong 1 gram. Tiểu luận môn công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Page 31 5. THÀNH TỰU 5.1. Tăng cường sự tổng hợp scleroglucan với Sclerotium rolfsii bằng cách sử dụng tiền chất. Tiền chất sử dụng là các đường nucleotide, ở đầy sử dụng là Uridine-5’- monophosphate (UMP) và uridine diphosphate glucose (UDPG) và một số chất khác. Con giống sử dụng và các điều kiện lên men giống như quy trình trên. Các thí nghiệm với các tiền chất được thực hiện với các nồng độ khác nhau, thời gian bổ sung khác nhau. Sau đó kết quả được đánh giá dựa vào scleroglucan và lượng sinh khối tạo thành. Kết quả: Hình 15: Ảnh hưởng tiền chất nồng độ lên lượng sclerglucan và sinh khối tạo thành bởi S.rolfsii Hình 15 cho thấy có sự tăng lượng scleroglucan tạo thành, sinh khối khi bổ sung thêm UMP và UDPG với nồng độ 0,4mM cho UMP và 0,5mM cho UDPG (lượng scleroglucan thu được lần lượt là 21,12 và 22,08 g/l so với 16,5g/l khi lên men bình thường). Dựa vào sơ đồ con đường sinh tổng hợp scleroglucan ta thấy UMP sẽ chuyển thành UDP, chất sẽ đóng vai trò quan trọng trong quá trình tổng hợp polysaccharide. Monomer (glucose) được hoạt hóa khi gắn với UDP, giúp cho quá trình kết nối các monomer lại thành chuỗi polysaccharide. Đó có thể là cơ chế của việc tăng lượng sản phẩm tạo thành. Còn về thời gian bổ sung, ta có bảng kết quả như bảng 6. Dựa vào bảng đó ta thấy, khi nồng độ UMP là 0,4mM và được bổ sung vào sau 48 giờ lên thì lượng scleroglucan tăng đáng kể. Tiểu luận môn công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Page 32 Bảng 6: Ảnh hưởng của nồng độ UMP, UDPG và thời gian bổ sung lên luộng scleroglucan và sinh khối tạo thành bởi S.rolfsii Từ thí nghiệm này ta thấy, việc bổ sung UMP và UDPG trong quá trình sinh tổng hợp scleroglucan có làm tăng lượng sản phẩm tạo thành. Ta có áp dụng vào quy trình này bằng cách thay quá trình lên men tĩnh bằng lên men tĩnh có bổ sung cơ chất, và cơ chất chính là UMP hoặc UDPG, thời gian bổ sung là sau 48 giờ lên men. 5.2. Hoàn lưu sinh khối nấm men kết hợp giới hạn lượng oxy cung cấp để tăng lượng scleroglucan tổng hợp được cũng như giảm lượng oxalic acid hình thành. Như đã biết, acid oxalic là một sản phẩm phụ không mong muốn trong sản xuất scleroglucan. Việc hình thành acid oxalic gây ra 2 hậu quả. Thứ nhất là nguồn carbon để tổng hợp polysaccharide giảm do đã sử dụng để tổng hợp acid oxalic. Thứ hai là oxalic acid gây trở ngại cho việc thu nhận sản phẩm sau quá trình lên men. Do vậy, các nhà nghiên cứu đều tìm cách hạn chế sự hình thành sản phẩm phụ này cũng như tăng lượng scleroglucan tạo thành, từ việc điều chỉnh nhiệt độ, pH và bây giờ là cung cấp lượng oxy hạn chế trong quá trình lên men và hồi lưu sinh khối. Đối với pH, nếu pH ban đầu cao, nó sẽ kích thích việc tổng hợp oxalic acid và đồng thời cũng tăng tổng hợp glucan, và pH thấp dẫn đến giảm sự hình thành oxalic acid kèm theo sự phát triển chậm lại của nấm. Còn đối với oxy, sự giới hạn oxy cũng làm giảm sự hình thành acid này trong quá trình ủ lên men. Lý do là các enzyme tổng hợp oxalic acid (glycolate oxidase) sẽ bị kích thích khi có mặt nguyên tử oxi. Theo nghiên cứu, nếu giảm lượng glucose sẽ dẫn đến giảm beta-glucanase, tất là giảm sự tổng hợp glucan để dùng như nguồn carbon nếu glucose đã sử dụng hết. Do đó quá trình lên men phải kết thúc ngay khi glucose bị cạn kiệt. Kéo dài thơi gian lên men trong điều kiện lên men tĩnh (nguồn carbon bị giới hạn) sẽ giải phóng các enzyme và sẽ dẫn đến sự tăng nhẹ nồng độ glucose cũng như giảm độ nhớt của dung dịch. Khi so sánh lên men liên tục va lên men tĩnh trong cùng điều kiên tối ưu oxy cung cấp, năng suất của lên men liên tục tăng ba lần so vơi lên men tĩnh. Để tăng năng suất hơn nữa, ta có thể kết hợp với quá trình hồi lưu sinh khối. Một thiết bị lọc membrane ngược dòng được sử dụng để tách sinh khối. khi áp dụng trong sản xuất scleroglucan thì sản lượng tăng lên 95g.l-1.d-1 với tốc độ pha loãng là 0,65h-1 với tốc độ hồi lưu 0,95. Tiểu luận môn công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Page 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Lê Văn Việt Mẫn, Công nghệ chế biến thực phẩm, Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia tp HCM, 2009, 1020 trang 2. Lê Ngọc Tú, Hóa sinh công nghiệp, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật Hà Nội, 2005, 443 trang. 3. Darukhshinda Kokub, Production of biopolymers by indigenous fungal strains of Sclerotium rolfsii and their possible use in petroleum industry, Pakistan, 2008. 4. Rehm H.J, Reed G., Bioteachnology, volumn 6: Primary metabolites, VCH publisher, Weinheim, 1996. 5. J.I. Farina et al, Isolation and physicochemical characterization of soluble scleroglucan from Sclerotium rolfsii. Rheological properties, molecular weight and conformational characteristics, Carbohydrate Polymers, 44 (2001), 41–50. 6. S.A. Survase, Enhanced production of scleroglucan by Sclerotium rolfsii MTCC 2156 by use of metabolic precursors, Bioresource technology, 98(2007), 410–415. 7. S.A.Survase, Scleroglucan: Fermentative production, downstream processing and applications, Food technol. Biotechnol., 45(2), 107–118 (2007). 8. S.A. Survase et al, Use of complex media for the production of scleroglucan by Sclerotium rolfsii MTCC 2156, Bioresource Technolog, 98 (2007), 1509–1512. 9. Udo Rau, Glucan secreted by fungi, Turkish Electronic Journal of Biotecchnology, vol 2 (2004), 30–36. 10. Yuchun Wang and Brain Mcneil, pH effects on exopolysaccharide and oxalic acid production in cultures of Sclerotium glucanicum, Enzyme and Microbial technology, 17, 124– 130.