Thu nhận và tinh sạch phytase ngoại bào từ nấm men sporobolomyces japonicus (L9) - Hoàng Quốc Khánh

TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 91-98 91 THU NHẬN VÀ TINH SẠCH PHYTASE NGOẠI BÀO TỪ NẤM MEN Sporobolomyces japonicus (L9) Hoàng Quốc Khánh1*, Ngô Đức Duy1, Đào Thị Thu Hiền1, Trịnh Phong Vân2 (1)Viện Sinh học nhiệt đới, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, (*)hoangqk@gmail.com (2)Đại học Kinh tế Kỹ thuật Bình Dương TÓM TẮT: Phytase từ nấm men Sporobolomyces japonicus (L9) phân lập từ rừng Nam Cát Tiên được nuôi cấy trong môi trưởng YPD cải tiến cho hoạt độ phytase là 2,720 UI/ml và nhiệt độ và pH tối ưu cho phytase thu nhận là 40oC, pH 4,0. Tác nhân tủa thích hợp cho phytase là ethanol 96%, với hoạt tính riêng đạt được là 312,924 UI/mg protein. Các ion Ca2+ nồng độ 1 mmol/ml làm giảm đến 97% hoạt độ phytase và Mn2+ làm giảm đến 98% hoạt độ phytase ở nồng độ 5 mmol/ml. Hoạt độ riêng của phytase là 187,942 đối với peak 1 và 286,388 đối với peak 2. Hoạt độ riêng của tổng 2 peak tăng 1,8 lần so với mẫu trước sắc ký. Hiệu suất thu hồi protein đạt 95,05% và hiệu suất hoạt độ đạt 90,75%. Hằng số Michaelis (Km) của phytase của chủng Sporobolomyces japonicus (L9) Km= 0,0313. Điều này cho thấy ái lực cao giữa phytase với cơ chất sodium phytate. Trọng lượng phân tử phytase của sporobolomyces japonicus là 36,90 KDa. Từ khóa: Sporobomyces japonicus, phytase, hoạt độ riêng, Ca2+, Mn2+, Km. MỞ ĐẦU Phytase là một enzyme acid phosphohyrolase, xúc tác thủy phân acid phytic thành phosphate vô cơ và những dẫn xuất myo- inositol phosphate. Phytase được tìm thấy ở vi sinh vật như nấm mốc, vi khuẩn, mấn men... Phytase được chú ý ứng dụng trong công nghệ sinh học, đặc biệt trong việc giảm nhiễm photpho ở những vùng chăn nuôi tập trung [2]. Sự thủy phân acid phytic bằng phytase sẽ không sinh ra những độc tố, vì vậy, khai thác phytase trong công nghiệp sẽ thân thiện với môi trường và sẽ hỗ trợ trong sự phát triển các công nghệ mới. Hiện nay, phytase được quan tâm và nghiên cứu nhiều, đặc biệt là phytase từ nấm mốc bởi vì nấm mốc có khả năng sản xuất phytase có hoạt tính cao [5]. Phytase của vi khuẩn và nấm men cũng được quan tâm nghiên cứu và ứng dụng [4]. Nghiên cứu sản xuất phytase từ nấm men cũng là một hướng quan trọng so với nấm mốc bởi vì nấm men đảm bảo an toàn nhiều hơn trong ứng dựng chế biến thực phẩm cho người và gia súc, và nấm men không sinh ra độc tốc. Ngoài ra, công nghệ sản xuất phytase từ nấm men cũng đơn giản hơn so với nấm mốc. Trong khuôn khổ hợp tác với BIOTEC (Thái Lan), chúng tôi đã sưu tập một số chủng nấm men tại vườn quốc gia Cát Tiên (số liệu chưa xuất bản). PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu, hóa chất và môi trường Chủng nấm men Sporobolomyces japonicus (L9) được phân lập từ vườn quốc gia Cát Tiên, trong bộ sưu tập của Phòng Vi sinh ứng dụng, Viện Sinh học nhiệt đới, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Dung dịch đệm và thuốc khử: Đệm acetate 0,2 M, pH 5,5; đệm glycine-HCl 0,2 M, pH 2,0, 2,5, 3,0 và 3,5; đệm Tris-HCl 0,2 M, pH 7,0, 7,5 và 8,0 [3]. Coomassive Brilliant blue, Thuốc thử Bradford (Bio-Rad). Môi trường: Yeast Malt (YM) và Yeast Malt Agar (YMA); môi trường YM bổ sung 20% Glycerol; môi trường chọn lọc nấm men sinh tổng hợp phytase: môi trường Schopfer; môi trường lên men sinh tổng hợp phytase: môi trường bột bắp; môi trường Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) với 0,5% Na-phytate. Phương pháp Thí nghiệm về ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của enzyme được thực hiện như sau: phản ứng enzyme và cơ chất tiến hành trong khoảng pH 2,0 đến 7,5 ở nhiệt độ 37oC trong thời gian là 15 phút. Các loại đệm thực hiện trong thí nghiệm có nồng độ 200 mM bao gồm HCl (pH 2,0-3,5), acetate (pH 4,0-6,5) và Tris-HCl (pH 7,0-7,5). Thí nghiệm về ảnh hưởng của nhiện đô thực hiện trong dãy nhiệt từ 30oC đến 80oC trong thời gian là 15 phút. Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của ion kim loại lên hoạt tính Hoang Quoc Khanh, Ngo Duc Duy, Dao Thi Thu Hien, Trinh Phong Van 92 phytase ủ trong sự có mặt của các ion kim loại Ca2+, Cu2+, Fe2+, Fe3+, Mg2+, Zn2+, Mn2+ và chất ức chế EDTA với nồng độ 1 mM/ml và 5 mM/ml ở 37oC trong 15 phút để xác định hoạt tính còn lại của phytase. Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đo độ đục và buồng đếm hồng cầu; xác định hoạt tính enzyme phytase theo phương pháp Murphy và Riley [3]; xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradfrod [1]; tinh sạch enzyme bằng phương pháp sắc ký lọc gel (Biogel P-100) mô tả bởi Bio-Rab; xác định trọng lượng phân tử của phytase bằng phương pháp chạy điện di SDS-PAGE [1]. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Sàng lọc sơ bộ chủng nấm men sinh tổng hợp phytase Từ bộ sưu tập về nấm men thu thập từ rừng Nam Cát Tiên, chúng tôi đã sàng lọc từ 37 chủng nấm men và xác định những chủng nấm men có khả năng sinh tổng hợp phytase. Dựa vào các kết quả nghiên cứu sơ bộ, chúng tôi chọn ra 3 chủng nấm men (định danh dựa vào vùng gen 26S rDNA thuộc vùng D1/D2) là Sporobolomyces japonicus (L9), Sporobolomyces carnicolor (L62) và Cryptococcus liquefaciens strain MZKI K-490 (L40), có khả năng sinh tổng hợp phytase cao trong môi trường bột bắp là 1,63 UI/mol và YPD cải tiến có bổ sung 0,5% natri phytate làm nguồn cơ chất cảm ứng. Chúng tôi nhận thấy, chủng L9 cho hoạt độ cao nhất 1,46 UI/ml, nên chúng tôi chọn chủng L9 vì quá trình thu nhận enzyme thuận lợi hơn môi trường bột bắp và được định danh là chủng Sporobolomyces japonicus với accession number AY07009.1. Khảo sát thời gian nuôi lên men thích hợp cho sinh tổng hợp phytase của chủng Sporobolomyces japonicus (L9) Tiến hành khảo sát thời gian nuôi cấy từ chủng nấm men L9 trong môi trường YPD 0,5% sodium phytate được thu nhân mẫu sau mỗi 24 giờ và thời gian lên men trong 10 ngày. Kết quả thu được theo hình 1 cho thấy, phytase được tổng hợp trong giai đoạn sớm của quá trình lên men và đạt hàm lượng cao nhất ở ngày thứ 5 (1,49 UI/ml). Hoạt tính enzyme bắt đầu giảm nhẹ ở ngày thứ 6, 7, 8 và giảm mạnh ở ngày lên men thứ 9 và 10. Sự tăng giảm hoạt tính của phytase tương ứng với sự thay đổi mật độ tế bào theo thời gian lên men. Hình 1. Ảnh hưởng thời gian lên men đến hoạt tính phytase của chủng Sporobolomyces japonicus (L9) TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 91-98 93 Hình 2. Ảnh hưởng của tỉ lệ giống bổ sung ban đầu đến quá trình sản xuất phytase Khảo sát tỉ lệ bổ sung giống thích hợp cho sản xuất phytase Chủng Sporobolomyces japonicus (L9) được hoạt hóa trong môi trường Schopfer sau 48 giờ, lần lượt bổ sung tỉ lệ giống (v/v) 1%, 2%, 3%, 4%, 5% và 6% (mật độ tế bào là 6.108 CFU/ml) vào môi trường YPD bổ sung 0,5% sodium phytate. Sau 5 ngày lên men, hoạt tính phytase và mật độ tế bào của dịch lên men được xác định kết quả trên hình 2, với tỉ lệ giống từ 3% đến 6% có hoạt tính phytase tương đối cao và hàm lương phytase ở 4% là cao nhất (2,72 UI/ml). Kết quả trên cho thấy, tỷ lệ giống bổ sung ban đầu 4% thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp phytase. Khảo sát các tác nhân tủa thích hợp để thu nhận phytase Sau khi lên men sản xuất phytase ở những điều kiện thích hợp, việc thu nhận và tinh sạch enzyme phytase cũng là một trong những khâu quan trọng trong việc khảo sát các tác nhân tủa ở những nồng độ khác nhau lên hoạt tính enzyme phytase, chúng tôi sử dụng các tác nhân tủa như ethanol 96%, acetone và ammonium sulfate kết quả trình bày ở bảng 2. Bảng 1. Hoạt độ phytase theo chủng vi sinh vật Chủng khảo sát Hàm lượng protein HĐ chung mg /ml UI/ml L9 0,049 1,455 L40 0,026 0,451 L62 0,031 0,347 Bảng 2. So sánh hoạt độ phytase theo các tác nhân tủa Tác nhân tủa Lượng tủa (g) Hàm lượng protein HĐ chung HĐ riêng mg /g UI/gCPE UI/mg protein Cồn 1,1043 0,205 63,885 311,365 Acetone 1,1156 0,457 48,418 106,006 Muối amôn 1,1337 0,363 78,447 215,932 CPE - Chế phẩm enzyme Như vậy, dựa vào kết quả hoạt tính riêng thì ethanol 96% với tỉ lệ được chọn là tác nhân tủa thích hợp nhằm thu nhận phytase của chủng Sporobolomyces japonicus (L9). Khảo sát sinh lý và sinh hóa của phytase được sinh tổng hợp bởi chủng Sporobolomyces japonicus (L9) Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính phytase Hoang Quoc Khanh, Ngo Duc Duy, Dao Thi Thu Hien, Trinh Phong Van 94 Hình 3. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính phytase Kết quả về ảnh hưởng của pH lên hoạt tính phytase thể hiện ở hình 3. Biên độ pH giao động trong khoảng pH 4,0- 6,5 cho hoạt tính phytase tốt, nhưng và cao nhất là pH = 4,0 (74,104 UI/g), tuy nhiên trong dãy pH 2,0-3,5 thì hoạt tính phytase tương đối yếu. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính phytase Kết quả theo dõi ảnh hưởng của nhiệt độ cho thấy, phytase đạt hoạt tính cao ở nhiệt 40oC, khi nhiệt độ trên 70oC thì hoạt độ phytase giảm mạnh (hình 4). Hinh 4. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính phytase TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 91-98 95 Ảnh hưởng của ion kim loại lên sự ổn định của phytase Kết quả về ảnh hưởng của ion kim loại lên sự ổn định của phytase được trình bày ở hình 5. Khi cho phytase tương tác với các ion kim loại trong 2 nồng độ là 1 mM và 5 mM chứng tỏ nhận thấy, có sự tương tác khác nhau, nồng độ 5 mM kìm hãm khả năng hoạt động của enzyme mạnh hơn so với nồng độ 1 mM. Khi nồng độ 1 mM, thì sự kìm hãm hoạt tính phytase của ion Fe3+ (hoạt tính còn lại 87,6%) ít hơn so với những ion khác. Trong khi đó, cả hai nồng độ của ion Ca2+ đều kìm hãm hoạt động phytase và các ion còn lại cũng tương tự. Tinh sạch enzyme bằng phương pháp sắc ký lọc gel Tinh sạch enzyme phytase bằng phương pháp sắc ký lọc gel sau khi đã tủa và hòa tan trong đệm acetate pH 4,0. Kết quả sau khi chạy sắc ký cho thấy 2 đỉnh theo hình 6, trong đó, đỉnh 1 trong phân đoạn 7-14 ml và đỉnh 2 từ 18- 27 ml sau khi thu nhận và đem xác định hàm lượng protein cùng với hoạt tính phytase cho kết quả hiệu suất thu hồi hoạt độ và hiệu suất thu hồi protein theo như bảng 3. Hình 6. Sắc ký đồ phytase của Sporobolomyces japonicus 0 10 20 30 40 50 60 70 Ca2+ Cu2+ Fe2+ Fe3+ Mg2+ Mn2+ Zn2+ EDTA Các ion kim loại và chất ức chế EDTA với nồng độ 1 mmol/ml Hình 5. Biến thiên hoạt độ phytase do sự tác động của các ion kim loại ở nồng độ 1 mmol/ml H oạ t đ ộ ch un g ph yt as e U I/g C PE U I/g C PE Hoang Quoc Khanh, Ngo Duc Duy, Dao Thi Thu Hien, Trinh Phong Van 96 Hình 7. Kết quả điện di đồ enzyme phytase sau khi tủa ethanol Giếng 1. Phytase thương mại; giếng 2, 3. Phytase sau khi tủa bởi cồn; Giếng 4. Thang protein chuẩn. Kiểm tra độ tinh sạch của phytase sau sắc ký và xác định trọng lượng phân tử phytase Phương pháp SDS-PAGE được tiến hành để kiểm tra độ tinh sạch của enzyme phytase sau sắc ký và đồng thời xác định trọng lượng phân tử phytase sinh tổng hợp từ chủng Sporobolomyces japonicus (L9) kết quả chỉ ra ở hình 7. Xác định hằng số Km phản ứng enzyme-cơ chất natri phytate Enzyme phytase thu hồi sau sắc ký được cho phản ứng với cơ chất natri phytate ở các nồng độ 0,05, 010, 0,15, 0,20 và 0 25 mM trong các khoảng thời gian 10, 15, 30, 45 và 60 phút. Với nồng độ 0,05 mM, thời gian phản ứng là 10 phút, còn lại các nồng độ cơ chất 0,10, 0,15, 0,20 và 0,25 mM thì vận tốc phản ứng tối đa Vmax của phytase là 15 phút. Tính vận tốc phản ứng (V) và theo mỗi nồng độ cơ chất [S] Bảng 3. So sánh hoạt tính phytase, hàm lượng protein trước và sau khi sắc ký và hiệu suất thu hồi Mẫu Hàm lượng protein (mg/ml) Hoạt tính tổng (UI/ml) Hoạt tính riêng (UI/mg protein) Mẩu trước khi sắc ký 0,465 118,91 258,048 Đỉnh 1 0,181 33,958 187,942 Đỉnh 2 0,261 74,845 286,388 Tổng 2 đỉnh 0,442 108,803 474,330 Hiệu suất thu hồi protein (%) 95,05 Hiệu suất thu hổi hoạt tính (%) 90,75 TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 91-98 97 Xác định hằng số Km và vận tốc phản ứng xúc tác tối đa Vmax thông qua phương trình Xác định hằng số Km và vận tốc phản ứng xúc tác tối đa (Vmax) thông qua phương trình Line Weak Buk. Sử dụng phần mềm Sigma plot để vẽ đồ thị và tính toán Km, Vmax, kết quả chỉ ra ở theo bảng 3. Khi tăng [S] thì vận tốc phản ứng tăng, tuy nhiên, sau một thời nồng độ cơ chất bão hòa và giảm dần. Nhận thấy vận tốc phản ứng tăng khi tăng nồng độ cơ chất [S] từ 0,05 mM đến 0,20 mM, và vận tốc bắt đầu giảm dần khi tăng nồng độ cơ chất từ 0,20 mM đến 0,25 mM. Hình 8. Đồ thị phương trình Lineweaver-Burk xác định hằng số Km của phytase Đồ thị hình 8 cho thấy, hằng số Km của phytase nấm men Sporobolomyces japonicus (L9) là 0,03128 mM. Hằng số Km cho biết ái lực giữa enzyme và cơ chất, mạnh hay yếu và đây là chủng nấm men mới được nghiên cứu về hoạt tính phytase của nó, vì vậy, chúng tôi sẽ so sánh Km của chủng Sporobolomyces japonicus (L9) với các hằng số Km của một số nấm men đã được nghiên cứu trước đây [6]. Kết qua cho thấy, hằng số Km của chủng Sporobolomyces japonicas là 0,031 mM, điều này cũng cho thấy, ái lực của phytase và cơ chất sodium phytate là khá cao. KẾT LUẬN Điều kiện nuôi cấy thích hợp cho quá trình sản xuất phytase của chủng Sporobolomyces japonicus (L9) trong môi trường lỏng YPD cải tiến (có bổ sung 0,5% sodium phytate) thời gian là 5 ngày với tỉ lệ bổ sung 4% giống cho hoạt độ phytase là 2,720 UI/ml và nhiệt độ và pH tối ưu cho phytase thu nhận là 40oC, pH 4,0. Tác nhân tủa thích hợp cho phytase là ethanol 96%, với tỉ lệ dung môi/dung dịch phytase là 1: 2, thời gian tủa thích hợp nhất là 2 giờ. Hoạt tính riêng đạt được là 312,924 UI/mg protein. Các ion kim loại ảnh hưởng đến hoạt độ phytase như Ca2+ nồng độ 1 mmol/ml làm giảm đến 97% hoạt độ phytase. Mn2+ làm giảm đến 98% hoạt độ phytase ở nồng độ 5 mmol/ml. Hoạt độ riêng của phytase là 187,94 đối với đỉnh 1 và 286,39 đối với đỉnh 2. Hoạt độ riêng Km = 0,03128 Lineweaver-Burk 1/[Substrate] (mM) Vmax = 35. -40 -30 -20 -10 0 10 20 30 1/Rate (µmol/min/ml) 0,01 0,02 0,03 0,04 -1/Vmax -1/Km Hoang Quoc Khanh, Ngo Duc Duy, Dao Thi Thu Hien, Trinh Phong Van 98 của tổng 2 đỉnh tăng 1,8 lần so với mẫu trước sắc ký. Hiệu suất thu hồi protein đạt 95,05% và hiệu suất hoạt độ đạt 90,75%. Hằng số Michaelis (Km) của phytase của chủng Sporobolomyces japonicus (L9) Km 0,0313 mM cho thấy ái lực cao giữa phytase với cơ chất sodium phyate. Trọng lượng phân tử phytase của Sporobolomyces japonicus (L9) là 36,9 KDa. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bollag D. M., Rozyck M. D., Edelstein S. J., 1991. Protein methods, Willey Liss, New York, 415 pages. 2. Haefner S., Knietsch A., Scholten E., Braun J., Lohscheidt M., Zelder O., 2005. Biotechnological production and application of phytase, Applied Microbiology and Biotechnology, 68: 588-597. 3. Kim T. W., Lei X. G., 2005. An improving method for a rapid determination of phytase activity in animal feed, J. Anim. Sci., 83: 1062-1067. 4. Lei X. G., Porres J. M., 2003. Phytase enzymology, application, and biotechnology, Biotechnology letters, 25: 1787-1794. 5. Oh B. C., Choi W. C., Kim Y. O., Oh T. K., 2004. Biochemical properties and substrate specificities of alkaline and histidine acid phytase, Applied Microbiology and Biotechnology, 63: 62-372. 6. Parvinder Kaur, G. Kunze, T. Satyanarayana, 2007. Yeast Phytase: present scenario and future perspectives, Critical Reviews in Biotechnology, 27: 93-109. ISOLATION AND PURIFICATION EXTRACELLULAR PHYTASE FROM Sporobolomyces japonicus (L9) Hoang Quoc Khanh1*, Ngo Duc Duy1, Dao Thi Thu Hien1, Trinh Phong Van2 (1)Institute of Tropical Biologty, VAST (2)Binh Duong University of Economics and Technology SUMMARY Phytase of the yeast Sporobolomyces japonicus (L9), isolated from Cat Tien National Forest, was cultivated in modified YPD medium with activity of 2.720 UI/ml and optimal temperature and pH of 400C and 4.0. A suitable precipitation agent is ethanol 96% with specific activity of 312.924 UI/mg protein. Ca2+ ion with 1mmol/ml reduced enzyme activity to 97% and Mn2+ with 5 mmol/mlreduced enzyme activity to 98%. Specific activity for peak 1 was 187.942 UI/mg protein and for peak 2-286.388 UI/mg protein. Total specific activity increased 1.8 times before chromatography work. Recovery efficiency of protein was 95.05% and recovery activity - 90.75%. The Michaelis-Menten constant (Km) was 0.0313 µM. The purified phytase had a molecular weight of 36.90 kDa. Keywords: Sporobomyces japonicus, phytase, specific activity, Ca2+, Mn2+, Km. Ngày nhận bài: 21-6-2012