Tiểu luận Chuyển gen nâng cao chất lượng giống cây trồng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC DÂN LẬP VĂN LANG KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC Bài tiểu luận : GVHD : ThS. VÕ THỊ XUYẾN SVTH : 1. Nguyễn Ngọc Khánh 7. Phạm Ngọc Đan Thanh 2. Nguyễn Thanh Bá 8. Phạm Huỳnh Mai 3. Nguyễn Ngọc Minh Châu 9. Võ Hưng Minh Thư 4. Nguyễn Thị Kim Sa 10. Trần Thị Yến Vân 5. Nguyễn Thị Thương 11. Đặng Thị Bích Phương 6. Lê Thị Ngọc Tuyền 12.Trần Lê Đình Đại Nguyên TPHCM – 11/2009 I. GIỚI THIỆU CHUNG 1. CHUYỂN GEN LÀ GÌ ? Chuyển gen là đưa một đoạn DNA ngoại lai vào genome của một cơ thể đa bào, sau đó đoạn DNA ngoại lai này sẽ có mặt ở hầu hết các tế bào và được truyền lại cho thế hệ sau. Sự chuyển gene Sơ đồ cấu trúc gene chuyển biểu hiện - Enhancer : gene tăng cường. - ATG : vị trí khời đầu phiên mã. - SIG : trình tự tín hiệu. AAA : đuôi polyA. 2. THẾ NÀO LÀ MỘT CÂY CHUYỂN GEN ? - Cây chuyển gen là một thực vật mang một hoặc nhiều gen được đưa vào nhân tạo thay vì thông qua lai tạo. - Những gen được tạo đưa vào (gen chuyển) có thể được phân lập từ những loài thực vật có  quan hệ họ hàng hoặc từ những loài khác biệt hoàn toàn. 3. TẠI SAO PHẢI TẠO CÂY CHUYỂN GEN ? - Theo phương pháp truyền thống, nhà tạo giống tìm cách tổ hợp lại các gen giữa hai cá thể thực vật nhằm tạo ra con lai mang những tính trạng mong muốn. Phương pháp này được thực hiện bằng cách chuyển hạt phấn từ cây này sang nhuỵ hoa của cây khác. - Tuy nhiên phép lai chéo này bị hạn chế bởi nó chỉ có thể thực hiện được giữa các cá thể cùng loài hoặc có họ hàng gần. Phải mất nhiều thời gian mới thu được. Những kết quả mong muốn và thường là những đặc tính quan tâm lại không tồn tại trong những loài có họ hàng gần. - Kỹ thuật chuyển gen cho phép nhà tạo giống cùng lúc đưa vào một thực vật những gen mong muốn từ những sinh vật sống khác nhau, không chỉ giữa các loài cây lương thực hay những loài có họ gần. Phương pháp hữu  hiệu này cho phép các nhà tạo giống thực vật đưa ra giống mới nhanh hơn và vượt qua những giới hạn của tạo giống truyền thống. Nhìn chung, việc ứng dụng cây chuyển gen đã có những lợi ích rõ rệt như sau: Tăng sản lượng. Giảm chi phí sản xuất. Tăng lợi nhuận nông nghiệp. Cải thiện môi trường. - Những cây chuyển gen “thế hệ thứ nhất” đa giúp giảm chi phí sản xuất. - Ngày nay, các nhà khoa học đang hướng đến việc tạo ra những cây chuyển gen “thế hệ thứ hai” nhằm tăng các giá trị dinh dưỡng hoặc có những đặc điểm thích hợp cho công nghiệp chế biến. Lúa gạo giàu vitamin A và sắt. Khoai tây tăng hàm lượng tinh bột. Vaccine thực phẩm (edible vaccine) ở ngô và khoai tây. Những giống ngô có thể trồng được trong điều kiện nghèo dinh dưỡng. Dầu ăn có lợi cho sức khoẻ hơn từ đậu nành và cải dầu. II. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN - Hiện nay có 2 phương pháp chuyển gen : + Chuyển gen gián tiếp ( nhờ vi sinh vật ). + Chuyển gen trực tiếp. - Quá trình chuyển gen được thực hiện qua các bước sau : Xác định gen liên quan đến tính trạng cần quan tâm. Phân lập gen (PCR hoặc sàng lọc từ thư viện cDNA hoặc từ thư viện genomic DNA). Gắn gen vào vector biểu hiện (expression vector) để biến nạp. Biến nạp vào E. coli. Tách chiết DNA plasmid. Biến nạp vào mô hoặc tế bào thực vật bằng một trong các phương pháp khác nhau đã kể trên. Chọn lọc các thể biến nạp trên môi trường chọn lọc. Tái sinh cây biến nạp. Phân tích để xác nhận cá thể chuyển gen (PCR hoặc Southern blot) và đánh giá mức độ biểu hiện của chúng (Northern blot,Western blot, ELISA hoặc các thử nghiệm in vivo khác...). - Nguyên liệu để thực hiện sự biến nạp là các tế bào thực vật riêng lẽ, các mô hoặc cây hoàn chỉnh. A. CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT BẬC CAO BẰNG PHƯƠNG PHÁP GIÁN TIẾP NHỜ AGROBACTERIUM Các cây chuyển gen hiện nay được tạo nên bằng nhiều cách khác nhau, tuy nhiên đa số được thực hiện bằng hệ thống chuyển gen Agrobacterium. I. Agrobacterium - Agrobacterium tumefaciens là loại vi khuẩn hình que, gram âm, có nhiều trong đất, thuộc họ Rhizobiaceae, có khả năng gây u ở thực vật, còn A.rhizogenes gây bệnh rể tóc. - A.tumefaciens có một plasmid dài 120-150kb, quyết định đặt tính gây u, được gọi là plasmid Ti. A.hizogenes cũng có plasmid với kích thước tương tự, kích thước tạo rễ tơ được gọi là plasmid Ri. Agrobacterium tumefaciens - A.tumefaciens và A.rhizogenes gần đây được chú ý nhiều do chúng là hệ thống chuyển gene sẵn có trong tự nhiên từ tế bào procaryote sang eucaryote. Một phần DNA của plasmid Ti hoặc Ri được gắn vào bộ gene của thực vật và làm xuất hiện khối u hay rễ tơ. Người ta sử dụng plasmid Ti và Ri làm các vector chuyển gene để thay đổi các tính trạng di truyền ở thực vật theo ý muốn. Plasmid Ti hay Ri với cùng T có chứa một hay nhiều gene lạ được đưa lại vào Agrobacterium tumefaciens rồi vi khuẩn này sẽ chuyển và gắn chúng vào bộ gene tế bào thực vật . 1. Đặc diểm cấu trúc của Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid - Hiện tượng hình thành các khối u ở thực vật là do cây bị nhiễm vi sinh vật đất A. tumefaciens qua các vết thương. Phân tích các u cho thấy trong u có sự hình thành một số vật chất mới như: nopaline, octoine gọi chung là opine. Các chất này không tồn tại ở các cây bình thường khác. Một số khối u do vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tạo ra. - Khi xem xét các vi khuẩn A. tumefaciens chúng cũng giống các loại vi khuẩn thông thường khác là đều chứa các plasmid (một dạng DNA vòng nằm ngoài nhiễm sắc thể vi khuẩn, có khả năng nhân bản độc lập). Chắc chắn plasmid này đã chuyển vào tế bào thực vật các vật chất di truyền gây bệnh u cho cây, do vậy người ta gọi chúng là Ti-plasmid (Tumor inducing plasmid). Ti-plasmid đã chuyển một đoạn DNA của Ti-plasmid nhập vào gen của cây. - Ti-plasmid là một plasmid lớn với kích thước khoảng 200kb. Trên Ti-plasmid có đoạn T-DNA (tumor DNA) được giới hạn bằng bờ phải (right border) và bờ trái (left border). Trình tự nucleotid của bờ phải và bờ trái tương tự nhau. T-DNA là một đoạn có kích thước 25kb chứa các gen tổng hợp opine và đoạn này sẽ được chuyển vào tế bào thực vật gắn vào bộ nhiễm sắc thể của tế bào cây chủ và gây ra bệnh u. Ngoài T-DNA, trên Ti-plasmid còn có vùng vir (vir region) chịu trách nhiệm hoạt động lây nhiễm, chuyển nạp (conjugative transfer) và tiêu hóa opine (opine catabolism). Cấu trúc Ti - plasmid + Vùng T : vùng phát sinh DNA vận chuyển. Các gene này khi chuyển vào cây và biểu hiện trong bộ nhân của thực vật. + Rhiz: Các gene tham dự vào sự hình thành rể. + ORI: Nguồn gốc sao chép ở Agrobacterium + VIR: Các gene mà sự biểu hiện của chúng liên quan đến mối tương tác giữa vi khuẩn gây bệnh và tế bào thực vật, theo sự vận chuyển của vùng T. 2. Sự hình thành khối u ở thực vật bởi Agrobacterium tumefaciens - Bản chất tự nhiên của vi khuẩn A.tumefaciens là xâm nhập vào những vị trí tổn thương đa số trên cây hai lá mầm và gây ra khối u tại những vị trí tổn thương đó. - Vi khuẩn xâm nhiễm vào vết thương, kích thích hình thành các chất độc có bản chất phenol (Acetosyringon, Hydroxyl acetosyringon). Chất này có tác dụng làm lành vết thương, vừa là kết hợp chất dẫn dụ vi khuẩn xâm nhập , lại có vai trò như một chất kích hoạt vùng gen vir thuộc Ti-plasmid kích thích cho sự cắt đoạn T-ADN (tại vùng bờ trái và bờ phải) để gắn vào genom thực vật. - Trong T-ADN có chứa 3 vùng gen quan trọng quy định sự hình thành khối u. Đó chính là vùng gen iaam và iaah kích thích cho sự hình thành IAA và vùng gen ipt kích thích cho sự hình thành xytokinin. Tỷ lệ auxin/xytokinin kích thích sự hình thành callus tạo nên các khối u. Sự tạo thành khối u ở thực vật do bị nhiễm Agrobacterium II. Phương pháp chuyển gen 1. Cơ sở của phương pháp chuyển gen nhờ Agrobacterium - Sự thiết lập mối quan hệ giữa một cây và Agrobacterium được bắt đầu bằng vết thương của thực vật. Các tế bào thực vật bị thương sản sinh ra các chất phenol như là acetosyringon có tác dụng gây cảm ứng vùng Vir của plasmid Ti/Ri của Agrobacterium.Vùng Vir bao gồm 7 locus( từ Vir A đến Vir G). - Sau khi hòa nhập vào bộ gene tế bào thực vật. Các gene của DNA-T biểu hiện ở tế bào thực vật: chúng mã hóa cho tổng hợp chất điều hòa sinh trưởng do đó gây u hoặc rễ tơ và mã hóa tổng hợp các opine. Khi phần DNA-T chứa các gene liên quan đến chức năng tạo khối u được cắt bỏ khỏi plasmid Ti, chúng vẫn giữ nguyên khả năng chuyển gene lạ vào thực vật. Các plasmid Ti như vậy gọi là plasmid lành, hiện nay được dùng nhiều vì việc chuyển gene không kèm theo hiện tượng gây u. Sự tương tác giữa Agrobacterium với tế bào thực vật và cơ chế chuyển T-DNA. - Sự chuyển gen ở thực vật dùng A. tumefaciens dựa trên nguyên lý như hình sau. - Việc sử dụng Agrobacterium cho phép cải thiện đặc tính di truyền thực vật. Để thực hiện được việc chuyển gene, cần thiết phải có: Các gene có thể gắn trên T-DNA, tạo gene chọn lọc như kháng kháng sinh và thường loại bỏ gene tổng hợp hormone. Tế bào có khả năng tiếp nhận và liên kết với T-DNA để tạo thành thể chuyển gene . Tế bào chuyển gene có khả năng tái sinh và biểu hiện gene được chuyển. 2. Phương pháp chuyển gen 2.1.DỤNG CỤ – THIẾT BỊ – VẬT LIỆU Vật liệu - Chồi cây thuốc lá giống cv.Xanthi, Petite. - Dùng Argobacterium tumefaciens dòng LBA4404 hay EHA101. Dụng cụ – Thiết bị - Trạm nuôi cấy mô. - Phòng dưỡng cây có ánh sáng và nhiệt độ 240C . - Phòng tối 280C hay nhiệt độ có thể nâng đến 320C. - Máy lắc, tủ lạnh bảo quản môi trường dinh dưỡng và vi khuẩn - Kính hiển vi, đĩa petri, bình tam giác vô trùng. - Dao và kéo vô trùng, pipet, giấy lọc, hộp nhựa Mangenta GA-7 ( 24-96 hộp). - Ống ly tâm ,màng lọc. - Kanamycin, X-gluc, Triton X-100. Hộp nhựa Mangenta GA -7 Máy lắc và bình tam giác Đĩa petri Kháng sinh Kanamycin X - Gluc Môi trường MS SM LB + Thành phần : khoáng đa lượng và vi lượng MS, Fe-EDTA, vitamin B5, sucrose 3%,gelrite 0,2%, MES 3mM + Phân loại : MS-K : MS + kanamycin 150ppm MS-H : MS + hydromycinB 15ppm + Thành phần : khoáng đa lượng và vi lượng MS, Fe-EDTA, vitamin Ms, sucrose 3%, TC agar 0,8%, p-CPA 0,1ppm, 2iP 7.5ppm. + Phân loại : SM-C : carbenicillin 500ppm SM-CK300 : carbenicillin 500ppm + kanamycin 300ppm SM-CH20 : carbenicillin 500ppm + hydromycin 20ppm + Thành phần : Trypton 10g/l, yeast extract 5g/l, glucose 1g/l, agar 1,5%, NaCl 10g/l. + Phân loại : LBA4404 : tetracylin 1-5ppm EHA101 : tetracylin 10-20ppm 2.2.CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG – ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY – CHỦNG VI SINH VẬT Chuẩn bị môi trường: - Chuẩn bị và hấp vô trùng môi trường cơ bản. Làm mát môi trường ở 500C. - Tất cả các chất kháng sinh đều được lọc vô trùng. - Rót môi trường vào đĩa petri, 25-30ml cho một đĩa. Chuẩn bị thuốc thử GUS: - Chuẩn bị buffer chuẩn : bắt đầu bằng 2 dung dịch, 100mM phosphat K (KH2PO4) và K2HPO4. Dần dần cho KH2PO4 vào dung dịch K2HPO4 và chỉnh pH=7. Giữ buffer phosphat ở pH=7 ở nhiệt độ 4 độ C. - Chuẩn bị Triton trong cồn. Trộn 10ml X-100 + 40ml cồn + 50ml nước.Giữ ở nhiệt độ phòng. - Chuẩn bị X-Gluc : 10mg X-Gluc trong 1ml dimethylsulfoxide - Trộn hỗn hợp trên .Với 100ml trộn với 94ml buffer phosphat, 1ml Triton và 5ml X-Gluc.Làm lạnh GUS khi cần thiết.Dùng để rửa rất tốt. Điều kiện nuôi cấy : a. Vật liệu : - Chồi sinh trưởng của cây thuốc lá invitro, sử dụng môi trường MS trong hộp nhựa Magenta GA-47 . - Duy trì ở phòng dưỡng cây có nhiệt độ 240C, thời gian chiếu sáng/tối là 16/8 giờ, cường độ chiếu sáng là 55µmol/m2/s, sử dụng nguồn đèn có ánh sáng trắng. - Cấy truyền chồi bằng chồi ngọn, cấy truyền cách khoảng 6 tuần. b. Chuẩn bị nuôi cấy Agrobacterium : - Dùng Agrobacterium dòng LBA4404 hay EHA101 có vector kép và gene chọn lọc như neo (NTPII, chọn lọc kháng kanamycin ở cây thuốc lá). Nuôi cấy 2 ngày trong tối, nhiệt độ 280C trên mơi trường agar LBA trong đĩa petri với nồng độ tetracylin thích hợp để duy trì plasmid. - Cấy chuyển cụm đơn vi khuẩn Agrobacterium vào 25ml môi trường LB không có kháng sinh trong một bình tam giác. - Đặt bình tam giác trên máy lắc, lắc với tốc độ 150-250rpm, ở 280C. - Hoà tan 25ml thể nuôi cấy với 10-15ml môi trường LB lỏng mới. Đặt dịch huyền phù Agrobacterium trên máy lắc 3-4 giờ ở 280C ( mật độ 8,0-1 x 109 tế bào /ml). 2.3. PROTOCOL Chuẩn bị mô lá và đồng nuôi cấy: - Chuẩn bị mẫu lá (5x5mm) của chồi cây thuốc lá 4-5 tuần tuổi. Lá mở trên ngọn thì thích hợp làm mẫu nuôi cấy. Đặt mẫu lá vào môi trường MS. - Khi các mẫu lá đã được chuẩn bị xong, cấy chuyển vào dịch huyền phù Agrobacterium.Cần phải chắc chắn rằng các mẫu lá này ngập trong dịch huyền phù vài giây. - Đặt mẫu lá nuôi cấy trên giấy lọc vô trùng và nuôi cấy chung trên môi trường SM được chuẩn bị trên đĩa petri, có chứa 30-40 lá trên 1 đĩa. - Dán kín đĩa petri bằng parafilm và đặt trong phòng dưỡng cây 2-3 ngày. Chọn lọc và tái sinh cây thuốc lá chuyển gen: - Sau khi cùng nuôi cấy, rửa sạch mẫu trên môi trường lỏng SM-C. - Cấy chuyển mẫu lá vào môi trường SM-CK300 để chọn lọc dòng kháng kanamycin. - Dán kín đĩa petri và đặt trong phòng dưỡng cây. - Một hay hai lần trong 1 tuần, khảo sát mẫu lá xem có dấu hiệu hoại mẫu không. Trong vòng 2-3 tuần, chồi mẫu xuất hiện xung quanh mép mẫu lá, mẫu lá sẽ có hình dạng cuốn xoắn trên môi trường có kanamycin.Kiểm tra mẫu nuôi cấy khi môi trường có kháng sinh vẫn duy trì hình dạng mẫu xanh và khoẻ, sẽ tái sinh cụm chồi chung quanh mẫu lá trên vết cắt. - Khi chồi cao 10-15mm, tách chồi và cấy vào môi trường tạo rễ MS-K trong hộp Magenta GA-47 và duy trì chọn lọc kanamycin. - Chồi được chuyển gen sẽ phát triển trong môi trường tạo rễ. Rễ phát sinh trong 7-14 ngày sau khi cấy. - Khi cây invitro cao ít nhất 3cm, cấy chuyển ra đất. - Sau khi cấy ra chậu, duy trì độ ẩm cao và dần dần thích nghi với điều kiện độ ẩm của vườn ươm. Xác định sự chuyển gen: - Chồi được chuyển gene sẽ duy trì độ xanh khoẻ trên môi trường chọn lọc, trong khi chồi không được chuyển gene không tạo rễ và xuất hiện màu trắng. - Gene đánh dấu được sử dụng nhiều nhất là gene mã hóa cho enzyme β-Glucuronidase. Enzyme này ít có ở thực vật trong điều kiện tự nhiên. Nếu đưa được gene GUS vào bộ gene của thực vật và gene này được biểu hiện thì trong mô thực vật sẽ xuất hiện enzyme β-Glucuronidase, chất này sẽ tạo ra một phản ứng màu đặt trưng với cơ chất X-gluc.. - Bằng cách sử dụng thuốc thử GUS (gene GUS được dùng như một vector) ta có thể phát hiện được những mẫu đã được chuyển gen : + Đặt mẫu mô (mẫu lá) trong nhiều hộp nhựa khác nhau. + Thêm phẩm nhuộm GUS : 200µl/hộp nhựa, dùng 24 hộp nhựa hay 50ml/hộp kín, dùng 96 hộp kín. Cẩn thận cho mô lá chìm ngập trong phẩm nhuộm. + Cấy ở nhiệt độ phòng 370C. + Khảo sát những mẫu mô dưới kính hiển vi.Có màu xanh khi enzyme β-glucuronidase phản ứng với thuốc thử GUS. Phần mô có màu xanh đậm thể hiện mô được chuyển gen. Kết quả của quá trình chuyển gen: - Chồi thuốc lá được chuyển gene sẽ được tái sinh khi cùng nuôi cấy với Agrobacterium tumefaciens, phụ thuộc vào hệ thống chọn lọc và khả năng tái sinh cây thuốc lá in vitro. Ghi nhận sự thể hiện gen như gene GUS hoạt động. - Cây thuốc lá chuyển gene sinh trưởng, phát triển cho đến lúc chín thuần thục. Quá trình chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium 3. Di truyền và nhân cây thuốc lá chuyển gene - Sau khi vỏ bao hạt khô. Thu hạt do tự thụ hay thụ phấn chéo trong vườn ươm. - Khử trùng bề mặt trong 30 phút với cồn 70% trong 10-12 phút trong dung dịch khử trùng 33%, rửa sạch 2 lần với nước cất vô trùng. - Cấy hạt nảy mầm trong đĩa petri, dùng môi trường MS-K. - Sau 10-14 ngày, đánh giá tỷ lệ nảy mầm và có lá xanh. + Cây bị hạt trắng thể hiện tính mẫn cảm với kháng sinh ( không chuyển gene). + Cây hạt có màu xanh thể hiện tính kháng với kháng sinh và có lá màu xanh do phản ứng của gene GUS. - Ở cây tự thụ, thể hiện quy luật di truyền của Mendel với một gene trội ở trên một locus là 3:1, với 2 gene ở trên loci không giống nhau theo tỷ lệ 15:1. Với 3 gene ở trên các loci khác nhau có tỷ lệ 63 :1.Tỷ lệ phân bố thể hiện số lượng loci mà trên đó gene có tính kháng sinh được thể hiện. Số lượng bản copy là số lượng gene thể hiện trong genome và được phân tích bằng phương pháp Southern. Số lượng copy có khuynh hướng kiên kết với một locus.Tỷ lệ liên kết này có thể khác nhau, thường thấp. III. Ưu điểm và hạn chế của phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium - Hiện nay có rất nhiều kỹ thuật chuyển gen khác nhau vào tế bào song kỹ thuật chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumerfacien vẫn được ứng dụng rộng dãi là nhờ những ưu điểm sau : Không đòi hỏi dụng cụ đặc biệt. Số lượng bản copy thấp và ổn định ở thế hệ con cháu. Dễ thao tác invitro, dễ làm. Đây là kỹ thuật đơn giản, chi phí thấp. - Còn hạn chế của phương pháp này là do Agrobacterium có phổ tấn công có giới hạn, nó có thể gây khối u cho cả cây khỏa tử và cây hai lá mầm nhưng lại không thể gây khối u cho cây một lá mầm. Lý do cây một lá mầm là nhóm thực vật tích lũy nhiều cơ chế kháng bệnh hơn các cây hai lá mầm như vách cellulose tẩm silic làm tăng độ bền; hoặc khi bị thương, phần mô bị thương có xu hướng hóa gỗ để bảo vệ chứ không phân chia mạnh để tái tạo hoặc tiết hợp chất phenol như cây hai lá mầm. Tuy nhiên, cho đến thời điểm này, người ta đã tìm được nhiều chủng Agrobacterium có khả năng chuyển gene cho một số cây một lá mầm như bắp, lúa, cỏ, mía, lan…ứng dụng tạo ra gạo vàng, phong lan phát sáng… B.CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT BẬC CAO BẰNG PHƯƠNG PHÁP TRỰC TIẾP vào protoplast thực vật bằng siêu âm. vào mô tế bào thực vật bằng cách lắc với silicon carbide. Chuyển gene trực tiếp vào mô thực vật bằng điện di. qua ống phấn cây lúa . vào tế bào và mô thực vật bằng súng bắn gene. I. Chuyển gen trực tiếp vào protoplast thực vật bằng siêu âm. Nguyên tắc: Sau khi tách vỏ cellulose, protoplast được xử lý nhẹ bằng siêu âm có hiện diện của DNA ngoại lai. Sóng siêu âm giúp DNA đi vào tế bào và thể hiện. Quy trình: 1. Tách protoplast từ mô thịt lá. Treo protoplast đã tinh sạch trong môi trường có chứa 21% sucrose, mật độ 106/ml. 2. Cắm đầu siêu âm của máy phát siêu âm ngập độ 3mm trong huyền phù protoplast và cho máy siêu âm phát với tần số 20 KHz theo từng nhịp ngắn 110 millisecond.Năng lượng tỏa ra tương ứng với 15W và 0.32W/cm2 (acoustic power), 5-10% năng lượng tỏa ra được chuyển qua nhiệt năng, làm cho huyền phù nóng thêm 2-30C.Tổng thời gian tác động siêu âm từ 500-900 millisecond. 3. Protoplast được nuôi trên đĩa Petri trong môi trường thích hợp để xác định tỷ lệ chết do siêu âm phá vỡ màng. Ở điều kiện nói trên, khoảng 30-50% protoplast bị chết. Số protoplast còn lại tiếp tục phân chia và tái sinh. 4. Thử các phản ứng với gen chỉ thị (ví dụ GUS) hoặc đặt protoplast tái sinh trên môi trường chọn lọc (kanamycine) để xác định các protoplast đã được chuyển gen. II. Chuyển gene trực tiếp vào mô tế bào thực vật bằng cách lắc với silicon carbide Tinh thể silicon carbide có độ cứng rất cao, khi lắc với tế bào có tác dụng như các mũi kim nhỏ giúp cho DNA bên ngoài có thể xâm nhập vào bên trong tế bào và thể hiện. III. Chuyển gene trực tiếp vào mô thực vật bằng điện di. Phương pháp chuyển gen trực tiếp vào mô thực vật bằng điện di do Ahokas(1989) đề xuất và Griesbach(1994) cải tiến. Quy trình: 1.Protocom kích thước khoảng 2mm, chồi nách kích thước tương tự, phôi hạt hay phôi soma có thể dùng để chuyển gen. 2. DNA ngoại lai hoà trong 0.5% agarose, đệm 0.1 ×TAE. Nồng độ DNA là 1mg/ml. Khoảng 150ml hỗn hợp agarose – ADN đệm đã làm lỏng ở 1000C và để cho đóng rắn trong một ống micropipette. Ống này nối với cực âm của nguồn điện.Một ống micropipette tương tự được đổ 150µl hỗn hợp agarose - đệm, nhưng không chứa ADN và nối với cực dương của nguồn điện. Phần trống còn lại của hai ống được nạp gần đầy bằng đệm 0.1 × TAE. + Thời gian chuyển gen dưới 10 phút + Cường độ dòng điện 0.5 milliampe – 1.0 milliampe cho đỉnh sinh trưởng hay 1 protocorm. + Rửa các cation tích luỹ với số lượng lớn ở đỉnh sinh trưởng hoặc protocorm bằng cách ngâm hoặc rửa một số lần trong nước cất sau khi kết thúc điện di. -Trường hợp protocom và phôi soma cần giữ điều kiện vô trùng trong quá trình chuyển gen để sau đó tiếp tục nuôi cấy trên các môi trường chọn lọc, tái sinh cây hoàn chỉnh. - Trường hợp đỉnh sinh trưởng cây đang trồng trong chậu: để đỉnh sinh trưởng lớn và theo dõi gen chuyển ở các lá hình thành sau đó hoặc các thế hệ sau. Ống phấn cây lúa IV. Chuyển gene trực tiếp qua ống phấn cây lúa - Phương pháp này còn được xem là phương pháp chuyển không qua nuôi cấy mô. Chuyển gen trực tiếp thông qua ống phấn được nhóm Ray Wu đại học Cornell (Mỹ) báo cáo thành công trên cây lúa, tiếp theo các công trình sơ bộ với ADN tổng hợp của hai tác giả Trung Quốc Duan và Chen (1985). - Đây là phương pháp lợi dụng ống phấn để chuyển vector mang gen đi cùng tế bào sinh dục đực ( tinh tử) để kết hợp với tế bào trứng tạo hợp tử mang gen ngoại lai được chuyển vào. Sau đó, hợp tử sẽ phát triển thành hạt. Hạt nảy mầm và phát triển thành cây chuyển gen và được di truyền cho các thế hệ sau. - Chuyển gen qua ống phấn tốt nhất thực hiện ngay sau khi quá trình thụ phấn xảy ra ở noãn, nhưng tế bào sinh dục cái chưa kịp phân chia. Nếu làm được như vậy sự chuyển gen sẽ được thực hiện đối với một tế bào sinh sản cái (trứng) duy nhất và sau khi tái sinh cây sẽ tránh xuất hiện thể khảm. Cần cắt hoa lúa sao cho không làm tổn thương bầu nhị, nhưng chỗ cắt trên vòi nhị cái phải tương đối gần với noãn bào để DNA có thể xâm nhập dễ dàng. Thời gian từ lúc hoa nở đến lúc cắt phài đủ để hạt phấn mọc, phát triển qua vòi nhị và thụ tinh ( khoảng 1-2 giờ ). V. Chuyển gen trực tiếp vào tế bào và mô thực vật bằng súng bắn gene - Súng bắn gen (Gene gun) là một thiết bị sử dụng để đưa thông tin di truyền vào tế bào, được thiết kế đầu tiên cho biến nạp DNA ngoại lai vào tế bào thực vật và được phát triển vào đầu thập niên 1980 do các nhà thực vật học ở Ðại học Corrnell cùng với các nhà nghiên cứu ở Corrnell Nanofabrication Facility, Newyork, USA. Súng bắn gene - Nguyên tắc của súng bắn gen là tạo một luồng khí để đẩy các viên đạn có kích thước nhỏ mang các gen mong muốn ( thường làm bằng tungsten hoặc vàng ). Chúng có V= 1300m/s xuyên qua các lớp tế bào, mô để xâm nhập vào genome thực vật. - Mục tiêu của súng bắn gen thường là callus của các tế bào thực vật giống nhau sinh trưởng trong môi trường gel trên đĩa petri. Sau khi các hạt tungsten đã va chạm vào đĩa, gel và callus bị phá vỡ nhiều. Tuy nhiên một số tế bào không bị phá vỡ khi va chạm mạnh và đã tiếp nhận các hạt tungsten được bao bọc DNA,cuối cùng các phân tử DNA ngoại lai đã xâm nhập và hợp nhất vào nhiễm sắc thể thực vật. Các tế bào từ đĩa petri được tập hợp lại và chọn lọc các tế bào đã hợp nhất thành công và biểu hiện DNA ngoại lai bằng các kỹ thuật hóa sinh hiện đại như sử dụng gen chọn lọc nối tiếp và Northern blots. - Phương pháp này có ưu điểm là thao tác dễ dàng, có thể chuyển gen vào nhiều loại tế bào và mô, các tế bào được biến nạp có tỉ lệ sống sót cao, cho phép đưa các gen vào tế bào ở vị trí mong muốn....Do vậy nó được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực. Chuyển gen ở cây lúa nhờ súng bắn gen Một số mẫu súng bắn gene Súng bắn gene PDS-1000 b. Súng bắn gene PDS-1000He - Ở mẫu súng này, helium nén được dùng để gia tốc viên đạn lớn they cho thuốc súng.Một lưới chặn bằng kim loại được đặt trên bệ chặn. Vi đạn được trộn với DNA và làm khô trên một đĩa kim loại nhỏ, sau đó gắn lên đầu viên đạn lớn. c. Súng bắn gene Sautter - Do Sautter đề nghị 1991. Để tránh các yếu tố gây ra sự không đồng đều về vận tốc vi đạn.Súng Sautter không dùng viên đạn lớn mà tạo ra các điều kiện để các hạt vi đạn lơ lửng trong pha khí ngay trước khi chúng được gia tốc. - Phương pháp này thích hợp khi cần bắn gene chính xác vào một diện tích mô nhỏ ( đỉnh sinh trưởng ).Có thể thiết kế để quan sát dưới kính lúp. d. Súng bắn gene Finer - Loại súng này gia tốc trực tiếp vi đạn bằng helium áp suất cao và chân không. e. Súng bắn gene đơn giản chế từ súng hơi - Vi đạn và DNA được đặt trên một màng mỏng, đặt giữa nguồn tạo áp suất và buồng giảm áp. Buồng giảm áp làm bằng nhựa PVC dày chịu chân không 500mm thuỷ ngân. Trong buồng có một lưới chắn đặt cố định giữa màng vi đạn và DNA với mẫu thực vật.Nguồn tạo áp là một giọt nước nhỏ ( 10 micro lít ) đặt giữa hai cực của một điện dung cao áp mF. Hiệu thế phóng điện là 14KV. Khi phóng điện nước bốc hơi đột ngột và tạo nên sức đẩy mạnh, đầy màng đập vào lưới chắn.Màng bị lưới giữ lại nhưng các viên đạn nhỏ bọc DNA vẫn tiếp tục bay qua và xuyên vào mục tiêu. f. Súng bắn gene đơn giản Morikawa g. Dùng tế bào vi khuẩn làm vi đạn - Tế bào vi khuẩn E.coli và A.tumefaciens có thể được sử dụng thay cho vi đạn trong kỹ thuật bắn gene để thực hiện chuyển gene ngoại lai vào tế bào. - Trước khi sử dụng, dùng phenol để giết chết vi khuẩn.Hiệu suất chuyển gene tăng nếu trộn lẩn tế bào vi khuẩn với vi đạn tungsten hoặc vàng. - Tuy nhiên, do tỷ trọng thấp nên hiệu suất chuyển gene bằng bắn trực tiếp tế bào vi khuẩn vào tế bào thực vật thấp hơn dùng plasmid DNA chiết từ vi khuẩn để bọc vi đạn rồi bắn. Khi trộn vi đạn tungsten với tế bào vi khuẩn ở một tỷ lệ thích hợp, hiệu suất này tăng lên rõ rệt (có khi gấp 20 lần không trộn). Hiện tượng này được giải thích là do sự kết dính giữa vi đạn có tỷ trọng cao với tế bào vi khuẩn giúp chúng có gia tốc cao hơn và khản năng xuyên nhập vào tế bào thực vật lớn hơn. Các bước tiến hành 1. DỤNG CỤ –THIẾT BỊ – VẬT LIỆU Vật liệu - Vector pBARGUS nhận từ USDA Plant Gene Expression Center. - Hạt ngô có kiểu gen Hi-II nhận từ Monsanto Co.Mô sẹo ngô BMS nhận từ American Type Culture. Dụng cụ – thiết bị - Hệ thống bắn gen PDS-1000He. - Kit thích hợp với hệ thống phân huỷ, kit AX-PC để tinh sạch plasmid DNA. - Tungsten M-17 hay vi đạn bằng vàng. - Mảnh vụn Rupture 650psi. - Mảng vụn, lưới lọc kích thước 750µM. - Cột tách phase ngược , vi ly tâm, bơm chân không. - Giấy lọc Whatman, bình tam giác và đĩa petri, ống ly tâm vô trùng. - Phytagar, Gelrite, Ignite, X-Gluc, Bis-benzimide trihydrochloride. GM( môi trường nảy mầm ) BMS(môi trường nuôi cấy dịch huyền phù BMS) Hi-II-C (môi trường nuôi cấy mô sẹo) Hi-II-R (môi trường tái sinh Hi-II) Khoáng đa lượng và vi lượng MS, Fe-EDTA, vitamin MS, sucrose 4%, gelrite 0,2%. Khoáng đa lượng và vi lượng MS, Fe-EDTA, Thiamine.HCl 0,5pmm ,L-Asparagine 150pmm, sucrose 2%, 2,4-D 2pmm. + BMS-C : BMS + Gelrite 0,3% (BMS-C) +Suspension-I hay Callus-I (BMS-S-I hay BMS-C-I) +Suspension-B hay Callus-B (BMS-S-B hay BMS-C-B) +Suspension-S (BMS-S-S) Khoáng đa lượng và vi lượng N6, Fe-EDTA, vitamin Erikson, sucrose 2%, Gelrite 0,3%, L-Proline 3g/l, 2,4-D 1pmm + Callus-B ( Hi-II-C-B) Khoáng đa lượng và vi lượng N6, Fe-EDTA, vitamin Erikson, sucrose 4%, Gelrite 0,2%, IAA 1pmm, Zea 0,5pmm. + Regeneration-B (Hi-II-R-B) Môi trường Chuẩn bị các dụng cụ - X-Gluc : GUS được hình thành trên cụm mô sẹo phát triển chỉ thị sự chuyển gene. Vector thường gắn gene GUS. Dùng 25mg mẫu mô và nhuộm màu với 400µl dung dịch X-Gluc. Nuôi cấy trong bóng tối, ở nhiệt độ 370C trong 4-6 giờ (dung dịch X-Gluc được pha chế theo McCabe et al, 1988). Hoà tan trong 190ml nước cất vô trùng và các thành phần sau, chỉnh pH = 7 và thêm cho đủ nước cất đếm 200ml. Thành phần Hàm lượng EDTA 0,584g Triton X-100 0,2ml NaH2PO4 2,4g K4Fe(CN)6.3H2O) 0,042g X- Gluc 0,1g Bialaphos - Bialaphos và Ignite + Bialaphos được tinh sạch bằng cách hoà tan 10g trong 100ml nước.Dung dịch có màu xanh cho chạy qua cột Baker 10-SPE, thu được dung dịch không màu + Ignite có chứa tỷ lệ hoạt tính 20% glufosinate và không cần tinh sạch. Sử dụng 25µ/l Ignite chứa đựng 5pmm glufosinate - Vector DNA Plasmid DNA tinh sạch bằng phương pháp tinh sạch plasmid và cosmid Nucleobonde AX-PC-kit. Hàm lượng DNA được định lượng bằng phương pháp chuẩn. DNA được pha loãng theo tỷ lệ 1/20 và được định lượng với DNA chuẩn bằng bis-benzimide trihydrochloride. Điều kiện nuôi cấy - Nuôi cấy dịch huyền phù ngô BMS + Tạo dịch huyền phù bằng cách lấy 200mg trọng lượng tươi mô sẹo ngô BMS trong 20ml môi trường nuôi cấy dịch huyền phù BMS-S trong bình tam giác. + Duy trì nuôi cấy trên máy lắc với tốc độ 150rpm, trong phòng dưỡng cây ở nhiệt độ 280C, có 16 giờ chiếu sáng với cường độ chiếu sáng 100µmol/m2/s.Chọn những tế bào có kết cụm với nhau. + Tách môi trường dịch huyền phù và thay bằng môi trường mới hàng tuần ngay cả lúc tế bào phát triển nhanh. + Cấy truyền hàng tuần với tỷ lệ 10ml tế bào với 30ml môi trường mới. Sơ đồ tóm tắt quá trình nuôi cấy dịch huyền phù - Chuẩn bị mô sẹo ngô Hi-II để tạo cây chuyển gene + Tạo mô sẹo dạng xốp cấp II bằng cách nuôi cấy phôi chưa chín Hi-II có kích thước 1,5-2mm trên môi trường nuôi cấy mô sẹo Hi-II-C. + Tách phôi với phôi chưa chín thuần thục có phân nhánh thích hợp nuôi cấy với môi trường. + Nuôi cấy trong 14 ngày trong tối ở nhiệt độ 280C, có khoảng 90% phôi Hi-II tạo mô sẹo có khả năng phát sinh phôi. Sơ đồ quá trình chuẩn bị mô sẹo tạo cây chuyển gene + Chọn lọc mô sẹo sinh trưởng nhanh, xốp và có chứa tế bào tiền phôi. Mô sẹo được cấy truyền, có trọng lượng 150mg/cụm trên môi trường mới Hi-II-C và duy trì nuôi cấy trong 14 ngày đạt được sản lượng 2-1,5g mô sẹo trên mỗi cụm.Mô sẹo này được dùng trong thí nghiệm chuyển gene. 2. PROTOCOL : Sản xuất mô sẹo chuyển gene tế bào ngô BMS - Nuôi cấy trên môi trường BMS cho phép tế bào dịch huyền phù tăng gấp đôi sinh khối. - Dịch huyền phù được rửa và cấy chuyền hàng tuần với môi trường mới BMS-S trên máy lắc có tốc độ 105rpn, trong phòng dưỡng cây có 16 giờ chiếu sáng với cường độ 100µmol/m2/s ở nhiệt độ 280C. - Dịch huyền phù đồng nhất được nuôi cấy 2 ngày sau khi cấy truyền, trước khi cấy truyền dịch huyền phù được lọc qua lưới lọc có kích thước 710µm. Làm khô tế bào dịch huyền phù. Cân 100mg tế bào dịch huyền phù đồng nhất cho vào mỗi đĩa. Tái tạo dịch huyền phù trong môi trường lỏng BMS-S-S. Nâng thể tích dịch huyền phù theo tỷ lệ 1ml : 1mg tế bào. - Đặt mẫu tế bào ở trạng thái tĩnh trong 2 giờ trong môi trường BMS-S-S. Sau 2 giờ, nhỏ 1ml tế bào dịch huyền phù trên giấy whatman 617 được đặt trong 1 đĩa petri và chuẩn bị thêm 2 đĩa petri. Tập trung tế bào ở khoảng 1/3 đĩa về phía trung tâm để chuẩn bị bắn gen. Chuẩn bị thiết bị bắn gene, chuẩn bị những mảnh kim loại có sức chịu đựng 650psi. Sau khi bắn gene, đặt đĩa petri có tế bào lên giấy lọc được bắn gene vào phòng tối có nhiệt độ 280C trong 48 giờ cho phép tái sinh sau đó. - Có thể xác định sự chuyển gene GUS sau 48 giờ kể từ lúc bắn gene, cấy chuyển tế bào dịch huyền phù trên giấy whatman đã được bắn gene, chuẩn bị 10-15mg tế bào ở khoảng giữa tế bào trên giấy whatman, ngâm vào dung dịch X-Gluc và nuôi cấy ở 370C trong 24 giờ. Những điểm xanh sẽ xuất hiện trên tế bào. - Cấy chuyển tế bào còn lại và tái tạo tế bào dịch huyền phù trong 2ml BMS-S. Nhỏ 1ml tế bào dịch huyền phù vào đĩa petri nhỏ trên hai đĩa petri, một đĩa chứa môi trường BMS-C-I và một đĩa chứa môi trường BMS-C-B. Tất cả mẫu nuôi cấy được duy trì trên môi trường chọn lọc mô sẹo có bổ sung Ignite và Biaphalos. - Cụm tế bào xuất hiện sau 21 ngày. Khi nhìn thấy cụm tế bào, cấy truyền cụm tế bào vào một đĩa petri với môi trường mới BMS-C-B hay BMS-C-I. Ghi chú dòng tế bào chọn lọc, nguồn gốc cụm tế bào để không tái chọn lọc những cụm tế bào chuyển gene sau đó. - Hầu hết cụm tế bào chuyển gene được ghi nhận sau 8-10 tuần. Sản xuất cây ngô chuyển gene: - Tạo mô sẹo cấp II invitro của ngô có kiểu gene Hi-II - Sau giai đoạn 14 ngày nuôi cấy, cấy chuyển 150-200mg mô sẹo sang đĩa petri có môi trường Hi-II-C, chiếm diện tích trong đĩa 7-8cm2.Nuôi cấy mô sẹo một ngày để mô sẹo dính vào môi trường.Bắn gene với vi đạn có vector pBARGUS bao bọc những mảnh kim loại có sức chịu lực 650psi. Mô sẹo sau khi được bắn gene, đặt trong tối ở 280C. - Xác định sự chuyển gene GUS sau 24 giờ kể từ lúc bắn gene.Cấy chuyển 10-15mg mô sẹo ở giữa khối mô sẹo 150-200mg, ngâm trong dung dịch X-Gluc và nuôi cấy ở 370C trong 24 giờ. Những điểm xanh xuất hiện trên bề mặt mô sẹo. - Mô sẹo không phát triển trong vòng 10 ngày sẽ được tách bỏ.Mô sẹo có dấu hiệu sinh trưởng trong vòng 10 ngày sau khi bắn gene trên môi trường Hi-II-C-B ( khoàng 200mg trên một đĩa) và được nuôi cấy trong tối ở 280C trong 14-20 ngày. Cấy truyền mô sẹo trên môi trường mới Hi-II-C-B. Có thể không thấy mô sẹo sinh trưởng sau 2-3 tháng. - Những khối mô sẹo chuyển gene ổn định phát triển có khả năng phát sinh phôi cấp II trên môi trường có chất chọn lọc Biaphalos.Có những tế bào bắt đầu phát triển sau 3-4 tháng kể từ lúc bắn gene.Xác định khả năng chuyển gene bằng cách tách các khối mô sẹo thử với dung dịch X-Gluc xác định chuyển gen GUS, cho thấy xuất hiện xanh đậm.Mô sẹo còn lại được cấy chuyển sang môi trường có chất chọn lọc. - Cấy chuyển những khối mô sẹo được chọn lọc vào môi trường tái sinh Hi-II-R-B và được nuôi cấy trong tối 7 ngày ở 280C sau đó chuyển sang phòng dưỡng cây có 16 giờ chiếu sáng với cường độ µmol/m2/s ở 280C. Cây tái sinh cao 1-2 cm được cấy chuyển sang môi trường này mầm G để cây phát triển. Xác định sự chuyển gene GUS bằng cách thử với dung dịch X-Gluc. Ở giai đoạn cây có 3-4 lá, được cấy chuyển ra đất trong vườn ươm. Ở giai đoạn 8-10 lá, cây được phun thuốc diệt cỏ Ignite ( 1%, w/v ) để phát hiện gene BAR, chất Ignite sẽ gây hại cây không có mang gene BAR. Khi cây phát triển đến gian đoạn chín, hạt thụ phấn do tự thụ hay thụ phấn chéo. Gieo hạt trong vườm ươm để tiếp tục theo dõi. Kết quả Mô sẹo ngô BMS chuyển gene Nếu mẫu nuôi cấy thể hiện sự chuyển gene, thử GUS thấy có 1000-200 tế bào cho dương tính trên 1 đĩa petri. Mô BMS được nuôi cấy duy trì rên môi trường chọn lọc, tái tạo được 10-15 cụm tế bào được chuyển gene trên 100mg mô cấy với gene GUS được thể hiện khi có đủ mô để thử mà không làm mất hết cụm tế bào ( thường 3 tuần hay vài hôm). Sự thể hiện GUS chứng tỏ có sự kết gắn vector DNA vào DNA thực vật, và là gene chỉ thị thấy được của vector DNA trong cơ thể thực vật. Điều này nói lên được sự kết gắn hoàn hảo sau thời gian 1 cụm tế bào mới được tái tạo trên môi trường chọn lọc. Nếu cụm tế bào được kết gắn với 1 gene mới ngay cả 1 cụm tế bào hoàn chỉnh hay 1 phần cụm tế bào cho phản ứng màu xanh với sự hiện diện GUS. Cây ngô Hi-II chuyển gene Có 1-1,5 mô sẹo được chuyển gene qua bắn gene có khả năng tái sinh, mô sẹo này là những mô sẹo Hi-II 28 ngày tuổi. Hầu hết những mô sẹo được chuyển gene tái sinh tạo được trên 20 cây chuyển gene. Những cây này rất khác nhau về tính đực và cái. Chỉ những cây phát triển lá xanh khoẻ và có hệ rễ phát triển sẽ được cấy chuyển sang môi trường đất. Đặc tính di truyền gene BAR ở thế hệ con cái qua tự thụ phấn chéo cho thấy rõ hơn, cây kháng Ignite cho thấy phát triển tốt thể hiện màu xanh của lá so với màu nâu và chết cây của cây mẫn cảm với Ignite. Hai phương pháp chuyển gene ở thực vật : gián tiếp và trực triếp III.MỘT SỐ THÀNH TỰU TRONG CÔNG NGHỆ CHUYỂN GEN THỰC VẬT Cây ngô Hiện nay, cây ngô được biến đổi gen để mang các tính trạng như kháng côn trùng và chống chịu thuốc diệt cỏ. Dùng phôi ngô trong nuôi cấy dịch huyền phù phát sinh phôi để tái sinh các cây hữu thụ mang gen bar biến nạp. Sử dụng phương pháp bắn gen vq chọn lọc bằng thuốc diệt cỏ bialaphos đã cho kết quả là mô callus phát sinh các phôi được biến nạp gen. Các cây biến nạp gen hữu thụ đã được tái sinh, ổn định di truyền và biểu hiện gen bar cùng với hoạt tính chức năng của enzyme phosphinothricin acetyltransferase quan sát được trong những thế hệ sau. Cây lúa Lúa chuyển gene có khả năng kháng rầy nâu Chuyển gen ở cây lúa đang được tập trung vào tính trạng chống chịu thuốc diệt cỏ và sản xuất vitamin A. Cây lúa chỉ sản sinh ra hợp chất caroteoid được chuyển thành vitamin A trong những bộ phận có màu xanh của cây, tuy nhiên trong hạt gạo mà con người vẫn dùng lại không có hợp chất này. Chính vì thế sự thiếu hụt vitamin A thường xảy ra ở những nơi sử dụng gạo làm lương thực chính. Gạo vàng TM là một loại ngũ cốc chuyển gen có khả năng nâng cao hàm lượng vitamin A trong bữa ăn hàng ngày. Loại gạo này có khả năng sản sinh và lưu giữ chất β-carotene. Nó được đặt tên là gạo vàng TM bởi vì nội nhũ (chất bột bên trong của hạt gạo) của nó có màu vàng nhạt, do chất β-carotene tạo ra. Phương pháp bắn gen cho phép thực hiện biến nạp gen hiệu quả ở lúa trong các kiếu gen độc lập, và hiện nay hơn 40 giống đã được biến nạp gen thành công. Mẫu vật sử dụng là phôi non và các callus có nguồn gốc từ hạt trưởng thành. Hygromycin B là marker chọn lọc thường được dùng cho lúa. Tần số biến nạp có thể cao tới 50%. Lúa chuyển gene cho gạo có màu vàng với hàm lượng chất dinh dưỡng cao (bên phải) và lúa đối chứng Cây đậu tương Đậu tương là một loại cây chứa dầu đem lại lợi ích kinh tế to lớn nhất trên thế giới. Hạt đậu tương có chứa tỷ lệ amino acid không thay thế nhiều hơn ở cả thịt, do vậy đậu tương là một trong những loại cây trồng lương thực quan trọng nhất trên thế giới hiện nay. Đậu tương được biến đổi gen để mang các tính trạng như khả năng chống chịu thuốc diệt cỏ và có hàm lượng oleic acid cao. Đế biến nạp gen vào các giống đậu tương khác nhau người ta đã phối hợp 2 yếu tố : genotype đơn giản – phương thức tái sinh cây độc lập với sự tăng gia tốc của vi đạn có phóng điện để phân phối DNA ngoại lai. Hàng trăm cây đậu tương có nguồn gốc độc lập đã thu được và kết quả thu được đã cho nhiều phenotype khác nhau. Cây cải dầu Cây cải dầu được biến đổi gen với mục đích cải thiện chất lượng dinh dưỡng, đặc biệt là hàm lượng chất béo hòa tan của loại cây này. Cây cải dầu được biến đổi gen mang các tính trạng chống chịu thuốc diệt cỏ, có hàm lượng laurate và oleic acid cao. Khoai tây Khoai tây được xem là cây lương thực quan trọng thứ tư trên thế giới, với sản lượng hàng năm lên đến 300 triệu tấn và được trồng trên hơn 18 triệu hecta. Khoai tây được biến đổi gen mang các tính trạng như khả năng kháng côn trùng và kháng virus. Đậu tương Cải dầu Khoai tây tím Cà chua Cà chua được coi là loại quả vườn phổ biến nhất hiện nay. Cà chua thường rất dễ trồng và một số giống đã cho những vụ mùa bội thu. Chất lượng quả cà chua chín cây vượt xa tất cả những loại quả khác có mặt trên thị trường thậm chí trong cả mùa vụ. Cà chua được biến đổi gen mang các tính trạng như khả năng chịu thuốc diệt cỏ, kháng vật kháng sinh và làm chậm quá trình chín của quả. Cà chua chín chậm Cà chua chuyển gen kháng vật ký sinh (bên phải) và cà chua đối chứng (bên trái) Đu đủ Đu đủ là một loại cây trồng quan trọng ở khu vực Đông Nam Á, được dùng làm thức ăn phổ biến trong các hộ nông dân sản xuất nhỏ và gia đình . Hiện nay, giống đu đủ chuyển gen kháng virus đã được phát triển ở các nước thuộc khu vực Đông Nam Á. Đu đủ chuyển gene kháng virus (trên) và đu đủ đối chứng (dưới) Sản phẩm Đặc điểm Cải dầu Chống chịu chất diệt cỏ, hàm lượng laurate cao, hàm lượng oleic acid cao Ngô Chống chịu chất diệt cỏ, kháng côn trùng. Bông Chống chịu chất diệt cỏ, kháng côn trùng. Khoai tây Kháng côn trùng, kháng virus. Đậu tương Chống chịu chất diệt cỏ, hàm lượng oleic acid cao. Bí Kháng virus. Cà chua Chín chậm. Lúa Chống chịu chất diệt cỏ, sản xuất vitamin A. Đu đủ Kháng virus. MỘT SỐ CÂY CHUYỂN GEN QUAN TRỌNG IV. NHẬN THỨC CỦA NGƯỜI TIÊU DÙNG ĐỐI VỚI THỰC VẬT CHUYỂN GENE Một vấn đề đang được nhiều người quan tâm, thậm chí gây ra chống đối tại một số nước, là liệu các sản phẩm có nguồn gốc từ cây trồng chuyển gen có an toàn hay không? Thịt chế biến từ các động vật được nuôi bằng các nguồn thức ăn có cây trồng chuyển gene có ảnh hưởng đối với sức khỏe con người không? Phản đối thức ăn biến đổi gene mạnh nhất là giới tiêu thụ ở châu Âu và Nhật Bản. Nhẹ nhàng hơn là người tiêu dùng ở Úc và châu Phi. Vì bị tẩy chay, Mỹ đã mất 1,2 tỷ USD doanh thu từ xuất khẩu gạo vào năm 2006. Trước đó, năm 1999, bắp Mỹ cũng bị thị trường châu Âu tẩy chay vì biến đổi gene. Rất nhiều nhà hoạt động môi trường, tổ chức tôn giáo, nhóm vì lợi ích công cộng, hiệp hội chuyên nghiệp, khoa học gia và quan chức chính phủ tỏ ra lo ngại về thực phẩm biến đổi gene (TPBĐG). Họ lên tiếng chỉ trích ngành nông nghiệp vì mải mê chạy theo lợi nhuận mà quên đi những tai hoạ tiềm năng, cảnh báo chính phủ vì đã không giám sát chặt chẽ đối với lĩnh vực mới mẻ này. Mọi ý kiến chống lại TPBĐG đều xoay quanh 3 vấn đề cơ bản: huỷ hoại môi trường, ảnh hưởng đến sức khỏe con người và lợi ích kinh tế. 1. Huỷ hoại môi trường Đe dọa thế giới sinh vật: Một công trình nghiên cứu khoa học đã chứng minh rằng phấn hoa của ngô B.t. là nguyên nhân làm tăng tỉ lệ tử vong của sâu bướm chúa. Sâu bướm chúa không ăn ngô mà ăn lá bông tai, tuy nhiên gió sẽ mang phấn hoa ngô B.t. rắc lên cây bông tai khiến cho sâu chết sạch. Vấn đề là chúng ta không thể tạo ra được chất độc B.t. chỉ giết những côn trùng có hại, đồng thời bảo vệ côn trùng vô hại được. Cho đến nay, cuộc tranh cãi về ngô B.t. vẫn chưa ngã ngũ. Giảm hiệu quả thuốc trừ sâu: Do một số muỗi đã trở nên miễn dịch đối với thuốc trừ sâu DDT (nay đã bị cấm sử dụng), nhiều người tỏ ý lo ngại rằng côn trùng rồi cũng sẽ kháng được B.t. hoặc các loại cây trồng biến đổi gene để chống sâu bệnh. Chuyển gene sai mục đích: Một trong những điều khiến nhiều người lo lắng là cây trồng được biến đổi gene để chịu thuốc trừ cỏ và bản thân cỏ sẽ lai tạo với nhau, nhờ đó cỏ sẽ được mang gene kháng thuốc trừ cỏ. Tương tự, cây trồng biến đổi gene sẽ dần chuyển gene vượt trội sang cho các giống cây khác không được biến đổi. Đối với cả 3 vấn đề nêu trên, có một số phương pháp giải quyết như sau. Do gene được chuyển từ cây này sang cây khác qua đường thụ phấn nên chúng ta có thể tạo cây không có phấn hoặc phấn không chứa gene biến đổi. Nhờ đó, quá trình thụ phấn sẽ không xảy ra, đồng thời côn trùng vô hại như sâu bướm chúa có ăn phải phấn hoa cũng không bị tổn hại. Giải pháp khác là tạo vùng đệm xung quanh khu vực trồng cây biến đổi gene. Chẳng hạn, chúng ta trồng ngô không biến đổi gene quanh cánh đồng ngô B.t. nhưng sẽ không thu hoạch chỗ ngô trong vùng đệm đấy. Côn trùng có lợi hoặc vô hại sẽ được dồn sang vùng đệm, sâu bọ sẽ được phép phá hoại ngô không biến đổi gene. Do đó, chúng sẽ không có khả năng kháng lại thuốc trừ sâu. Hiện tượng truyền gene sang cho cỏ và cây trồng khác cũng không xảy ra nữa, bởi vì phấn hoa không thể theo gió vượt qua khỏi vùng đệm. Theo tính toán, vùng đệm thích hợp sẽ có chiều rộng khoảng 6-30m. 2. Ảnh hưởng đến sức khỏe con người Dị ứng: Rất nhiều trẻ em ở Mỹ và châu Âu đã bị các triệu chứng dị ứng nguy hiểm đến tính mạng do lạc và một số loại thực phẩm biến đổi gene gây ra. Có thể khi gene được đưa vào cây trồng đã tạo ra chất gây dị ứng mới lên những người mẫn cảm. Một dự án kết hợp gene của lạc Brazil vào đỗ tương đã bị huỷ bỏ vì chính quyền lo sợ rằng sản phẩm mới sẽ gây dị ứng. Để tránh ngộ độc thực phẩm cho người tiêu dùng, giới nghiên cứu cần thử nghiệm nhiều hơn đối với TPBĐG. Hậu quả tiềm năng: Nhiều ý kiến cho rằng đưa gene lạ vào cây thực phẩm có thể tạo nên những ảnh hưởng không tốt đối với sức khỏe người. Chẳng hạn, gene cấy vào khoai tây để tăng khả năng tránh tuyết là một chất rất độc đối với động vật có vú, hoàn toàn không nên sử dụng loại khoai này làm thực phẩm. Tuy nhiên, theo đánh giá của giới khoa học thì ngoài việc gây dị ứng, TPBĐG không nguy hiểm gì đến sức khỏe con người. 3. Lo ngại về mặt kinh tế Đưa TPBĐG ra thị trường là một quá trình tốn kém và mất nhiều thời gian. Và tất nhiên, các công ty công nghệ sinh học - nông nghiệp luôn muốn đảm bảo lợi nhuận cho khoản đầu tư của mình. Rất nhiều công nghệ biến đổi gene thực vật mới và nhiều giống cây biến đổi gene đã được cấp bằng sáng chế, vì vậy hiện tượng vi phạm bản quyền là một vấn đề lớn của ngành nông nghiệp. Nhưng các nhà ủng hộ người tiêu dùng lại cho rằng, việc cấp bản quyền cho giống cây mới sẽ làm tăng giá hạt giống, khiến cho nông dân các nước thứ 3 không đủ khả năng mua hạt giống cây biến đổi gene. Do đó, khoảng cách giữa người giàu và người nghèo ngày càng trở nên rộng hơn. Hy vọng rằng, các tổ chức phi lợi nhuận sẽ hạ thấp giá cả hạt giống khi bán vào các nước nghèo. Việc thực thi luật bản quyền là điều hết sức khó khăn, bởi vì nông dân cho rằng cây trồng của họ vô tình được thụ phấn cây biến đổi gene nhờ gió. Có một giải pháp được đề xuất: cấy "gene tự sát" vào cây biến đổi gene. Khi đấy, gene chỉ có tác dụng trong một mùa canh tác, và sẽ tạo ra những hạt giống không có khả năng nảy mầm. Để tiếp tục canh tác, nông dân cũng phải mua hạt giống mới hàng năm. Tuy nhiên, điều này hoàn toàn bất khả thi đối với nông dân thế giới thứ 3. Vì vậy, công nghệ gene tự sát sẽ không bao giờ được đưa vào ứng dụng nông nghiệp. LỜI KẾT TPBĐG có khả năng giải quyết phần lớn các vấn đề về đói kém và suy dinh dưỡng trên thế giới. Đồng thời, nó có thể bảo vệ, giữ gìn môi trường thông qua nâng cao sản lượng của cây trồng và giảm bớt sự phụ thuộc vào thuốc trừ sâu và thuốc diệt cỏ hóa học. Tuy nhiên, TPBĐG cũng đặt ra nhiều thách thức cho chính phủ các nước, đặc biệt là về mặt kiểm định an toàn, chính sách quốc tế và dán nhãn thực phẩm. Biến đổi gene là xu hướng không thể tránh khỏi của tương lai, và chúng ta không thể làm ngơ trước một công nghệ có nguồn lợi ích khổng lồ như thế. Chỉ có điều, chúng ta phải hết sức cẩn thận để không gây ra những tác hại ngoài ý muốn cho sức khỏe người tiêu dùng lẫn môi trường.