Tiếp cận vấn đề phát hiện tồn dư kháng sinh trong các thực phẩm có nguồn gốc từ động vật - Phần 1

PHẠM KIM ĐĂNG Khoa Chăn nuôi và Nuôi trồng thuỷ sản Đại học Nông nghiệp Hà Nội TIẾP CẬN VẤN ĐỀ PHÁT HIỆN TỒN DƯ KHÁNG SINH TRONG CÁC THỰC PHẨM CÓ NGUỒN GỐC TỪ ĐỘNG VẬT (Phần 1) THỰC PHẨM CÓ NGUỒN GỐC TỪ ĐỘNG VẬT Kháng sinh và chăn nuôi thâm canh Chăn nuôi thâm canh Mật độ cao Tổn thương, ô nhiễm tiểu khí hậu chuồng nuôi, mất vệ sinh Tăng tỷ lệ chết, con non thường yếu ớt, đề kháng kém, Chậm sinh trưởng Sản lượng giảm hay giảm năng suất chăn nuôi Tổn thất kinh tế rất quan trọng Các nhóm kháng sinh chính sử dụng trog chăn nuôi § b-lactam(penicilline, cephalosporine) § Tetracyclines (oxy- và chlortetracycline, …) § Aminoglycosides (streptomycine, …) § Macrolides (Erythromycine, …) § Phenicol (chloramphenicol, …) § Peptid (avoparcine, …) § Ionophores (monensine, …) § Sulfonamides (25 loại, sulfaméthazine, …) § Trimétroprim § Nitrofurannes (furazolidone,…) § (Fluo)quinolones § Carbadox ~100 hợp chất Khác nhau Công thức rất khác nhau và phức tạp  CH2CO NH N CH3 CH3 COOH H H Benzylpenicilline (penicilline) Cephalexine (cephalosporine) HH O NHCH2CO N S CH3 COOH O S O O N N NH 2 N N H3CO H3CO H N CH3 CH3 H2N Trimethoprim OCH3 NH2 O CHO H3C OH O O O O HO OH CH3 N(CH 3)2 (aminocyclitol) Erythromycine(macrolide) OCH3 CH3 OH CH3 CH3 H5C2 H3C HO H3C CH3 OH CH3 O OO O O O Spectinomycine CH3 HH OH H3CHN HO NHCH 3 H OH O O O O Streptomycine (aminoglycoside) OH OH NHCH 3 CH2OH OH NH2 NH C NH C NH NH HO HO CH3 Sulphadimidine ou sulfamethazine NH2 NH (sulphonamide) OH NH2 N(CH 3)2HO CH3 HH OH OOOHOOH Tétracycline O O N ON O CH2OH OH H3C CH3 H H O H H3C O CH2 O H CH3 CH3 O HO H3C H CH3O COOH O OXOLINIC ACID C2H5 COOH NO O FURAZOLIDONE H MONENSIN H3C O2N CH3 OH CH2OH N N O O O CARBADOX H N O O N TIAMULIN H3C CH3 H H3C H2C HO CH3 O(C2H5)2N S CHLORAMPHENICOL NHCOCHCl 2H HOH CH2OHCCO2N O H3C CH3 Công thức rất khác nhau và phức tạp O2N OH H H NHCOCHCl2 CH2OH H3CO2S OH H H NHCOCHCl2 CH2F H3CO2S OH H H NHCOCHCl2 CH2OH H3CO2S OH H H NH2 CH2F Chloramphenicol (CAP) Florfenicol (FF) Thiamphenicol (TAP) Florfenicol amine (FFA) Công thức rất khác nhau và phức tạp 7 FQ lưỡng tính : - Norfloxacine - Ofloxacine - Enoxacine - Marbofloxacine - Enrofloxacine - Ciprofloxacine - Danofloxacine 4 FQ acides: - Cinoxacine - Flumequine - acide Oxolinic - acide Nalidixic p Ảnh hưởng kỹ thuật chế biến, bảo quản sản phẩm: ức chế sự lên men sản xuất acid p Độc hại n Bảo vệ người tiêu dùng n Bảo vệ môi trường: kháng thuốc à thú y, nhân y p Người tiêu dùng: Vấn đề đạo đức Tại sao lại phải kiểm tra tồn dư kháng sinh trong thực phẩm có nguồn gốc động vật? p Ít độc cấp tính pKháng sinh cấm (ung thư, quái thai, bất thường … ) pGây dị ứng pMất cần bằng hệ vsv đường ruộtà Rối loạn pGây kháng thuốc ở vi khuẩn - xuất hiện các chủng vi khuẩn gây bệnh kháng nhiều loại kháng sinh (multi-resistante) - Vô hiệu hoá các loại kháng sinh - Nguy cơ ô nhiễm môi trường Kháng sinh và tiềm tàng nguy hiểm Nguồn gốc tồn dư tồn dư kháng sinh Kháng sinh + lợi nhuận chăn nuôi Sử dụng kháng sinh (lạm dụng, bất hợp pháp) - Điều trị bệnh cá thể - Phòng bệnh cho đàn hoặc lô - Kích thích sinh trưởng (Feed additives ????) - Bảo quản ???? Tồn dư trong sản phẩm chăn nuôi Ảnh hưởng xấu đến môi trường và người tiêu dùng Nguyên nhân p Sử dụng sai nguyên tắc và bất hợp pháp: § Các sản phẩm chợ đen § Bảo quản ???? § Sai nguyên tắc hoặc có chủ định 1. Không có đơn thuốc của BSTY, 2. Không tuân thủ liều 3. Thời gian dừng thuốc. Đặc biệt các Vùng dân trí thấp LUẬT LIÊN QUAN TỒN DƯ HAI NHÓM Nhóm các chất cho phép sử dụng à MRL (Maximum Residue Limit). - Nhóm các chất cấm à MRPL (Minimum Require Performance Limit) Cơ sở qui định MRL và MRPL???? Cơ sở qui định MRL và MRPL???? Tác động có thể quan sát Tổng lượng kháng sinh Mức không thể quan sát thấy tác động bất lợi Hệ số an toàn ADI = Acceptable Daily Intake MRL=Maximum Residue Limit Kháng sinh từ chuồng nuôi đến bàn ăn • Điều trị bệnh của Thú y (người chăn nuôi) • Các thuốc được phép • H.dẫn sử dụng, thời gian chờ • Cấm kích thích sinh trưởng •Kiểm soát vs giết mổ, dịch bệnh •Bắt buộc có thông báo •Kiểm soát thân thịt và nội tạng Kiểm soát nhập khẩu Thú y cửa khẩu ???? •Traçability •Kiểm soát MRL Cơ quan thẩm quyền: Cục thú y -Bộ nông nghiệp Cục VSATTP - Bộ y tế Cục VSANTYTS - Bộ Thuỷ sản Hệ thống Lab ??????? Kiểm soát các kháng sinh Khó khăn: chất cần tìm không biết trước Liệu có Kháng sinh nào trong thực phẩm không? Cách tiếp cận theo lý thuyết Cách tiếp cận theo phân tích Điều tra thú y Xác định danh sách các chất cần kiểm soát Gần như khô ng thể ! Phát triển, sử dụng multianalyse - Sàng lọc (screening) - Kỹ thuật phân tách - Kỹ thuật phân tích phổ (MS) CHIẾN LƯỢC PHÂN TÍCH CHUNG Mẫu Sàng lọc Phân tích định tínhPhân tích định lượng Kết quả có giá trị theo tiêu chí đặt ra Nhanh, hạn chế tối thiểu dương tính giả, âm tính giả Mục đích phân tích kiểm tra 1 mẫu (hay 1 lô) đạt tiêu chuẩn hay không? Nhóm cho phép sử dụng Ø Nồng độ < MRL ð Đạt tiêu chuẩn Ø Nồng độ > MRL ð Không đạt tiêu chuẩn CHIẾN LƯỢC PHÂN TÍCH CHUNG Mục đích phân tích kiểm tra 1 mẫu (hay 1 lô) đạt tiêu chuẩn hay không? Nhóm cấm sử dụng Ø Nồng độ < MRPL (LOD) ð Đạt tiêu chuẩn Ø Nồng độ > MRPL (LOD) ð Không đạt tiêu chuẩn CHIẾN LƯỢC PHÂN TÍCH CHUNG CHIẾN LƯỢC PHÂN TÍCH CHUNG 1. Sàng lọc (screening) Đạt tiêu chuẩn (< LOD hoặc < MRL) Nghi ngờ (> LOD hoặc > MRL) 2. Phân tích khẳng địnhLô được chấp nhận Đạt tiêu chuẩn (< LOD hoặc < MRL) Không đạt tiêu chuẩn (> LOD hoặc > MRL) Bị từ chối ????Lô được chấp nhận CHIẾN LƯỢC PHÂN TÍCH CHUNG I. Phương pháp sàng lọc (screening) - Nhanh - Phân tích nhiều chất cùng lúc (Multi-analyte) - Rẻ - Có thể tự động hoá - Không cho kết quả âm tính giả II. Phương pháp khẳng định (lý hoá) - Đặc hiệu - Không cho kết quả dương tính giả CHIẾN LƯỢC PHÂN TÍCH CHUNG I. Phương pháp sàng lọc (screening) - Test vsv (“Test thận Bỉ”, test 4 đĩa Châu Âu Premitest, Delvotest, Copan, …) n Test miễn dịch (ELISA, RIA …), Receptor-essais (Beta-STAR, Tetrasensor, …) II. Phương pháp khẳng định (lý hoá) - Nhận diện chất tồn dư - Định lượng chính xác và đối chiếu MRL CÁC PHƯƠNG PHÁP SÀNG LỌC VÀ KHẲNG ĐỊNH VSV ELISA HPLC-UV HPLC-F LC/GC- MS MS-MS Phù hợp để khẳng định các chất cấm Thích hợp để sàng lọc Phù hợp để khẳng định các chất có MRL Các chủng vsv được dùng trong test VSV kiểm tra tồn dư 1. BACILLUS STEAROTHERMOPHILUS var. CALIDOLACTIS p IMPROVED AGAR DIFFUSION TEST DELVOTEST SP-NT p CHARM AIM-96 DISK ASSAY PLATE METHOD p DELVOTEST MCS COPAN MILK TEST 2. STREPTOCOCCUS SALIVARIUS ssp. THERMOPHILUS ACIDIFICATION TEST or ACIDIFICATION TEST + TMP VALIO T101 VALIO T102 LUMAC RAPID ANTIBIOTIC TEST KIT 3. BACILLUS CEREUS BACILLUS CEREUS-TEST (tetracyclines) 4. ESCHERICHIA COLI ESCHERICHIA COLI -TEST (quinolones) 5. BACILLUS SUBTILIS BGA 6. MICROCOCCUS LUTEUS 7. BACILLUS BRONCHESEPTICA 8. ….. Ưu nhược điểm của test VSV p Ưu điểm n Đơn giản n Trang bị đơn giản n Cần ít mẫu n Phổ phát hiện rộng n Tương đối nhạy n Tương đối nhanh n Rẻ n Một số trường hợp đặc hiệu nhóm n Có thể tự động hoá n Rất tiện để sàng lọc p Nhược điểm n Một số trường hợp đọc bằng màu n Ảnh hưởng một số chất có trong mẫu (chất có khả năng ức chế VSV (FP), VSV (FN)) n Thời gian test quá lâu n Không đặc hiệu n Không định lượng n Một số chất không phát hiện được p CAP, nitrofurans, nitro-imidazoles n Độ nhạy phụ thuộc điều kiện của chủng vSV sử dụng Các dạng test VSV - Ức chế vi sinh vật tạo vòng vô khuẩn - 1 chủng cùng 1 điều kiện môi trường - 1 chủng điều kiện môi trường khác nhau (pH) - Các chủng chọn lọc cho các nhóm kháng sinh - Các chủng chọn lọc + pH khác nhau STAR (B.subtilis pH 7.2, Kocuria varians 8, B.cereus 6, E.coli 8, Geobacillus stearothermophilus 7) - Phản ứng lên men: chỉ thị màu (premitest, DelvoTest….) Enzym, receptor, miễn dịch p ENZYM n PENZYM 100 PENZYM 100S n TG (tetracycline galactosidase) – test p RECEPTOR & MIỄN DỊCH n SNAP (beta lactam en tetracycline test kit) · LacTek n b_S.T.A.R. · Delvo –X- Press (II) n ELISA · PARALLUX n Charm MRL-test (ROSA) (b -lactam, tetra or both) n CHARM II (5 groups) · Twin Sensor Ưu nhược điểm của phương pháp miễn dịch p Ưu điểm n Đặc hiệu n Đa số rất nhạy n Có thể sử dụng các mẫu khác nhau n Bán định lượng n Tương đối nhanh n Thích hợp dùng kiểm soát đầu vào p Nhược điểm n Giá thành n Đa số cần KTV được đào tạo n Độ đặc hiệu cao đôi khi trở thành bất lợi n Phản ứng chéo (FP) n Có thể ảnh hưởng mẫu matrix n Một số KT không có trên thị trường Ưu nhược điểm của phương pháp lý hoá (HPLC, GC, MS, MS/MS) p Ưu điểm n Nhậndiện rõ ràng n Thông tin định lượng n Rất nhạy n Thích hợp cho khẳng định p Nhược điểm n Qui trình rất phức tạp (chuẩn bị, tách chiết, làm sạch) n Thiết bị đắt n KTV chuyên nghiệp cao n Một số KS không có qui trình phân tích bằng PP này n Một số trường hợp thay đổi độ thu hồi Khả năng phân biệt và tiềm tàng các chất gây nhiễu (interference) VSV ELISA HPLC-UV HPLC-F LC/GC- MS MS-MS Tăng khả năng phân biệt Tăng tiềm tàng các chất gây nhiễu CHIẾN LƯỢC PHÂN TÍCH CHUNG Chiến lược phân tích cụ thể và các phương pháp khác nhau Các sản phẩm khác nhau ??? SỮA + - Nếu cần thiết Bước 1: Test nhận diện chất/nhóm đặc hiệu = Penase, Penzym, PABA, Receptor test, Immuno assay Bước 2: Phân tích lý hoá = HPLC, GC, GC/MS Kết quả đối chiếu MRL Mẫu sữa Test vsv Nhận định: è Ảnh hưởng kỹ thuật (quality errors) è Nghi ngờ có chất kháng khuẩn Nhận định: è Không có vấn đề kỹ thật è Có thể có một số chất kháng khuẩn nào đó Khẳng định (nhận dạng) và định lượng Kiểm tra kháng sinh trong thịt và thận ở Bỉ Procéder à un test rénal Analyse de l’échantillon de viande par la méthode des 4 plaques Analyse physico-chimique de l’échantillon de viande Résultat positif La carcasse est acceptée La carcasse est acceptée Concentration < LMR Résultat positif Résultat négatif Pas d’analyse de l’échantillon de viande La carcasse est acceptée Résultat négatif La carcasse est rejetée Concentration > LMR Analyse de la lésion d’injection Analyse de l’échantillon de viande La carcasse est rejetée La carcasse est acceptée partiellement La carcasse est acceptée Concentration LMR Concentration > LMR Concentration < LMR Kiểm tra kháng sinh trong thịt và thận ở Bỉ Các công đoạn trong phân tích tồn dư Chuẩn bị mẫu Tách chiết Tinh chế, cô đặc p Lấy mẫu p Làm sạch p Nghiền p Dung môi hữu cơ p Phân tách pha lỏng -lỏng p Tách chiết pha rắn (silice) p Bằng ái lực miễn dịch Đo định lượng hoặc định tính Ý tưởng phát triển phương pháp Hình thành ý tưởng Dư luận Phân tích điều tra Yêu cầu theo luật Yêu cầu thực tế Tổ chức thực hiện ý tưởng Kiểm tra kết quả Nguyên lý “Test thận Bỉ” Đĩa giấy chứa 1µg kháng sinh chuẩn Vòng vô khuẩn Giấy tẩm dịch vùng vỏ thận Tyl Strep Sulf Oxyt Đối chứng dương Mẩu vỏ thận Mẫu + Mẫu - 20 mm 20 mm 17 mm 18 mm Ф1 Ф2 (Ф1 + Ф2)/2 >= 20 mm ou L >= 2 mm L Thạch cấy B. subtilis Nguyên lý “Test thận Bỉ” Ưu nhược điểm ???? Ý tưởng khắc phục nhược điểm Không dùng dịch thận, mẩu thận mà dùng mẫu tách chiết Tách chiết thế nào? Lượng mẫu bao nhiêu? Làm thế nào để kiểm tra được chất lượng test?? Yêu cầu qui trình tách chiết thế nào? pTách được chất cần tìm ra khỏi mẫu pĐảm bảo độ thu hồi pCác chất sử dụng không ảnh hưởng đến chất cần tìm và kết quả đọc pNếu có thể hạn chế được các chất gây dương tính giả Thích ứng Premi-Test Lượng mẫu bao nhiêu? Xác định Độ mẫn cảm của VSV với kháng sinh Kiểm soát Chất lượng môi trường, Đĩa cấy vsv Xác định lượng KS ít nhất có thể tạo vòng vô khuẩn (A) Kiểm tra lại qui trình tách chiết = ks chuẩn Xây dựng công thức tính lượng mẫu bé nhất cần lấy (M) M (g) = A * MRL-1 Làm thế nào để kiểm tra được chất lượng test?? Đánh giá các tham số độ mạnh (LOD, Độ nhạy, Độ đặc hiệu, độ chính xác) Phạm Kim Đăng, Marie-Louise SCIPPO; Guy DEGAND; Caroline DOUNY; Guy MAGHUIN-ROGISTER (2007): Chuẩn hóa phương pháp sàng lọc định tính kiểm soát tồn dư kháng sinh trong thực phẩm có nguồn gốc động vật theo qui định số 2002/657/EC (bài tổng hợp). Tạp chí KHKT Nông nghiệp, ĐHNN I, Tập V, Số 1/2007; Trang 24-30. d=11&ID_S=20 Chuẩn bị thực hiện Nguyên liệu và hoá chât - Dung dịch chuẩn (dung môi, chất chuẩn) - Giống vi sinh vật: Bacillus subtilis BGA - Môi trường nuôi cấy Standard II Nutrient Agar for microbiology - Mẫu “trắng” - Dextrose, methanol, NH4OH 2M, NaOH 1M, HCl 1 và 2M. - Trimethoprime (TMP) 1 mg/ml - Đĩa giấy đường kính 12 mm - Đĩa Petri - Acetonitrile, Acetone Dụng cụ p Micropipet p Cân phân tích (gam, mg, µg) p Nồi hấp tiệt trùng p Nồi hấp cách thuỷ à45-47°C p Vortex p Máy lắc đảo đầu p Ly tâm (2000-6000 vòng/phút) p Hệ thống bay hơi (ly tâm chân không or thổi Nitơ) p Tủ ấm 30°C Chuẩn bị môi trường (1 lít) § Cân 25 g môi trường § Thêm 6 g dextrose = 0,6% (nếu dùng dung dịch 20% cần ?) § Hoà trong 1 lit nước cất (– số ml đường) (đun sôi, khuấy liên tục, cẩn thận khi sắp sôi) § Cho vào các lọ (4x250 ml) (nắp hơi lỏng) § Tiệt trùng trong 15 phút ở 121°C +/-0,1. § Làm nguồi về 47°C bằng nồi cách thuỷ (Nếu thạch dự trữà90°C trong 3h, làm nguộià47°C khoảng 30 phút) Chuẩn bị môi trường (1 lít) § Môi trường đưa vào sử dụng sau khi hiệu chỉnh pH=7,2±0,1 ở 25°C bằng HCl hoặc NaOH 1M § Mỗi lọ 100 ml môi trường: 20µl TMP (1mg/ml) + 100 µl dung dịch huyền phù B.subtilis được pha loãng theo hướng dẫnà lắc đều § Đổ 14 ml thạch/đĩa (dày 2,2 mm) à (200 ml = 14 đĩa) § Sau khi để thạch cứng, đĩa bao gói bao nilon plastic và được bảo quản ở 4°C tối đa 1 tuần (úp nắp xuống) Kiểm tra chất lượng đĩa chuẩn bị XÁC ĐỊNH MIC 0,6258 1,257 2,56 55 6,674 103 µg/mlSolution XÁC ĐỊNH MIC 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 25.00 37.50 50.00 62.50 75.00 87.50 100.00 112.50 125.00 137.50 150.00 162.50 175.00 Lương kháng sinh chuẩn/đĩa (ng) Đ ộ r ộ ng v òn g vô k hu ẩ n qu an h đĩ a gi ấ y (m m ) Danof loxacine Oxolinic acid Difloxacine Ciprof loxacine Norfloxacine Enrof loxacine Flumequine Sulfadiazine Sulfadimethoxine Sulfamethoxazole Chlortetracycline Oxytetracycline Tetracycline Độ rộng vòng vô khuẩn quanh đĩa giấy biến động tuỳ theo lượng kháng sinh có trong 50 µl dung dịch chuẩn Qui trình tách chiết Lớp trên đượcà đĩa 3 ± 0,1 g tôm nghiền 5 ml acetonitrile/acetone (70/30 : V/V) Lắc đảo đầu trong 10 phút Ly tâm tốc độ 3000 vòng/phút trong 10 phút ở 15°C Thu hồi Lớp trên được Làm bay hơi đến khô = «SAVANT» or khi N2 40°C Phần chất khô còn lại được thu hồi trong 200 µl methanol Ly tâm tốc độ 3000 vòng/phút trong 10 phút ở 15°C 3 gam tôm/200 µl methanol 50µl chứa 0,75 gam tôm Xác định khối lượng mẫu tôm bé nhất cần lấy cho một lần tách chiết Khối lượng mẫu tôm bé nhất cần lấy (QME)/phân tích Qui trình tách chiết Giới hạn nồng độ tối đa (LMR) QMI (ng trong 50 µl/đĩa) QME (g) = QMI * LMR-1 Phương pháp hiểu chỉnh phương pháp Chuẩn hoá theo QĐ 2002/657/CE - LCR, AFSSA, FOUGERES NA (Âm tính theo qui định)FN (Âm tính giả)Âm tính FP (Dương tính giả)PA (Dương tính theo qui định)Dương tính Mẫu thực sự âm tính (N-) (mẫu trắng) Mẫu thực sự dương tính (N+) (mẫu củng cố)Kết quả test PA Độ nhạy (%) = x 100 N+ NA Độ đặc hiệu (%) = x 100 N- PA + NA Độ xác thực (%) = x 100 N Où N = N+ + N- Xác định LOD: MIC à mẫu trắng củng cố gần với MIC à <5% âm tính NGUYÊN LÝ CỦA KÍT ELISA (FLUORO)QUINOLONES 2 HOURS DO CER CUNG CẤP Gián tiếp - Canh tranh (FLUORO)QUINOLONES 2 HOURS CER _ BỈ Thành phần của một Kit 1. Một plate 96 giếng có phủ KT tinh sạch của cừu kháng lại KT có nguồn gốc thỏ 2. 7 lọ có chứa dung dịch chuẩn (KN): 1, 0.5, 0.3, 0.2, 0.1, 0.05 và 0 ng/ml 3. Dung dịch chứa KN có gắn với men gây phản ứng tạo màu (Peroxide cọnugated norfloxacin) 4. Lọ chứa KT có nguồn gốc từ thỏ đặc hiệu với KN được đông khô 5. 1 lọ 18 ml Substrate/chromogen (tham gia phản ứng tạo màu perocide/TMB) 6. 50 ml dung dịch đệm pha loãng pH 7,4 - 10x 7. Dung dịch dừng phản ứng H2SO4 6N 8. 50 ml dung dịch đệm để rửa - 10x 9. Tài liệu thông số kỹ thuật của Kit 1. Phủ kháng thể đã được tinh lọc lên bề mặt rắn (1 µg kháng thể cừu kháng lại kháng nguyên có nguồn gốc thỏ IgG) + °C Kháng thể 16/04/2008 2. a) Cho mẫu đã được tách chiết hoặc dung dịch kháng nguyên chuẩn vào 2. b) Cho kháng nguyên có gắn men vào EEE EEEAg-Enz EE E EEE Antigen 2. c) Cho kháng thể đặc hiệu thỏ vào E E E E E E 3. ủ 2h ở 4°C Specific Ab E E E E E E EEE E E E 4. Rửa loại bỏ các chất không được gắn (ba lần) E E 6. Dừng phản ứng bằng H2SO4. Substate /chromophore 7. Đọc ở 450 nm. 5. Cho dung dịch phản ứng màu vào TMB/H2O2 và ủ 30’ trong bóng tối Chuẩn bị hoá chất PBS pH 7.4 : 9g NaCl + 7,78g Na2HPO4.2H2O+ 0,75 g KH2PO4 trong 1 lít H2O Methanol/PBS (50/50 V/V) Pha loãng dung dịch đệm 10x Pha loãng KN gắn enzyme 100x Khôi phục KT đông khô (+ 6 ml dung dịch pha loãng) ! Lượng hoá chất chuẩn bị số mẫu phân tích + đường chuẩn QUI TRÌNH TÁCH CHIẾT MẪU (*) PBS pH 7.4 :9 gam NaCl, 7,78 gam Na2HPO4.2H2O và 0,75 gam KH2PO4 trong 1 lít nước cất 5 gam mẫu 5 ml methanol/PBS (50/50 v/v) lắc đảo đầu 30’ 10’, 4000rpm Ly tâm 10 phút với vận tốc 3000 vòng/phút 30’’ 0,5 ml 4,5 ml d2 đệm pha loãng 30 giây (pha loãng 10x) 50 µl/giếng QUI TRÌNH TEST QUI TRÌNH TEST S12S8S811H S12S7S70.50.5G S11S6S60.30.3F S11S5S50.20.2E S10S4S40.10.1D S10S3S3.05.05C S9S2S200B S9S1S1NSNSA 121110987654321 Dung dịch chuẩn Mẫu Chuẩn bị Plate QUI TRÌNH TEST 50 µl mẫu 8 tách chiếtH4H3 50 µl mẫu 7 tách chiếtG4G3 50 µl mẫu 6 tách chiếtF4F3 50 µl mẫu 5 tách chiếtE4E3 50 µl mẫu 4 tách chiếtD4D3 50 µl mẫu 3 tách chiếtC4C3 50 µl mẫu 2 tách chiếtB4B3 50 µl mẫu 1 tách chiếtA4A3 50 µl dd 0.05 ng/mlH2H1 50 µl dd 0.1 ng/mlG2G1 50 µl dd 0.2 ng/mlF2F1 50 µl dd 0.3 ng/mlE2E1 50 µl dd 0.5 ng/mlD2D1 50 µl dd 1 ng/mlC2C1 100 µl dd K T/giếng 50 µl dd 0 ng/mlB2B1 Lắc nhẹ, đ o ở b ư ớc sóng 450 trong vòng 30 phút 50 µl dd dừng phản ứng m àu/giếng Lắc nhẹ, ủ 30phút trong bóng tốit°phòng 150 µl peroxide/TM B /giếng dốc bỏ hết, rửa 3 lần = dd đệm , vỗ úp hết ủ 1h ở 4°C 100 µl dd E. C onjugate/giếng Lắc nhẹ 1 phútrồiủ 1h ở 4°C -150 µl dd đệm p.loãngA2A1 B10B9B8B7B6B5B4B3B2Bước 1ô Tính kết quả Đồ thị 1. Đường chuẩn y = -1,0115x - 1,2697 R2 = 0,9915 -1,500 -1,000 -0,500 0,000 0,500 1,000 1,500 2,000 -3,500 -3,000 -2,500 -2,000 -1,500 -1,000 -0,500 0,000 0,500 ln (concentration) lo gi t ( (B -N S) /(B 0- N S) ) T - B, B0 tương ứng là mật độ quang của dung dịch chuẩn ở các nồng độ khác nhau và tại nồng độ bằng 0. - NS mật độ quang của dung dịch không đặc hiệu QUI TRÌNH TEST 1,043 0,923 0,801 0,642 0,485 0,307 1,226 0,07 Mật độ quang (OD)Dung dịch chuẩn 0,05C6 0,1C5 0,2C4 0,3C3 0,5C2 1C1 0C0 0NSB* Mẫu 1: OD = 0,121 Mẫu 2: OD = 0,095 Mẫu 3: OD = 0,45 à Hãy tính Nồng độ thực ?? Và đưa ra kết luận?? NGUYÊN LÝ CỦA KÍT Tetra sensor RECEPTOR ASSAY Assay for tetracycline residues: The Milk Protocol CÁC DẠNG KÍT VÀ KHẢ NĂNG PHÁT HIỆN SỮA MÔ ĐÔNG VẬT Kidney, Liver, Muscle Pig, Chicken, Beef, Seafood, Fish, Eggs MẬT ONG CÁC DẠNG KÍT VÀ KHẢ NĂNG PHÁT HIỆN QUI TRÌNH TEST QUI TRÌNH TEST ĐỌC VÀ GIẢI THÍCH KẾT QUẢ