Thu nhận bộ nhiễm sắc thể nhuộm band G ở prometaphase

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ bản của Số 1 * 2016 Nghiên cứu Y học Khoa học Cơ bản 35 THU NHẬN BỘ NHIỄM SẮC THỂ NHUỘM BAND G Ở PROMETAPHASE Lưu Thị Thu Thảo*, Huỳnh Duy Thảo**, Trần Thị Thanh Loan*, Nguyễn Thị Hồng Nhung*, Nguyễn Lý Ngọc Trân*, Đặng Trần Quân*, Trần Công Toại* TÓM TẮT Mở đầu: Prometaphase là giai đoạn chuyển tiếp từ cuối prophase sang đầu metaphase nguyên phân. Việc thu nhận bộ nhiễm sắc thể (NST) ở prometaphase có số lượng dải band lớn, độ phân giải cao trên 500 band là phương pháp hiệu quả để phát hiện những bất thường về số lượng và cấu trúc NST (3-5Mb), những bất thường này rất khó phát hiện được nếu thu nhận bộ NST ở metaphase. Mục tiêu: Thu nhận bộ nhiễm sắc thể nhuộm band G có độ phân giải cao ở prometaphase từ tế bào máu ngoại vi người. Đối tượng - phương pháp nghiên cứu: Nuôi cấy tế bào máu ngoại vi của người, sau đó thu nhận tế bào ở prometaphase bằng hai phương pháp: bổ sung Thymine hoặc bổ sung BrdU và Thymine. Kết quả: Bộ NST ở prometaphase được xác định dựa trên hình thái nhân tế bào được nhuộm với Cresyl Violet và thu nhận thành công bộ NST ở prometaphase bằng phương pháp sử dụng thymine. Kết luận: Quy trình nuôi cấy có bổ sung Thymine cho phép thu nhận 60,6% bộ NST có độ phân giải band trên 500 band, hỗ trợ tốt sàng lọc trước sinh và chẩn đoán các bệnh di truyền người. Từ khóa: nhiễm sắc thể đồ, prometaphase, độ phân giải band cao, band G. ABSTRACT THE COLLECTION OF THE HIGH-RESOLUTION G-BANDED CHROMOSOMES IN PROMETAPHASE Luu Thi Thu Thao, Huynh Duy Thao, Tran Thi Thanh Loan, Nguyen Thi Hong Nhung, Nguyen Ly Ngoc Tran, Dang Tran Quan, Tran Cong Toai * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 20 - Supplement of No 1 - 2016: 35 - 39 Background: Prometaphase stands behind prophase and is followed by metaphase in mitosis. During prometaphase, karyotype with high resolution over 500 bands helps detect numerical and structural abberation of chromosomes effectively which be hardly discovered at normal resolution in metaphase. Aims: To collect high-resolution G-banded chromosomes during prometaphase from human peripheral blood cells. Subjects and methods: Culturing peripheral blood cells, then collecting the cells at prometaphase by two methods: add Thymine; or add BrdU and Thymine. Results: Chromosomes at prometaphase were identified based on nuclear morphology of cells staining with Cresyl Violet; and successfully acquired the karyotype at prometaphase using Thymine. Conclusions: The process of the culture with added Thymine allows to collect 60.6% of karyotypes with resolution more than 500 bands, which effectively supports prenatal screening and diagnosis of genetic diseases in humans. Key words: karyotype, prometaphase, G-banded chromosomes, high-resolution. * ĐH Y Dược TP Hồ Chí Minh ** Đại học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch Địa chỉ liên hệ : Ths. Lưu Thị Thu Thảo ĐT: 0977 960 927 Email: luuthao1987@yahoo.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ bản của Số 1 * 2016 Chuyên Đề Khoa học Cơ bản – Y tế Công cộng 36 ĐẶT VẤN ĐỀ Phương pháp thực hiện nhiễm sắc thể đồ được coi là tiêu chuẩn vàng, là xét nghiệm di truyền cơ bản trong chẩn đoán các bất thường về số lượng và cấu trúc NST(8,10). Thông thường, bộ NST đồ được thu nhận ở kỳ giữa (metaphase) của nguyên phân, lúc này các NST thường nén rất chặt và ngắn nên độ phân giải band thấp (300-450 band)(4); điều này ảnh hưởng đến kết quả chẩn đoán vì rất khó phát hiện hoặc có thể bỏ qua một số bất thường về cấu trúc NST như trường hợp mất đoạn, lặp đoạn, chuyển đoạn nhỏ(2,8). Để khắc phục những khiếm khuyết trên, việc thu nhận bộ NST ở prometaphase cho độ phân giải band cao là cần thiết. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu thực nghiệm. Đối tượng nghiên cứu Máu ngoại vi người được thu nhận từ các tình nguyện viên. Phương pháp nghiên cứu Thu nhận mẫu và nuôi cấy tế bào Máu ngoại vi (lấy ở mặt trước tay tình nguyện viên) được thu nhận và bảo quản trong ống vô trùng có chứa 300µl heparin (5000 IU/ml). Sau đó cho 0,5ml máu ngoại vi vào 5ml môi trường RPMI 1640 (Invitrogen), có bổ sung 10% huyết thanh bào thai bò (Fetal Bivine Serum-Gibco), 100µl PHA (Phytohemagglutinin- Invitrogen), 50µl L-Glutamine (Invitrogen), 50µl Penicillin/ Streptomycin (Invitrogen); sau đó nuôi ở nhiệt độ 370C. Sau 72 giờ nuôi cấy, tiến hành bổ sung 100µl Thymine nồng độ 0,25 mg/ml hoặc bổ sung 100µl BrdU nồng độ 0,3 mg/ml kết hợp với 100µl Thymine nồng độ 0,25 mg/ml. Đánh giá tế bào ở Prometaphase bằng phương pháp nhuộm Cresyl Violet Trước khi bổ sung colcemid, cho 0,5 ml môi trường và tế bào nuôi cấy ly tâm ở 800 vòng/phút trong 5 phút, rê 30µl dịch huyền phù theo chiều dài lam, nhuộm Cresyl Violet 0,005g/ml trong 5 phút. Quan sát dưới kính hiển vi quang học ở vật kính x100, nền trắng để lượng giá số tế bào ở các prometaphase. Thu hoạch và trải lam thu nhận bộ NST Quy trình thu hoạch Quy trình trải lam Sau khi bổ sung colcemid Loại dịch nổi, thu cặn lắng Bổ sung 5ml KCl 0.0755M Bổ sung 10ml dung dịch cố định Bổ sung 5ml dung dịch cố định Loại dịch nổi, thu cặn lắng Trải lam Ủ 30 phút Ly tâm 800rpm trong 10 phút Ủ 15 phút Ly tâm 1200rpm trong 10 phút Ly tâm 1200rpm trong 10 phút Lam được ngâm trong Ethanol Rửa qua nước cất (lần1) Rửa qua nước cất (lần 2) Dùng Pipette Pasteur huyền phù cặn lắng, nhỏ 2 giọt lên lam kính (được đặt trên đá lạnh) ở độ cao phù hợp (khoảng 30-40cm) Cho lam vào tủ sấy ở 70oC Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ bản của Số 1 * 2016 Nghiên cứu Y học Khoa học Cơ bản 37 Nhuộm band G Làm già tiêu bản ở 700C qua đêm trong tủ sấy Memmert, sau đó xử lý lần lượt qua các lọ thủy tinh có rãnh chứa sẵn các dung dịch sau: 50ml dung dịch trypsin 0,2% (Gibco) trong 10-15 giây; 50ml dung dịch PBS 1X (Phosphate Buffer Saline-Gibco) (đã được làm lạnh trước ở 40C); 50ml dung dịch Giemsa 1,5% (Gibco). Sau đó rửa tiêu bản bằng nước cất và để khô tự nhiên. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Kết quả lượng giá tế bào ở prometapahse Các tế bào sau khi được nuôi cấy trong thời gian tối ưu được tiến hành đánh giá hình thái tế bào ở prometaphase bằng phương pháp nhuộm nhân Cresyl Violet; sau khi nhuộm, DNA bắt màu xanh qua đó cho ta trực tiếp quan sát được hình thái nhân tế bào ở tất cả các giai đoạn trong nguyên phân. Kết quả nhuộm Cresyl Violet cho thấy ở prometaphase sợi nhiễm sắc dài và phân bố chủ yếu ở ngoại vi nhân tế bào, đồng thời màng nhân biến mất hoàn toàn. Chúng tôi ghi nhận sợi nhiễm sắc ở prophase rất mảnh, rất dài và rất ngoằng ngoèo trong khi sợi nhiễm sắc ở prometaphase ít ngoằng ngoèo hơn. Ngoài ra, sợi nhiễm sắc ở metaphase co xoắn cực đại, có độ dài ngắn và tập trung thành một hàng, phạm vi phân bố hẹp trong khi phạm vi phân bố của sợi nhiễm sắc ở prometaphase rộng hơn(7,11). Sau khi quan sát hình thái nhân tế bào, các chai nuôi của ba thí nghiệm đều có sự hiện diện của các tế bào đang ở giai đoạn prometaphase; tuy nhiên mật độ tế bào ở prometaphase ở từng thí nghiệm có sự khác nhau. Sự khác nhau này được thể hiện qua tỷ lệ phần trăm tế bào ở prometaphase và metaphase trong tổng số tế bào ở prophase, prometaphase, metaphase (Bảng 1). Bảng 1. Phần trăm tế bào ở prometaphase và metaphase trong các thí nghiệm. PHASE THÍ NGHIỆM Mẫu chứng Thymine BrdU+Thymine Prophase 3,5% 27,9% 1,4% Prometaphase 11,8% 27,6% 8,9% Metaphase 84,7% 58,3% 89,5% Kết quả quy trình thu nhận bộ NST đồ ở prometaphase Sau khi trải lam, chúng tôi ghi nhận các kết quả sau: Bảng 2. Kết quả diện tích dàn trải của NST và khảo sát số NST xếp chồng lên nhau trong các thí nghiệm. THÍ NGHIỆM DIỆN TÍCH DÀN TRẢI (x106 µm2) TRUNG BÌNH LẦN 1 LẦN 2 LẦN 3 Diện tích dàn trải (x106 µm2) Mẫu chứng 1,1±0,5 1,6 ±0,7 1,5 ±0,4 1,4±0,6 Thynine 1,6 ±0,6 1,2 ±0,3 2,9 ±0,2 1,9±0,1 BrdU+Thymine 1,1 ±0,3 1,2 ±0,4 1,3 ±0,6 1,2±0,4 Số NST xếp chồng lên nhau Mẫu chứng 1,4±1,3 1,8±1,3 2,8±1,9 2,0±1,6 Thynine 4,5±2,3 5,2±2,0 2,6±2,4 4,1±2,4 BrdU+Thymine 3,3±2,7 1,8±1,3 2,4±1,5 2,5±1,9 Kết quả trải lam trong thực nghiệm cho thấy không có sự khác biệt nhiều về hiệu quả trải lam (diện tích dàn trải của cụm NST, và số NST xếp chồng) ở các thí nghiệm của chúng tôi với kết quả trải lam của tác Wen Deng và cộng sự(5). Điều này cho thấy quy trình trải lam của chúng tôi được xem là thành công. Bằng phương pháp phân tích phương sai thấy không có sự khác biệt về diện tích dàn trải cụm NST giữa các thí nghiệm (p=0,964) và về số NST xếp chồng lên nhau (p=8,719), điều này cho thấy phương pháp trải lam trong các thí nghiệm của chúng tôi là ổn định. Tuy nhiên, so sánh về hiệu quả trải lam giữa 3 thí nghiệm, ghi nhận ở mẫu chứng và thí nghiệm có bổ sung kết hợp BrdU và Thymine cho hiệu quả trải lam tương đối đồng nhất, ít có NST xếp chồng trong khi ở thí nghiệm bổ sung Thymine số NST xếp chồng nhiều nên hiệu quả trải lam thấp hơn hai thí nghiệm trên. Kết quả đánh giá bộ NST đồ ở prometaphase Kết quả đo tổng độ dài, bề rộng, chỉ số tâm động (centromeric index) Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ bản của Số 1 * 2016 Chuyên Đề Khoa học Cơ bản – Y tế Công cộng 38 Kết quả so sánh độ dài NST số 1-5 giữa các thí nghiệm được trình bày trong Bảng 3. Bảng 3. So sánh độ dài, bề rộng, chỉ số tâm động giữa các thí nghiệm. Bằng phương pháp t-test kiểm định sự khác biệt về giá trị trung bình tổng độ dài NST ở mẫu chứng và thí nghiệm bổ sung Thymine, chúng tôi thấy ở thí nghiệm bổ sung Thymine cho kết quả trung bình tổng độ dài NST tăng 282,7µm so với mẫu chứng, với khoảng tin cậy 95% trung bình độ dài NST tăng từ 26,5µm đến 539,0µm. Như vậy, tổng độ dài trong thí nghiệm có bổ sung Thymine tăng có ý nghĩa thống kê so với mẫu chứng (p=0,0251). Trong khi đó,trung bình tổng độ dài NST trong thí nghiệm có bổ sung BrdU và Thymine không có sự khác biệt về ý nghĩa thống kê so với mẫu chứng (p=0,0829). Sau khi phân tích tất cả các cụm NST ở mỗi thí nghiệm (3 tiêu bản/thí nghiệm), kết quả độ phân giải band của các thí nghiệm được trình bày trong Bảng 4. Bảng 4. So sánh độ phân giải band giữa các thí nghiệm. Từ bảng số liệu cho thấy có 60,6% bộ NST có độ phân giải từ 500 band trở lên theo quy trình nuôi cấy đồng bộ đơn có bổ sung Thymine khi so sánh với quy trình nuôi cấy đồng bộ kép co bổ sung kết hợp BrdU-Thymine (4,5%) và mẫu chứng (1,2%). Do đó, quy trình nuôi cấy đồng bộ đơn có bổ sung Thymine sau 72 giờ nuôi cấy cho thấy hiệu quả hơn để thu được bộ nhiễm sắc thể có độ phân giải band cao, hình ảnh rõ đẹp. Bảng 5. Kết quả đánh giá độ phân giải band theo Hiệp Hội Di Truyền Tế bào lâm sang và theo ISCN 2009. Thí nghiệm Band Điều kiện Nhiễm sắc thể đồ Mẫu chứng 500 7q33,35 11p12,14,15.4 14q32.2 18q12.1,12.3, 21.2,22 Độ phân giải band Thí nghiệm Mẫu chứng Thymine BrdU+Thymine 300 27,5% 2,3% 52,8% 400 57,5% 37,1% 42,7% 500 13,8% 33,2% 4,5% 550 1,2% 25,5% 0% >550 0% 1,9% 0% Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ bản của Số 1 * 2016 Nghiên cứu Y học Khoa học Cơ bản 39 Thí nghiệm Band Điều kiện Nhiễm sắc thể đồ Thymine 550 5q31.2 8p21.2 11p15.2,15.4 22q13.2 BrdU+Thymine 400-450 4q22-28 5q14,21,23 9p21,23 13q33 KẾT LUẬN Qua nghiên cứu, chúng tôi đã xác định được quy trình nuôi cấy đồng bộ đơn có bổ sung Thymine sẽ thu được 60,6% bộ nhiễm sắc thể ở prometaphase có độ phân giải cao (500 band trở lên), hình thái band rõ, đẹp dễ phân tích, hỗ trợ rất hiệu quả trong quá trình chẩn đoán các trường hợp liên quan đến bất thường về số lượng và cấu trúc nhiễm sắc thể. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Aboussair N, et al (2012), Cytogenetic analysis of 5572 patients referred for suspected chromosomal abnormalities in Morocco, Genetic testing and molecular biomarkers, 16(6), pp. 569-573. 2. Bertram JS (2000), The molecular biology of cancer,Molecular aspects of medicine, 21(6),pp. 167-223. 3. Bridge JA (2008), Advantages and limitations of cytogenetic, molecular cytogenetic, and molecular diagnostic testing in mesenchymal neoplasms,Journal of Orthopaedic Science, 13(3),pp. 273-282 4. Dave U and Shetty D (2014), Mutational Screening and Prenatal Diagnosis in Cornelia de Lange syndrome,The Journal of Obstetrics and Gynecology of India, 64(1), pp. 27-31. 5. Deng W, et al (2003), A new method for improving metaphase chromosome spreading,Cytometry Part A, 51(1),pp. 46-51 6. Labidi F and Cassidy S, (1986), A blind prometaphase study of Prader-Willi syndrome: frequency and consistency in interpretation of del 15q,American journal of human genetics, 39(4), pp. 452. 7. Neitzel H, et al (2002), Premature chromosome condensation in humans associated with microcephaly and mental retardation: a novel autosomal recessive condition,The American Journal of Human Genetics, 70(4),pp. 1015-1022. 8. Popescu P, Hayes H, and Dutrillaux B (2000), Techniques in animal cytogenetics, Springer Science & Business Media. 9. Trask BJ (2002), Human cytogenetics: 46 chromosomes, 46 years and counting,Nature Reviews Genetics, 3(10), pp. 769- 778. 10. Trần Công Toại, Vũ Phi Yên (2013), Di truyền y học, Nxb Hồng Đức. 11. Wintrobe MM and Greer JP (2009), Wintrobe's clinical hematology, Vol. 1, Lippincott Williams & Wilkins F. 12. Yunis JJ (1976), High resolution of human chromosomes,.Science, 191(4233), pp. 1268-1270. Ngày nhận bài báo: 20/11/2015 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 28/11/2015 Ngày bài báo được đăng: 01/03/2016