Thư viện gen (genomics library)

THƯ VIỆN GEN (GENOMICS LIBRARY) A) Định nghĩa: Đó là quá trình chia nhỏ DNA bộ gen thành các phân đoạn nhân dòng và chèn chúng vào tế bào chủ gọi là lập thư viện gen (còn gọi là ngân hàng gen). Một thư viện đầy đủ, theo định nghĩa, chứa tất cả DNA bộ gen của sinh vật nguồn. B) Quá trình thành lập một thư viện gen: I. Tách chiết DNA bộ gen, và DNA vectơ (như plasmid, phage…). II. Cắt DNA bộ gen và vectơ sau khi đã tách chiết thành những đoạn có kích thước nhất định bằng cùng một enzyme cắt giới hạn (RE). III. Gắn DNA vào vectơ tạo ra DNA tái tổ hợp. IV. Đưa DNA tái tổ hợp vào vật chủ (có thể là vi khuẩn như E.coli, nấm men ……). V. Tế bào chủ được nuôi cấy, hình thành những dòng. VI. Sàng lọc thư viện gen để nhận dạng các trình tự đích. I. Tách chiết DNA: 1) Nguyên tắc chung: - Lấy mẫu vật (nuôi cấy vi sinh vật, nghiền mẫu mô động vật, thực vật ở nhiệt độc thấp). - Phá vỡ màng tế bào và màng nhân. - Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu chủ yếu là protein.(chiết xuất bằng phenol). - Cô đặc DNA lại bằng ethanol hay iso-propanol lạnh. -Rửa lại DNA bằng ethanol lạnh và đem bảo quản DNA trong dung dịch TE (ở nhiệt độ thấp). 2) Cách tiến hành tách chiết DNA bộ gen ( DNA của vi sinh vật, thực vật, động vật…) và DNA vectơ có trong tự nhiên (như plasmid, phage…): a) Tách chiết DNA total tế bào vi khuẩn - Phá vỡ tế bào để giải phóng các thành phần tế bào: Sự phân hủy hóa học nói chung là một tác nhân công kích phá vỡ thành tế bào và một tác nhân khác phá vỡ màng tế bào. Việc sử dụng các hóa chất phụ thuộc vào loại vi khuẩn, nhưng với E.coli và các vi khuẩn có quan hệ gần, việc làm suy yếu thành tế bào bằng lysozyme hay ethylene diamin tetra acetate (EDTA) hoặc là phức hợp của cả hai. Lysozyme là enzyme có trong lòng trắng trứng và trong chất tiết như nước mắt, nước bọt, tiêu hóa các hợp chất polymeric, chất giúp thành tế bào rắn chắc. Mặc khác, EDTA, tạo phức với ion Mg là yếu tố cần thiết bảo quản cấu trúc bên ngoài của màng tế bào, cũng như ngăn chặn enzyme cellular có thể phân hủy DNA. Trong nhiều trường hợp, chỉ với EDTA hay lysozyme là đủ để phân giải tế bào vi khuẩn, nhưng thông thường người ta còn thêm vào đó chất tẩy như sodium dodecyl sulphate (SDS). Chất tẩy tham gia vào quá trình thông qua việc rút các phân tử lipid và vì vậy gây ra sự phá hủy màng tế bào. Phá hủy tế bào Phá hủy thành tế bào Dịch trích tế bào Phân hủy màng tế bào Ly tâm dịch trích tế bòa để tách các cặn không hòa tan được Mảnh vỡ tế bào DNA, RNA, protein Dịch trích tế bào Ly tâm - Phần trích của tế bào được xử lý để rút các thành phần, thu nhận DNA : Ngoài DNA, dịch chiết tế bào vi khuẩn còn chứa một lượng đáng kể protein và RNA. Vài bước trong quy trình có thể được dùng để loại bỏ các chất tạp nhiễm, còn lại DNA ở dạng tinh khiết. Một cách tiêu chuẩn để loại protein từ dịch chiết tế bào là cho phenol hoặc hỗn hợp tỉ lệ 1:1 phenol và cloroform. Chất hữu cơ đó sẽ hòa tan tủa protein nhưng giữ lại nucleic acid (DNA và RNA) trong dịch nước, sau đó qua ly tâm phân tách, tủa protein phân tử sẽ nằm ở lớp giữ của dịch nước (DNA, RNA) và lớp hữu cơ phenol. Dịch nước chứa acid nucleic sau đó được rút trích bằng pipette. Loại bỏ tạp nhiễm protein thông qua xử lý bằng phenol DNA + RNA Ly tâm tách lớp Dịch trích tế bào Trộn với phenol Proteins Phenol Với nhiều dịch chiết tế bào, thành phần protein quá nhiều đến nỗi việc trích chiết bằng phenol không đủ để tinh sạch hoàn toàn acid nucleic. Vấn đề này được giải quyết bằng việc xử lý phenol nhiều lần nhưng có điều không mong muốn là sau mỗi lần trộn và các bước ly tâm sẽ gây đứt gãy các phân tử DNA. Phương pháp xử lý dịch chiết tế bào là dùng protease như Pronase hay Proteinase K trước khi xử lý phenol. Các enzyme này phá gãy các polypeptide thành những đơn vị nhỏ hơn, để dễ dàng hơn trong phân tách phenol. Các phân tử RNA, đặc biệt là RNA thông tin (mRNA), được phân tách nhờ xử lý phenol nhưng hầu như vẫn còn chứa DNA trong lớp dịch nước. Cách hiệu quả duy nhất để tách RNA là dùng enzyme ribonuclease. Phân hủy nhanh chóng các phân tử đó thành các đơn vị nhỏ ribonucleotide. - Cô đặc dung dịch DNA thu được. Phương pháp cô đặc DNA được sử dụng phổ biến là ethanol precipitation. Trong môi trường muối Na+ tại nhiệt độ -20oC hoặc thấp hơn, ethanol nguyên chất kết tủa một cách hiệu quả các acid nucleic polymeric. Với dịch đặc DNA, ethanol được tách lớp ở phần trên của mẫu, các phân tử tủa ở mặt tiếp xúc. Một mẹo hay là sử dụng đũa thủy tinh nhúng xuyên qua dịch ethanol và dung dịch DNA, khuấy đũa trong dung dịch, các phân tử DNA sẽ bám chặt vào đũa và được kéo ra khỏi dung dịch ở dạng sợi dài (hình a). Hơn nữa, nếu dịch ethanol trộn với dịch loãng DNA, kết tủa có thể thu được bằng máy ly tâm (hình b). Và sau đó hòa tan lại vào trong một dung tích nước thích hợp. Tủa ethanol có một tiến bộ là tách rời dung dịch và các thành phần acid nucleic monomeric. - Thu hồi DNA nhờ tủa Ethanol. Ethanol nguyên chất được tách lớp lên phần trên của dịch cô đặc DNA. Các sợi DNA được tách ra từ đũa thủy tinh. Để dịch cô đặc ít nhất, ethanol được thêm vào (với tỉ lệ 2,5 thể tích ethanol nguyên chất trong một thể tích dung dịch DNA) và thu DNA tủa bằng phương pháp ly tâm. b)Tách chiết total cell DNA từ các sinh vật khác Vi khuẩn không phải là sinh vật duy nhất để trích DNA yêu cầu. Total DNA từ thực vật và động vật sẽ được sử dụng nếu như mục tiêu của dự án kỹ thuật di truyền là clone gene từ các sinh vật khác. Mặc dầu các bước cơ bản trong tinh sạch DNA tương tự nhau trên các sinh vật, những biến đổi phải được lưu ý để phát hiện ra những đặc trưng đặc biệt của những tế bào đang được sử dụng. Những hóa chất được sử dụng cho việc phá vỡ tế bào vi khẩn thường không phù hợp với các sinh vật khác:ví dụ như lysozyme, không tác động lên tế bào thực vật. Các enzyme phân hủy đặc biệt có thể được sử dụng cho hầu hết các loại thành tế bào nhưng thông thường là các kỹ thuật vật lý như nghiền lạnh vật liệu bằng cối và chày thì hiệu quả hơn. Mặt khác, hầu hết các tế bào độngvật không có thành tế bào và có thể được phân giải một cách đơn giản thông qua việc xử lý bằng chất tẩy. Một khám phá quan trọng khác là thành phần sinh hóa trong các tế bào đang được sử dụng để ly trích DNA. Ở hầu hết vi khuẩn, thành phần sinh hóa chính hiện diện trong tế bào là protein, DNA và RNA, vì vậy phải tiến hành việc chiết tách bằng phenol hay xử lý protease, sau đó là loại RNA bằng ribonuclease, thu được mẫu DNA tinh sạch. Tuy nhiên, các phương pháp đó có thể không đủ để tinh tạo ra một mẫu DNA tinh sạch nếu như các tế bào chứa một lượng đáng kể các chất sinh hóa khác. Đặc biệt, vói các mô thực vật thì phương pháp này rất khó khăn vì chúng thường chứa một lượng lớn carbohydrate, không thể tách ra bằng xử lý phenol.Thay vào đó phải sử dụng một phương pháp khác. Sử dụng chất tẩy cetyltrimethylammonium bromide (CTAB),tạo thành một phức chất không hòa tan với acid nucleic. Khi CTAB được cho vào dịch chiết tế bào thực vật, phức hợp nucleic acid-CTAB kết tủa, tách rời carbohydrate, protein, và các chất gây nhiễm trong dịch nổi. Kết tủa sau đó được thu nhận bằng phương pháp ly tâm và cho vào dung dịch muối NaCl 1M, hòa tan phức chất. Các acid nucleic được cô đặc nhờ phương pháp ethanol và RNA được tách nhờ xử lý ribonuclease. Phương pháp CTAB cho tinh sạch DNA thực vật c) Tách chiết DNA total từ mô động vật Ðể tạo dòng bộ gen (genome) và thực hiện lai (Southern hybridization) DNA động vật cần điều chế DNA động vật có phân tử lượng lớn và ít tạp nhiễm. Nhưng do DNA dài thường dễ bị đứt bởi enzyme phân giải cũng như các tác động cơ giới - vật lý nên khi điều chế phải sử dụng dụng cụ đã tiệt trùng và tránh hút DNA bằng ống hút có đầu lỗ nhỏ cũng như tránh lắc trộn mạnh. Có thể điều chế DNA từ mẫu vật đã đuợc bảo quản nhưng nếu điều chế từ vật liệu tổ chức tươi mới thì tốt hơn. Luợng DNA thu được thường phụ thuộc vào loại tổ chức nhưng thông thường từ mỗi gam tổ chức có thể thu đuợc khoảng 10 mg DNA. 1) Cắt nhỏ tổ chức nguyên liệu bằng kéo đến độ 0,1 g. Nếu tổ chức lẫn máu hoặc lông thì rửa truớc bằng dung dịch TNM. Trong trường hợp mô ung thư thường lẫn nhiều mô hoại tử thì làm sạch trước là cần thiết. Cần chú ý thực hiện trên nước đá hoặc trong phòng lạnh để tránh DNA bị phân giải (kể cả các bước tiếp theo). ( Dung dịch TNM chứa Tris-HCl (pH 7,5) 20mM, NaCl 0,1M và MgCl2 1,5mM.) 2) Cho vào mỗi gam tổ chức 20 ml dung dịch TNM, nghiền nhuyễn (bằng homogenizer, như Porter), quay li tâm 2.000 v/ph trong 5 phút ở 4 ºC, thu cặn. 3) Tráng cặn bằng dung dịch TNE, đổ bỏ nuớc mặt. Lại cho 5 ml TNE vào trộn đều thành huyền dịch rồi bổ sung thêm TNE cho đủ 20 ml, trộn đảo đều. ( Dung dịch TNE chứa Tris-HCl (pH 7,5) 10mM, NaCl 0,1M và EDTA 1mM.) 4) Thêm từ từ SDS 10% vừa thêm vừa trộn đảo nhẹ cho đạt mức 0,3% so tổng lượng. Thêm dung dịch proteinase 10 mg/ml cho đạt đến mức 1% so tổng luợng. Ủ 4 giờ dến qua dêm ở 60 °C. 5) Thêm lượng tương đương phenol, trộn đảo nhẹ khoảng 5 giờ đến 1 đêm. 6) Quay li tâm 3.000 v/ph trong 10 phút, dùng pipet có lỗ to hút phần nuớc, tránh khuấy động phần phenol. Lại chiết xuất bằng phenol một lần và bằng chloroform một lần nữa. 7) Thẩm tích đối 2 lít TE qua một ngày đêm có thay TE một lần. 8) Thêm RNase (DNase-free) 1 mg/ml đến mức 1/50 thể tích, ủ 37 °C trong 1 giờ. 9) Thêm lượng tương đương phenol, trộn đảo nhẹ trong 1 giờ. 10) Li tâm 3.000 v/ph trong 1 phút, hút lấy lớp nuớc bằng pipet có lỗ miệng lớn. 11) Thẩm tích đối TE qua đêm có thay ngoại dịch như trên. 12) Cho DNA thu được vào ống chất dẻo, bảo quản ở 4 ºC. Với DNA động vật có thể bảo quản 4 - 5 năm trong điều kiện này. Có nhiều loại vectơ dùng để thành lập thư viện bộ gen. Nhưng việc lựa chọn các vectơ này phụ thuộc vào: Tế bào mang DNA tái tổ hợp và những đặc tính của nó. Thời gian biểu hiện cần thiết. Kích thước của vật liệu di truyền cần thiết. Phần này nhóm chỉ trình bày việc tách chiết các vectơ tự nhiên có trong tế bào vi sinh vật như DNA plasmid và DNA phage. d) Tách chiết DNA plasmid Trong các thí nghiệm như phân tích gen thuờng cần luợng lớn plasmid nhưng với các thí nghiệm sàng lọc dòng thuần (clone screening) thì luợng nhỏ plasmid cũng dủ. Vì vậy, tùy vào mục đích thí nghiệm khác nhau mà vận dụng các phương pháp điều chế plasmid khác nhau. Nguyên tắc chung của việc điều chế plasmid trong kỹ thuật tái tổ hợp cũng là nguyên tắc chung của việc điều chế các plasmid có số phiên bản lớn (highcopy plasmids). Tiến trình bao gồm: 1) Huyền dịch hóa tế bào vi khuẩn trong dung dịch đệm, 2) Làm tan tế bào trong kiềm mạnh (pH cao, có thể cần xử lý enzyme phân giải protein và peptidoglycan vách tế bào vi khuẩn, đặc biệt vi khuẩn Gram dương), 3) Hạ pH môi trường về dưới trung tính bằng axit làm cho các protein tế bào biến tính kéo theo DNA nhiễm sắc thể và RNA cùng bị rối lại với nhau thành tủa, còn các DNA plasmid do có cấu trúc siêu xoắn nên không bị kéo vào hỗn hợp không tan dó, 4) Khử bỏ RNA còn sót bằng RNase 5) Tách DNA plasmid tan trong nước khỏi các thành phần không hòa tan bằng li tâm rồi tinh chế như đối với các DNA ngắn (chiết xuất bằng phenol hoặc chloroform, kết tủa bằng isopropyl alcohol, hoặc polyethylene glycol 6000, tức PEG 6000, hoặc ethanol trong muối Na, rửa bỏ muối khỏi DNA bằng ethanol 70%). + Ðiều chế luợng nhỏ DNA plasmid: - Phương pháp Birnboim: Phương pháp Birnboim chế DNA plasmid còn duợc gọi là phuong pháp kiềm. Mô tả duới đây cho việc điều chế DNA plasmid dòng thuần trong kỹ thuật DNA tái tổ hợp. 1) Dùng que cấy hoặc tam vô trùng lấy vi khuẩn từ khuẩn lạc trắng (của E.coli mang plasmid, trên đĩa thạch), cấy vào khoảng 2 - 5 ml môi truờng LB có chứa chất kháng sinh thích hợp (ví dụ ampicillin, 50 mg/ml đối với 28 plasmid pGEMT...). Môi trường LB chứa 10 g tryptone, 5 g yeast extract (cao nấm men), 10 g NaCl, hòa tan trong 1 lít nước cất, điều chỉnh trung tính bằng NaOH, hấp cao áp tiệt trùng. 2) Bồi dưỡng 6 - 16 giờ ở nhiệt dộ 37 ºC. 3) Chuyển 1,5 ml sang ống Eppendorf (phần còn lại nên bảo quản ở 4 ºC), quay li tâm 3 phút với vận tốc 5.000 v/ph. 4) Thêm 150 ml dung dịch glucose-lysozyme, trộn dều, để ở nhiệt độ phòng 5 phút. Ðể 5 phút ở nhiệt độ phòng hoặc 3 phút ở 37 ºC. Dung dịch glucose-lysozyme: glucose 50mM, Tris-HCl (pH 8,0) 25mM, EDTA 10mM và lysozyme 4 mg/ml. 5) Thêm 200 ml dung dịch kiềm. Trộn bằng cách đảo nhẹ ống nghiệm, chú ý từ bước này trở di không duợc lắc mạnh tránh tổn hại DNA. Ðể ở nước đá 5 phút. Dung dịch kiềm chứa NaOH 0,2N và SDS 1%. 6) Thêm 150 ml dung dịch potassium acetate ở 4 ºC, trộn dều, dể 5 phút. Dung dịch potassium acetate chứa 60 ml potassium citrate 5M, 11,5 ml acetic acid và 28,5 ml H2O. 7) Quay li tâm với vận tốc 12.000 v/ph ở 4 °C trong vòng 15 phút, chuyển nuớc mặt sang ống mới, bỏ phần cặn. 8) Thêm 400 ml phenol-chloroform, trộn dều, quay li tâm 5 phút với vận tốc 12.000v/ph. 9) Chuyển phần nước sang ống mới, thêm khoảng 800 ml ethanol, trộn đều rồi để 3 phút ở nhiệt độ phòng. 10) Quay li tâm 12.000 v/ph trong 5 phút, bỏ hết phần dịch lỏng. 11) Rửa phần cặn bằng ethanol 70%, rồi hòa tan phần cặn trong 50 ml TE. 12) Thêm 0,5 ml RNase A nồng độ 1,0 mg/ml (DNase-free), để 1 giờ ở 37ºC. 13) Thêm 30 ml dung dịch polyethylene glycol-NaCl, để 1 giờ ở 0 ºC. Dung dịch polyethylene glycol-NaCl chứa polyethylene glycol 6000 ở nồng độ 20% và NaCl 2,5M. 14) Li tâm 10 phút với vận tốc 12.000 v/ph. Hút bỏ nuớc mặt. 15) Rửa kết tủa bằng ethanol 70%, để khô hoàn toàn rồi thêm 50 ml TE. - Phương pháp đun sôi: 1) Thực hiện các buớc đầu từ 1 đến 4 như trong phương pháp trên 2) Hòa phần cặn (vi khuẩn) trong 200 ml dung dịch STET. Dung dịch STET chứa saccharose 8%, Triton X-100 0,5%, EDTA (pH 8,0) 50mM và Tris-HCl (pH 8,0) 10mM. 3) Thêm 20 ml dung dịch lysozyme. Trộn đều, để ít phút ở nhiệt độ phòng. Dung dịch lysozyme chứa lysozyme 10 mg/ml, Tris-HCl (pH 8,0) 10mM. Dung dịch lysozyme nên pha mới (chú ý hóa chất này bảo quản lạnh, khi lấy ra cần để cân bằng nhiệt độ với nhiệt độ phòng rồi mới mở nắp tránh đọng nuớc vào hóa chất khi còn lạnh), hoặc pha chuẩn bị truớc trong dung dịch glycerol 50% rồi bảo quản ở -20 °C cũng tốt. 4) Ðun cách thủy 1 phút. 5) Quay li tâm 12.000 v/ph trong 10 phút. Loại bỏ cặn bằng que tăm. 6) Thêm vào nuớc mặt 200 ml isopropyl alcohol, trộn, để ở nhiệt dộ phòng 10phút. 7) Quay li tâm 12.000 v/ph trong 10 phút ở 4 ºC, loại bỏ hết phần nuớc mặt. 8) Thêm 150 ml dung dịch sodium acetate 0,3M (pH 5,0), hòa dều cho tan rồi cho thêm 300 ml ethanol, trộn đều rồi để 10 phút ở -70 °C hoặc lâu hon ở -20 ºC để kết tủa DNA. 9) Quay li tâm 12.000 v/ph trong 10 phút ở 4 ºC, loại bỏ hoàn toàn nuớc mặt. 10) Tráng cặn bằng ethanol 70%, để khô hoàn toàn rồi hòa vào 50 ml TE. 11) Xử lý RNase A (DNase-free) ở nồng độ cuối là 10 mg/ml. 12) Kết tủa bằng ethanol rồi tráng bằng ethanol 70% và hòa tan trong TE ta có DNA plasmid sạch có thể cắt bằng enzyme hạn chế. + Ðiều chế luợng lớn DNA plasmid - Nuôi cấy vi khuẩn 1) Lấy vi khuẩn từ khuẩn lạc trắng bằng que cấy hoặc tăm đã tiệt trùng vào 5 ml môi truờng LB có thêm chất kháng sinh thích hợp (penicillin, chloramphenicol..., tùy thuộc vào loại plasmid vector có mang gen kháng thuốc đối với chất kháng sinh này hay chất kháng sinh khác). 2) Ủ 1 giờ ở 37 °C. 3) Chuyển lứa cấy vi khuẩn trên vào 400 ml môi truờng LB, tiếp tục nuôi cấy ở 37°C cho đến khi OD600 = ~ 0,8. 4) Thêm 2 ml chloramphenicol (dung dịch pha trong ethanol có nồng độ 34 mg/ml, bảo quản ở -20 °C), ủ tiếp khoảng 12 - 20 giờ. Bước gây cảm ứng này có thể không cần thiết đối với nhiều loại plasmid vector. 5) Quay li tâm 5.000 v/ph trong 10 phút để tập trung tế bào. Bỏ nuớc mặt. Thêm vào cặn 40 ml dung dịch STE ở 4 ºC, trộn đều tạo huyền dịch tế bào. Dung dịch STE chứa NaCl 0,1M, Tris-HCl (pH 7,8) 10mM và EDTA 1mM. 6) Chuyển sang ống li tâm cỡ 50 ml, quay li tâm 5.000 v/ph trong 10 phút, loại bỏ nuớc mặt. - Chiết xuất DNA 1) Cho vào (ống đã chuẩn bị ở bước 6 mục trên) 7 ml dung dịch glucose lysozyme, trộn đều tạo huyền dịch, để ở nhiệt độ phòng 10 phút. 2) Thêm 14 ml dung dịch kiềm (chứa NaOH 0,2N và SDS 1%), làm lạnh trên nuớc đá, vừa trộn đều nhẹ nhàng tránh làm đứt DNA, để lạnh 10 phút. 3) Thêm 10,5 ml potassium acetate, trộn đều, để 10 phút trong băng hay nước đá. 4) Quay li tâm 15.000 v/ph trong 20 phút ở 4 ºC, rồi chuyển dịch trong sang ống nghiệm 50 ml (Falcon, Corning...). 5) Thêm 0,6 lần isopropyl alcohol, trộn đều, để 10 phút ở nhiệt độ phòng. 6) Quay li tâm 3.000 v/ph trong 10 phút ở 4 ºC, loại bỏ hết phần nuớc mặt. 7) Rửa cặn bằng ethanol rồi để khô hoàn toàn (có thể dốc ngược ống trên giấy thấm, chú ý để hở miệng ống cho thoáng khí làm nhanh quá trình bay hơi của ethanol). Không cần làm khô trong chân không vì DNA quá khô sẽ khó hòa tan. 8) Hòa tan vào TE. - Ðiều chế plasmid bằng li tâm phân đoạn trong mật độ cesium chloride (CsCl) 1) Cho 3,7 g CsCl (bột tinh thể) vào 3,5 ml dịch plasmid rồi thêm 0,2 ml ethidium bromide 10 mg/ml. Trộn đều cho CsCl tan hoàn toàn. Lượng này vừa đủ cho rotor máy li tâm siêu tốc. 2) Chuyển dịch nêu trên sang ống nhựa chuyên dụng cho máy li tâm siêu tốc, nếu các ống chưa đầy hoàn toàn thì làm đầy ống bằng CsCl hoặc parafin lỏng, kiểm tra khối luợng các ống để dảm bảo rotor có khối lượng cân đối. 3) Hàn ống hoặc gài miệng ống theo thiết kế. 4) Ráp ống vào rotor máy li tâm, chú ý sự cân bằng của rotor. Quay li tâm 55.000 v/ph ở 15 °C trong 15 giờ (dùng rotor RPV 65 T Hitachi, chẳng hạn). 5) Tắt máy li tâm. Nhẹ nhàng lấy rotor khỏi máy. Tháo các ống nhựa li tâm khỏi rotor, thông thường trong dịch hình thành hai băng tách biệt thấy được duới UV (hình 6), băng duới là DNA plasmid vòng khép kín (closed circular plasmid DNA). Phần duới đáy tập trung các RNA. Dùng kim tiêm chọc thủng phần trên của ống hàn (hoặc mở nắp ống cài) cho thông khí (không thông khí thì sẽ không thể hút chiết phần dịch phía dưới qua kim tiêm). Giá ống li tâm đó vào kẹp đặt bên cạnh đèn tử ngoại để soi, rồi dùng kim tiêm chọc ngay phần duới của băng DNA plasmid, hút băng plasmid vào syringe, chú ý tránh hút phần khác, đặc biệt là băng DNA khấc (nick) phân bố ở lớp trên. Cho vào ống nghiệm cỡ 30 ml (ống Corex...). Hình 6: Phương pháp hút chiết băng DNA plasmid sau khi li tâm trong dịch chênh lệch mật độ cesium chloride. Chú ý mang găng tay, mặt nạ chống UV trong khi thực hiện, cẩn thận không hút băng bao gồm các DNA đứt đoạn phía trên và RNA phía duới. 6) Thêm vào một lượng tương đương butanol (hoặc propanol), trộn đều rồi li tâm 3.000 v/ph trong 1 phút butanol (propanol) cùng ethidium bromide sẽ nổi lên trên, hút bỏ lớp này rồi lặp lại 3 - 4 lần dể loại bỏ hoàn toàn thuốc nhuộm (hết màu là đuợc). 7) Thẩm tích đối TE để loại bỏ CsCl. Nếu không thẩm tích có thể áp dụng các buớc sau để loại trừ CsCl. Thêm hai lần TE, trộn đều rồi thêm 6 - 8 lần ethanol, quay li tâm 10.000 v/ph 20 phút ở 4 ºC, đổ bỏ nuớc mặt, thấm cho sạch nuớc, lại hòa tan trong 500 ml sodium acetate 3M rồi cho thêm ethanol bằng 2 lần thể tích dịch trong ống (1 ml), để 5 phút ở 0 ºC, quay li tâm như trên để thu tủa DNA plasmid. II) Cắt DNA bộ gen và DNA vectơ bằng enzyme cắt giới hạn (RE) - Enzyme cắt giới hạn: ( Restriction Enzyme ) Các enzyme giới hạn được phân lập từ các sinh vật prokaryote, có khả năng phân hủy DNA của bacteriophage để hạn chế khả năng sinh trưởng của chúng trong vi khuẩn. Hiện nay, người ta đã tìm thấy hơn 900 enzyme giới hạn khác nhau từ khoảng 250 chủng vi sinh vật. Enzyme giới hạn là nhóm endonuclease được khám phá vào cuối những năm 1960. RE chỉ cắt phân tử DNA ở những vị trí có dãy mã nucleotide nhất định mà chúng có khả năng nhận biết và RE có khả năng cắt DNA thành những đoạn có trọng lượng và kích thước khác nhau. Thuộc tính quan trọng này của enzyme giới hạn cho phép cắt DNA ở những vị trí chọn sẵn. Chính nhờ đặc tính này của enzyme mà người ta chia ra làm 3 loại : +Loại I: Khi enzyme nhận biết được trình tự, nó sẽ di chuyển trên phân tử DNA đến vị trí cách đó khoảng 1000-5000 nucleotide và giải phóng vài chục nucleotide. +Loại II: Enzyme nhận biết trình tự và cắt ngay vị trí đó (không có hoạt tính methyl hoá). +Loại III: Enzyme nhận biết một trình tự và cắt DNA ở vị trí cách đó khoảng 20 nucleotide. Nhưng trong thực tế chúng ta chỉ sử dụng RE loại II vì đó là nhóm duy nhất được sử dụng trong các thao tác sinh học phân tử. Mỗi RE nhận biết một trình nucleotide đặc trưng.Các trình tự này thường gồm 4-8 nucleotide (thường là 4 hay 6). Có 2 kiểu cắt: - Cắt đầu bằng (blunt ends) - Cắt đầu dính (cohesive ends) - Một số chú ý khi thiết lập một phản ứng thủy giải bởi RE: + Mỗi enzim giới hạn hoạt động tối thích trong các điều kiện khác nhau, tốt nhất ta nên tuân thủ đúng các khuyến cáo của nhà sản xuất (vì vậy mà các công ty enzyme thường cung cấp luôn dung dịch đệm ) + Các dung dịch đệm dùng trong phản ứng RE thường cơ bản khác nhau ở nồng độ NaCl. Do đó, khi trong một phản ứng mà cần sử dụng cùng lúc nhiều RE thì: (1) Nếu chúng hoạt động tốt trong cùng một dung dịch đệm thì có thể được sử dụng đồng thời. (2) Nếu yêu cầu về dung dịch đệm khác nhau thì DNA phải được cắt bởi RE hoạt động trong dung dịch đệm có nồng độ NaCl thấp hơn, sau đó thêm NaCl để đạt nồng độ cao hơn cần cho RE kia hoạt động và tiếp tục phản ứng thuỷ giải. + RE sẽ giữ được hoạt tính trong một dung dịch đệm chứa 50% glycerol nên luôn luôn chuyên chở và bảo quản trong điều kiện lạnh (-200C). Khi tiến hành phản ứng thuỷ giải hạn chế đặt enzyme ở những nhiệt độ không thích hợp, tốt nhất nên lấy RE ra ở phút chót sau khi đã đủ các thành phần khác của quá trình thao tác, nếu lấy enzyme ra khỏi tủ lạnh thì phải đặt trên nước đá và trong thời gian càng ngắn càng tốt trước khi cất trở lại vào -200C . + Enzyme cắt giới hạn rất đắt tiền, vì vậy phản ứng cắt thường chỉ thực hiện với lượng DNA tối thiểu, trong thể tích phản ứng tối thiểu (như thế sẽ tạo thuận lợi cho sự tiếp xúc enzyme - cơ chất). Tuy nhiên, phải đảm bảo thể tích RE không vượt quá 1/10 thể tích phản ứng vì glycerol ức chế hoạt động enzim. + Kết quả hoạt động của enzim cắt giới hạn rất phụ thuộc vào độ tinh sạch của DNA vì vậy trong khâu tách chiết thì DNA phải đủ độ tinh khiết. Các chế phẩm DNA còn lẫn đệm chiết, phenol, hoặc ethanol làm giảm chất lượng hoạt động của enzyme, chúng ta phải loại bỏ chúng để enzyme hoạt động hiệu quả hơn. + Các phản ứng cắt không hoàn toàn ( phản ứng chỉ cắt 1 phần) được thực hiện với nồng độ RE thấp hoặc ủ trong thời gian ngắn. Các phân đoạn nhỏ hơn khi kéo dài thời gian phản ứng. Để bảo đảm toàn bộ bộ gen, được chứa trong các dòng của thư viện, tổng các DNA chèn trong các dòng của thư viện phải nhiều hơn ba lần hàm lượng DNA trong bộ gen. VD: Nếu một bộ gen có 4 x 106 bp và kích thước trung bình của mỗi đoạn chèn là 1.000 bp, thì cần phải 12.000 dòng cho ba lần phủ. Đối với bộ gen người 3,3 x 109 bp thì cần khoảng 80.000 dòng nhiễm sắc thể nhân tạo vi khuẩn, có kích thước đoạn chèn là 150.000 bp tạo ra một thư viện với bốn lần phủ kín. Ta có công thức xác lập mối quan hệ: N = ln(1 – P)/ln(1 – f) N: là số dòng. P: là xác suất tìm thấy của một gen đặc hiệu. F: tỷ lệ giữa chiều dài của đoạn chèn trung bình và kích thước của toàn bộ bộ gen. + Cuối cùng do các vị trí RE không nằm ở những vị trí ngẫu nhiên một số phân đoạn có thể quá lớn để nhân dòng. Nếu điều này xảy ra thì rất khó hoặc không thể tìm thấy một trình tự DNA đích đặc biệt bởi vì thư viện không đầy đủ. Vấn đề này có thể khắc phục được nhờ tạp ra một thư viện các RE khác nhau. Hiện nay, người ta đã biết 3000 loại enzyme với hơn 230 trình tự cắt đặc hiệu. + Rõ ràng, số lượng dòng của một thư viện bộ gen phụ thuộc vào quy mô mức độ bao phủ, kích thước của bộ gen của sinh vật, và kích thước trung bình của đoạn chèn trong vectơ. Để ngăn cản sự tự gắn lại của DNA nguồn và vectơ người ta dùng enzyme alkaline phosphate để lọai nhóm 5’ phosphate. - Enzyme Alkaline phosphatase Được ly trích từ E.coli hay từ ruột bê, enzyme xúc tác sự loại bỏ nhóm 5’ phosphate của DNA, RNA và các nucleotide tự do. Enzyme được dùng để : + Loại nhóm 5’ phosphate của DNA hay RNA trước khi đánh dấu phóng xạ đầu 5’ của chúng bằng 32P. + Loại nhóm 5’ phosphate của DNA hay RNA. Trong kỉ thuật tạo dòng, khi một vector được “mở ra” bằng một RE, rồi được loại nhóm 5’ phosphate thì nó không thể tự nối lại. Chỉ khi có một DNA lạ có mang các đầu 5’ phosphate cần thiết được đưa vào thì phản ứng nối mới xảy ra giữa vector và DNA lạ. + T4 polinucleotide kinase và alkaline phosphate thường được sử dụng đồng thời trên vector và đoạn DNA cần gắn xen trong kỉ thuật tạo dòng. III) Gắn DNA vào vectơ tạo ra DNA tái tổ hợp: Các đoạn DNA thu được từ phản ứng cắt giới hạn (sau khi xử lý bằng RE và enzyme alkaline phosphate) được gắn vào vectơ tạo dòng bằng cách dùng enzyme DNA ligase. Một số lượng lớn các vectơ tạo vòng được phát triển cho việc xây dựng các thư viện DNA, chọn lựa vectơ nào phụ thuộc vào phạm vi kích thước của các đoạn DNA được tạo dòng. Các Enzyme nối Ligase Một số enzyme nối ligase được dùng là : E.coli DNA ligase, T4 DNA ligase, T4 RNA ligase. Nhưng chúng thường được kết hợp với 2 enzyme khác là T4 polyNukinase. 1/ E.coli DNA ligase Enzyme được ly trích từ E.coli. Enzyme này được dùng để xúc tác phản ứng nối hai trình tự DNA có đầu so le 5’ ACGG + TAATCGCCA 3’ 3’ TGCCATTA GCGGT5’ E.coli DNA ligase 5’ AGGGTAATCGCCA 3’ 3’ TGCCATTAGCGGT 5’ 2/ T4 DNA ligase Có nguồn gốc từ phage T4 xâm nhiễm E.coli. Enzyme này có cùng khả năng với E.coli DNA ligase nhưng đặc biệt còn có khả năng nối hai trình tự DNA đầu bằng nên nó là ligase được chuộng nhất. 3/ T4 RNA ligase Enzyme được ly trích từ phage T4 xâm nhiễm E.coli. Xúc tác sự nối hai trình tự RNA bằng liên kết phosphodiester. Thường được sử dụng để đánh dấu phóng xạ đầu 3’ của các phân tử RNA dùng làm mẫu dò phân tử. 4/ T4 polynucleotide kinase Có nguồn gốc từ phage T4 xâm nhiễm E.coli. Enzyme này xúc tác chuyển nhóm -phosphate của ATP cho đầu 5’ cũa DNA hay RNA. Tùy điều kiện thực nghiệm có thể xảy ra hai kiểu phản ứng : (1) Nhóm -phosphate được chuyển đến đầu 5’ cũa một DNA đã mất nhóm phosphate ; (2) khi có một lượng thừa ADP, phản ứng mang tính thuận nghịch, DNA chuyển nhóm phosphate cho ADP và nhận nhóm - phosphate (thường có đánh dấu phóng xạ) từ một phân tử [ -32P]ATP. Enzyme còn có hoạt tính phosphate. Các ứng dụng chính cũa enzyme này là: Đánh dấu phóng xạ đầu 5’ cũa DNA trong các kỉ thuật xác định trình tự DNA theo phương pháp Maxam và Gibert, dùng làm mẫu dò phân tử trong các kỉ thuật lai…. Phosphoryl hóa các trình tự DNA không có nhóm phosphate đầu 5’ để chuẩn bị cho phản ứng nối (ligation) trong phương pháp tạo dòng. IV) Đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ: Công đoạn này nhằm mục đích sử dụng bộ máy của tế bào chủ để sao chép vector tái tổ hợp thành một số lượng lớn bản sao .Tuỳ thuộc loại tế bào chủ , người ta sử dụng một kĩ thuật chuyển thích hợp. Nhiều hệ thống tế bào chủ khác hau được sử dụng nhằm mục đích: Nuôi số lượng lớn để tách chiết plasmid cho thí nghiệm tạo dòng. Dùng để biểu hiện gen, đặc biệt ở Eukảyote bậc cao như động vật và thực vật. Dùng để sản xuất các protein tái tổ hợp. Hai loại tế bào chủ thông dụng nhất là : (1) tế bào vi khuẩn , thường là E.coli ; rất thông dụng vì thao tác dễ dàng và không tốn kém lại sinh sản nhanh ; tế bào eukaryote (tế bào động thực vật nuôi cấy hay tế bào nấm men ) ; loại tế bào chủ này chỉ được sử dụng vào những mục đích cụ thể , ví dụ như khi người ta cần nghiên cứu in vivo sự điều hoà biểu hiện các gen eukaryote hay khi protein cần sản xuất phải được tổng hợp và biến đổi nhờ các phản ứng đặc trưng cho tế bào eukaryote,… Một số phương pháp thông dụng để biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ: a) Hóa biến nạp: - DNA tái tổ hợp được ủ với số lượng lớn tế bào vi khuẩn chưa có plasmid có khả năng dung nạp. Xử lý CaCl2 lạnh, kèm sốc nhiệt (42oC trong 2 phút) thì hiệu quả tạo các thể biến nạp cao (105 – 106 thể biến nạp/1mg của DNA siêu xoắn). b) Điện biến nạp: Phương pháp nàu sử dụng dòng điện cao thế cục bộ theo xung làm tế bào hấp thụ DNA nên gọc là điện biến nạp. Lúc đầu, nó được sử dụng ở tế bào động vật có vú, về sau cho cả tế bào thực vật. Hiệu quả biến nạp cao, có thể lên đến 109 – 1010 thể biến nạp/1mg DNA. Ngoài ra còn rất nhiều cách biến nạp khác nữa. V) Tế bào chủ được nuôi cấy, và hình thành những dòng mới: Hầu hết các vi sinh vật có thể tăng trưởng trong môi trường lỏng (môi trường canh) không quá khó khăn. Môi trường nuôi cấy phải cung cấp một hỗn hợp cân bằng chất dinh dưỡng thiết yếu trong dung dịch quy định cho phép vi khuẩn sinh trưởng và phân chia hiệu quả. Hai môi trường tăng trưởng điển hình: M9 là một ví dụ của defined medium trong đó tất cả các thành phần đều được biết. Môi trường chứa hỗn hợp các chất dinh dưỡng vô cơ để cung cấp các yếu tố thiết yếu như nitrogen, Mg, Ca, hơn nữa là cung cấp glucose bổ sung cacbon và năng lượng. Thực tế, có các yếu tố tăng trưởng cộng thêm như trace elements và vitamin, phải được thêm vào môi trường M9 trước để hỗ trợ cho sự tăng trưởng của vi khuẩn. Chính xác, thành phần bổ sung phụ thuộc vào mỗi loại vi khuẩn. Môi trường thứ hai có sự khác biệt hơn. LB là hỗn hợp phức tạp hay undefined medium, tính chất và số lượng của các thành phần không được xác định. Đó là do hai thành phần, tryptone và phần trích từ nấm men, là một phức hợp hóa học phức tạp. Tryptone cung cấp amino acid và các peptide nhỏ. Dịch trích từ nấm men (tế bào nấm men trong đường tiêu hóa) cung cấp nitrogen cùng với đường, các chất dinh dưỡng vô cơ và hữu cơ. Môi trường phức tạp như LB ( ). Define medium phải được sử dụng khi việc nuôi cấy vi khuẩn được tiến hành dưới điều kiện kiểm soát tuyệt đối. Trong môi trường LB tại 370C, được cung cấp oxi bằng việc lắc với tốc độ 150-250 r.p.m trên trục quay, tế bào E.coli phân chia 20 phút một lần hoặc hơn cho đến khi dịch nuôi cấy đạt được một độ cực đại. VI) Sàng lọc thư viện gen để nhận trình tự đích: Sau khi thư viện gen được tạo ra, cần phải nhận dạng các dòng với trình tự đích. Các phương pháp thông dụng được sử dụng để nhận dạng: - Lai DNA với mẫu dò DNA đánh dấu sau đó sàng lọc để chọn dấu mẫu dò bằng phép chụp ảnh phóng xạ. - Sàng lọc để chọn sản phẩm protein bằng phương pháp miễn dịch, thử hoạt tính protein, hoặc thử nghiệm bổ trợ (di truyền) chức năng. Phương pháp sử dụng mẫu dò DNA : Đây là phương pháp thông dụng nhất hiện nay. a) Nguyên tắc chung: Sự có mặt của trình tự DNA đích trong một mẫu DNA có thể được xác định bằng mẫu dò DNA. Quy trình này được gọi là lai DNA, phụ thuộc vào sự tạo thành các cặp bazơ bền giữa mẫu dò và trình tự đích. Lai DNA là khả thi vì DNA sợi kép có thể được chuyển hóa thành sợi đơn bằng xử lý nhiệt hoặc kiềm. Xử lý DNA bẻ gãy các liên kết hydro liên kết các bazơ với nhau (sự biến tính), nhưng không ảnh hưởng đến các liên kết phosphodieste của khung DNA. Nếu dung dịch xử lý nhiệt được làm lạnh nhanh, các sợi có thể giữ nguyên tình trạng đơn. Tuy nhiên, nếu nhiệt độ của dung dịch DNA được xử lý nhiệt và làm nguội dần, cấu hình dạng xoắn kép của DNA có thể được tái lập nhờ quá trình bắt cặp bazơ giữa các nucleotide bổ trợ (sự hồi tính).Quy trình làm nóng và làm nguội dần DNA sợi kép này được gọi là sự gắn nối. Khi DNA từ các nguồn khác nhau với các trình tự đồng dạng được trộn với nhau, được đun sôi tới 100oC, và làm nguội dần, sẽ có một số phân tử DNA lai trong số các sản phẩm gắn nối, đó là các sợi DNA kép được tạo ra bởi các sợi có nguồn gốc khác nhau. b) Các bước thực hiện: + Tạo DNA mẫu dò: - Protein cần nghiên cứu được tách chiết ,tinh sạch ; vài trình tự ngắn (15-20 amino acid) của protein được xác định. Do mã di truyền có tính thoái hoá nên tất cả các trình tự trên được xử lí bằng kĩ thuật vi tính để xác định xem trong số nhiều trình tự khả hữu cùng tương ứng với một trình tự amino acid , trình tự oligonucleotide (thường từ 100-1000 nucleotide) nào phù hợp nhất với thực tế .Trình tự này được tổng hợp với số lượng lớn và được đánh dấu phóng xạ. + Sàng lọc bằng lai DNA mẫu dò với DNA mục tiêu: Thư viện DNA bộ gen thường được sàng lọc bằng cách cấy các tế bào biến nạp lên môi trường sinh trưởng của một đĩa gốc và sau đó chuyển mẫu của mỗi khuẩn lạc sang giá nền rắn như nitrocellulose hoặc nylon, phá vỡ màng tế bào, khử protein, và làm biến tính DNA, cho DNA bám vào giá nền. Tại bước này, một mẫu dò đánh dấu được bổ sung, và nếu phản ứng lai xảy ra, các tín hiệu được quan sát thấy trên phép chụp ảnh bằng phóng xạ. Sau đó các khuẩn lạc từ đĩa gốc tương ứng với các mẫu chứa DNA lai được phân lập và nuôi cấy. Do hầu hết các thư viện được tạo ra bằng cách cắt từng phần, một số lớn khuẩn lạc có thể đáp ứng dương tính đối với đĩa thạch. Nhiệm vụ tiếp theo là xác định xem dòng nào, nếu có, chứa trình trự đầy đủ của gen đích. Các phân tích sơ bộ sử dụng các kết qua điện di và lập bản đồ RE cho phép xác định chiều dài của mỗi đoạn chèn và nhận dạng những đoạn chèn trùng nhau và những đoạn chèn gối nhau. Nếu một đoạn chèn trong bất kỳ một dòng nào đủ lớn để bao phủ đủ một gen, thì gen đầy đủ này có thể được nhận biết sau quá trình đọc trình tự DNA bởi vì nó có một codon mở đầu và một codon kết thúc và một bộ nucleotide tiếp giáp nhau mã hóa cho protein đích. Một cách có thể lựa chọn, một gen có thể được ráp lại bằng cách sử dụng các trình tự gối nhau từ các dòng khác nhau. Thật không may, không có gì bảo đảm là một trình tự hoàn chỉnh của một gen đích sẽ có mặt trong một thư viện gen đặc biệt. Nếu việc tìm kiếm một gen nguyên vẹn thất bại, thì một thư viện khác có thể được lập ra bởi một RE khác và sàng lọc với mẫu dò ban đầu hoặc mẫu dò dẫn xuất từ thư viện đầu tiên. Mặt khác, như sẽ thảo luận ở phần sau trong chương trình này, các thư viện chứa các phân đoạn DNA lớn hơn gen của sinh vật sơ trung bình có thể được lập ra để tăng khả năng một số thành viên của thư viện sẽ mang một phiên bản hòan thiện của gen đích. 2. Sàng lọc bằng phép thử miễn dịch Các phương pháp thay thế khác được sử dụng để sàng lọc thư viện khi không có mẫu dò DNA. Ví dụ, nếu một trình tự DNA nhân dòng được phiên mã và dịch mã, sự có mặt của protein, hay một phần của nó, có thể được xác định bằng một phép thử miễn dịch. Về mặt kỹ thuật, phương pháp này phổ cập hơn là phương pháp lai DNA. Mãu của mỗi khuẩn lạc được chuyển sang vị trí đã biết trên giá nền, ở đó các tế bào được phá vỡ và protein giải phóng ra được gắn vào giá nền. Giá nền có protein gần được xử lý bằng kháng thể (kháng thể sơ cấp), kháng thể này liên kết đặc hiệu với protein được mã hóa bởi gen đích. Tiếp theo phản ứng liên kết giữa kháng thể sơ cấp với protein đích (kháng nguyên), các kháng thể không liên kết được lọai bỏ bằng cách rửa trôi, và giá nền được xử lý với một kháng thể thứ hai (kháng thể thứ cấp) đặc hiệu cho kháng thể sơ cấp. Trong nhiều hệ thống thử, kháng thể thứ cấp có một enzyme, như phosphataza kiềm, gắn vào nó. Sau khi giá nền được rửa , một số cơ chất không màu được bổ sung vào. Nếu kháng thể thứ cấp đã liên kết với kháng thể sơ cấp, cơ chất không màu được thủy phân bởi enzyme tấn công và tạo ra một hợp chất có màu tích tụ ở nơi phản ứng. 3. Sàng lọc bằng hoạt tính protein Lai DNA và các phép thử miễn dich họat động tốt cho nhiều loại gen và sản phẩm gen. Nếu gen đích tạo ra một enzyme mà bình thường không được tổng hợp bởi tế bào chủ, một phép thử đĩa trực tiếp (in situ) có thể được tiến hành để nhận dạng các thành viên của thư viện mang gen đặc biệt mã hóa cho enzyme đó. Những gen mã hóa cho α-amylaza, endoglucanaza, β-glucosidase, và nhiều enzyme khác từ các sinh vật khác nhau được phân lập theo con đường này. Trong một số trường hợp, các tế bào của một thư viện bộ gen được cấy lên môi trường có bổ sung một cơ chất đặc hiệu; nếu cơ chất được thủy phân, một phản ứng so màu nhận dạng khuẩn lạc mang gen đích. Ví dụ, để phát hiện ra một gen lipase vi khuẩn nhân dòng, các tế bào biến nạp được nuôi cấy với sự có mặt của trioleoglyxerol và thuốc nhuộm huỳnh quang rodamin B. Do kết quả thủy phân của cơ chất, các khuẩn lạc dương tính có các vòng phát quang màu cam khi soi dưới ánh sáng cực tím. Các hệ thống phát hiện khác không dựa trên phản ứng phát quang để nhận ra các gen đặc biệt. Ví dụ, một tế bào biến nạp với gen mã hóa hydrolase axit mật từ Lactobacillus plantarum được phát hiện bằng cách cho sinh trưởng các thành viên của thư viện bộ gen với sự có mặt của muối mật. Trong trường hợp này, khuẩn lạc hydrolase dương tính dễ dàng được nhận dạng do nó bị vây quanh bởi một vòng axit mật tự do kết tủa. Thử nghiệm bổ trợ chức năng (di truyền) là một cách ứng dụng khác để phân lập các gen mã hóa cho enzyme. Quy trình bao gồm sự biến nạp tế bào chủ có khiếm khuyết di truyền đặc biệt bằng các plasmid của thư viện DNA được xây dựng từ một sinh vật kiểu dại bình thường và chọn lọc các tế bào biến nạp có chức năng bình thường. Gen nhân dòng có thể bắt nguồn từ cùng một loài hoặc loài khác, sự bổ trợ chức năng tương đồng và khác loại, tương ứng. Trong thực tế, tế bào E.coli và nấm men với các đột biến ảnh hưởng tới các con đường hóa sinh khác nhau thường được sử dụng làm tế bào chủ cho nhân dòng gen bổ trợ chức năng. Trong nhiều thí nghiệm, protein có xuất xứ từ gen nhân dòng tạo khả năng cho tế bào chủ phát triển trong môi trường tối thiểu; trong khi đó sự phát triển của các tế bào đột biến cần sự bổ sung của một hợp chất đặc biệt vào môi trường. Tương tự như vậy, các gen đóng vai tro trong sinh tổng hợp kháng sinh, tạo các nốt rễ, các quy trình khác nhau cũng được phân lập theo con đường này.