Thiết lập mô hình lây nhiễm Burkholderia Pseudomallei với dòng tế bào Monocyte-Like U937 và dòng tế bào Monocyte-Likeraw 264.7

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 21 * Số 1 * 2017 Chuyên Đề Nội Khoa 90 THIẾT LẬP MÔ HÌNH LÂY NHIỄM BURKHOLDERIA PSEUDOMALLEI VỚI DÒNG TẾ BÀO MONOCYTE-LIKE U937 VÀ DÒNG TẾ BÀO MONOCYTE-LIKERAW 264.7 Đường Thị Hồng Diệp* TÓM TẮT Mở đầu: Mô hình lây nhiễm Burkholderia pseudomallei với các dòng tế bào khác nhau đặc biệt là macrophage để nghiên cứu sinh bệnh học của vi khuẩn này được các nhà khoa học trên thế giới hết sức quan tâm. Mục tiêu: Tìm ra mô hình lây nhiễm tế bào thích hợp để nghiên cứu sinh bệnh học của Burkholderia pseudomallei cụ thể là quan sát và nghiên cứu sự hình thành tế bào lớn đa nhân ở ký chủ (được cho là một trong những độc tính của vi khuẩn). Đối tượng - phương pháp nghiên cứu: Burkholderia pseudomallei chủng PP844, phân lập từ bệnh nhân mắc bệnh melioidosis, cho lây nhiễm với 2 dòng tế bào: U937 và RAW 264.7 bằng nhiều MOI khác nhau để khảo sát khả năng xâm lấn và kích thích sự tạo thành tế bào lớn đa nhân ở tế bào ký chủ. Kết quả: B. pseudomallei có khả năng xâm lấn vào dòng tế bào chuột RAW 264.7 cao hơn gấp 40 lần so với khả năng xâm lấn vào dòng tế bào người U937. Sự hình thành tế bào lớn đa nhân được tìm thấy ở RAW 264.7, nhưng không tìm thấy ở dòng tế bào U937. Kết luận: Có thể dùng cả 2 loại tế bào RAW 264.7 và U937 để nghiên cứu sinh bệnh học của B. pseudomallei, tuy nhiên tùy vào mục đích nghiên cứu sẽ chọn dòng tế bào thích hợp. Từ khóa: Burkholderia pseudomallei, tế bào lớn đa nhân, RAW 264.7, U937 ABSTRACT INFECTION ASSAY IN 2 CELL LINES RAW 264.7 AND U937 WITH BACTERIA BURKHOLDERIA PSEUDOMALLEI Duong Thi Hong Diep * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement of Vol. 21 - No 1 - 2017: 90 - 96 Objectives: To establish an infection assay of Burkholderia pseudomallei, causative agent of melioidosis with 2 cell lines RAW 264.7 and U937 in order to study bacterial pathogenicity. Material and Method: Infect B. pseudomallei PP844, isolated from melioidosis patient, to RAW 264.7 and U937 cell lines to study the invasion capability and to observe multinucleated giant cell (MNGC) formation. Results: B. pseudomallei can invade into RAW 264.7 cells with 40 folds higher than into U937. MNGC formation after infection assay can be observed in RAW 264.7 cells but not in U937. Conclusion: RAW 264.7 cells are suitable for studying MNGC formation after infection. The right infection model should be chosen follow up the purpose of study. Key words: Burkholderia pseudomallei, multinucleated giant cell (MNGC), RAW 264.7, U937 ĐẶT VẤN ĐỀ Theo Trung tâm phòng ngừa và kiểm soát dịch bệnh Mỹ (CDC) thì vi khuẩn gram âm Burkholderia pseudomallei phổ biến ở khu vực Đông Nam Á và phía Bắc Australia. Burkholderia pseudomallei (B.pseudomallei) là tác nhân gây nên bệnh Melioidosis hay còn được gọi theo tên của nhà khoa học lần đầu tiên phát hiện ra nó là bệnh Whitmore. Bệnh nhân thường có biểu hiện cấp tính như sốt cao, nhức đầu, chán ăn, ho, đau ngực và đau nhức các cơ bắp. Khi diễn biến nặng Bộ môn Hoá Sinh – Khoa Y – Đại học Đại học Y Dược TPHCM Tác giả liên lạc: TS. Đường Thị Hồng Diệp ĐT: 0989369390 Email: diepdh@yahoo.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 21 * Số 1 * 2017 Nghiên cứu Y học Tiêu Hóa 91 có thể gây nhiễm trùng máu, do đó nguy cơ tử vong cao (tới 40% ở vùng đông bắc Thái lan và 15% ở Úc)(1, 9) dù được điều trị thích hợp. B. pseudomallei kháng với hầu hết các kháng sinh thông thường như penicillin, ampicillin, kháng sinh cephalosporin thế hệ 1 và 2, gentamicin, tobramycin, streptomycin, polymyxin(7). Khi điều trị bệnh nhân cần được điều trị kéo dài, kháng sinh dùng trong pha cấp tính là Ceftazidime 50mg/kg (tối đa 2g) truyền tĩnh mạch mỗi 6-8 giờ hoặc Meronem 25mg/kg (tối đa 1g) truyền tĩnh mạch mỗi 8 giờ. Trong pha củng cố , kháng sinh được dùng là Trimethoprim- sulfamethoxazole uống mỗi 12 giờ hoặc Doxycycline uống mỗi 12 giờ hoặc Amoxicillin/acid-clavulanic uỗng mỗi 8 giờ. Thời gian điều trị trong mỗi pha phụ thuộc vào bệnh cảnh lâm sàng có thể kéo dài từ 2 tới 6 tháng(1, 3, 9). Điều nguy hiểm là bệnh tuy đã được điều trị nhưng lại dễ tái phát vì vi khuẩn có khả năng tồn tại trong mọi loại tế bào của cơ thể kể cả macrophage, do đó sức khỏe của bệnh nhân bị suy kiệt do bệnh tái đi tái lại hoặc điều trị không đúng phác đồ. Vi khuẩn đi vào cơ thể người thông qua đường hô hấp (hít phải khí bụi có vi khuẩn) hoặc vết trầy xước ở da khi tiếp xúc trực tiếp với nước bùn lầy hoặc đất đai nông nghiệp nhiễm khuẩn. Khi Burkholderia pseudomallei xâm nhập vào cơ thể người chúng có thể gây bệnh ngay (thời gian ủ bệnh 1-21 ngày) hoặc nằm yên đến vài chục năm (ghi nhận tới 60 năm) chờ khi cơ thể suy yếu là lúc thuận lợi để gây bệnh(5, 9), do đó bệnh thường gặp ở những bệnh nhân suy giảm miễn dịch, bệnh nhân đái tháo đường, suy thận(1,2,8). Ở Nam Việt nam, những ca melioidosis vẫn được ghi nhận, tuy nhiên nó không phải là bệnh nhiễm trùng phổ biến ở các tỉnh thành lân cận thành phố Hồ Chí Minh(6). Điều này khác với vùng đông bắc Thái Land (Ubon Ratchathani), cách tây bắc thành phố Hồ Chí Minh 500km, nơi mà B. pseudomallei gây nên một phần năm số ca nhiễm trùng máu từ cộng đồng. Có thể do thiếu các phương tiện để có thể phân lập và chẩn đoán chính xác tác nhân gây bệnh tại tuyến địa phương, nên bệnh nhân nặng đã tử vong trước khi được chuyển lên thành phố Hồ Chí Minh, do vậy không được thống kê trong nghiên cứu này. Ở Việt Nam, các trường hợp bệnh đã được ghi nhận từ thời thuộc Pháp và thời kỳ chiến tranh trên các đối tượng là lính Pháp và sau đó là lính Mỹ tham chiến tại Việt Nam. Đến nay chỉ có một vài báo cáo ca bệnh trong nước về melioidosis, vì vậy nên chưa có cái nhìn đầy đủ về dịch tễ học, cũng như các bệnh cảnh lâm sàng của một căn bệnh nguy hiển (được Trung tâm phòng ngừa và kiểm soát bệnh tật Hòa Kỳ coi là một vũ khí sinh học tiềm năng) mà Việt Nam nằm trong vùng dịch tễ. Một báo cáo ở miền Bắc Việt Nam cho thấy, trong khoảng thời gian từ 1997 – 2005 có 54 bệnh nhân được chẩn đoán xác định là Melioidosis với kết quả cấy máu hoặc các dịch cơ thể dương tính với B. pseudomallei, các bệnh nhân đến 18 tỉnh thành quanh Hà Nội(7,8). Bệnh Melioidosis có thể điều trị được bằng kháng sinh nếu phát hiện và chẩn đoán được sớm, tuy nhiên bệnh có thể tái phát và hiện nay chưa có vacxin phòng bệnh Với sự phát triển của kỹ thuật phân lập, nuôi cấy và sinh học phân tử những hiểu biết về cơ chế bệnh sinh và điều hòa biểu hiện gene của B.pseudomallei ngày càng gia tăng. Holden và cộng sự năm 2004 đã công bố trình tự hoàn chỉnh của bộ gene B.pseudomallei, gồm 2 chromosome vòng: 4.07 Mb (megabase pair) và 3.17 Mb(4). Để hiểu biết thêm về cơ chế bệnh sinh và đóng góp kiến thức cho nghiên cứu vắc xin sau này, dựa vào những kiến thức đã biết chúng tôi mong muốn thiết lập một mô hình lây nhiễm B.pseudomallei trên dòng tế bào người và tế bào chuột nuôi cấy trong phòng thí nghiệm. Nghiên cứu được thiết kế với 2 mục tiêu cụ thể như sau: (1) thiết lập mô hình lây nhiễm B.pseudomallei vớidòng tế bào U937 người và dòng tế bào RAW 264.7 chuột (tế bào monocyte-like, tiền thân của đại thực bào), so sánh khả năng xâm nhập của vi khuẩn vào từng loại tế bào; (2) nghiên cứu khả Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 21 * Số 1 * 2017 Chuyên Đề Nội Khoa 92 năng kích thích sự hình thành tế bào ký chủ khổng lồ đa nhân của vi khuẩn để chọn ra mô hình phù hợp nhất. Kết quả của nghiên cứu này sẽ được sử dụng làmmô hình lây nhiễm nghiên cứu điều hòa biểu hiện gene gây bệnh của yếu tố phiên mã RpoS và RpoN2 ở B. pseudomallei. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nuôi cấy vi khuẩn Burkholderia pseudomallei Vi khuẩn Gram-âm B. pseudomallei chủng PP844 được phân lập từ bệnh nhân mắc bệnh melioidosis tại bệnh viện Srinagarind, tỉnh Khon Kaen, Thái lan (cung cấp bởi PGS. TS. Utainsincharoen, đại học Mahidol, Thái lan). B. pseudomallei PP844 được lưu trữ ở -80oC trong LB (Luria-Bertani: Tryptone 10g, NaCl 10g, Yeast extract 5g, nước 950ml)media và 60% glycerol (v/v). Trước mỗi lần làm thí nghiệm, PP844 được lấy ra từ -80oC và nuôi cấy trong 10ml TSB (Tryptic soy broth) không chứa kháng sinh, ở 37oC, trong máy lắc 200rpm. Canh cấy qua đêm được inoculate 0,1% (v/v) trong 5ml TSB mới cũng ở 37oC, lắc 200rpm thêm 6 giờ. Vi khuẩn sau khi được kích hoạt sẽ cấy trên đĩa thạch Ashdown agar (môi trường chọn lọc của B.pseudomallei) trong tủ ấm 37oC để phân lập khuẩn lạc. Sau 48 giờ đến 72 giờ khuẩn lạc đã mọc, dùng que cấy, lấy 1 khuẩn lạc, cho vào 10ml TSB, nuôi cấy trong môi trường lỏng qua đêm ở 37oC, lắc 200rpm. Inoculate 0,1% (v/v) vào 5ml TSB mới thêm 6h, để chắc chắn vi khuẩn đủ khỏe để tiến hành thí nghiệm. Thu thập tế bào vi khuẩn bằng ly tâm 7000 x g, đổ bỏ môi trường, rửa các tế bào vi khuẩn thu được 2 lần bằng PBS. Mỗi lần rửa đều ly tâm ở 7000 x g, đổ bỏ môi trường. Cho vi khuẩn thu được sang tube 1,5ml, thêm 1ml PBS, trộn đều, sau đó đo mật độ quang ở bước sóng 600nm để xác định số lượng tương đối tế bào vi khuẩn trong 1ml PBS. Pha loãng vi khuẩn và hiệu chỉnh số lượng vi khuẩn như mong muốn để tiến hành lây nhiễm vào tế bào ký chủ, bằng cách đo mật độ quang (OD600). Mối tương quan giữa số lượng vi khuẩn và mật độ quang OD600 được tiến hành qua thí nghiệm sau. Cắn tế bào vi khuẩn sau khi ly tâm 7000 x g, đổ bỏ PBS, thêm vào 1ml PBS mới trộn đều, pha loãng dần theo tỷ lệ 1:10; 1:100; 1:1000; 1: 10 000; 1: 100 000; 1: 1000 000 và 1: 1000 000 0 và đo mật độ quang từng nồng độ. Tiến hành song song, mỗi nồng độ sẽ cấy trên đĩa thạch TSA (Tryptic Soy Agar) theo kỹ thuật drop plate technique, ủ trong tủ ấm 37oC, 48 giờ. Đếm số khuẩn lạc CFU (colony forming unit) và nhân với hệ số pha loãng. Như vậy CFU trong 1ml sẽ tỷ lệ với OD600 đo được. Nuôi cấy tế bào U937 và RAW 264.7 Dòng tế bào người monocyte-like U937 và dòng tế bào chuột monocyte-like RAW 264.7 được mua từ ATCC (American tissue cell culture). Chuẩn bị môi trường RPMI: 1 gói RPMI 1640 Gibco (Invitrogen) (Roswell Park Memorial Institute medium)pha trong 1L nước cất tinh sạch cấp độ 3B (3B grade), bổ sung 2mM Glutamine, 25mM Hepes buffer và 2g NaHCO3, điều chỉnh pH 7,4. Cho vào môi trường nuôi cấy 1% (v/v) penstep (Penicillin + streptomycin 15140 Gibco (Invitrogen)) để tránh tế bào bị lây nhiễm. Bổ sung FBS (Fetal bovine serum) 10% (v/v). Hòa tan các thành phần, sau đó lọc qua filter 0,02nmpore. Lấy ra 10ml RPMI, để trong tủ ấm 37oC 24-48h, kiểm tra xem có bị nhiễm khuẩn không bằng cách quan sát độ đục hoặc cấy trên thạch agar, trước khi sử dụng. Chuẩn bị tế bào: vial U937 lấy ra từ nito lỏng, rã đông nhanh trong 1 phút ở 37oC (water bath), chuyển sang 10ml RPMI đã làm ấm ở 37oC trong vòng 15 phút, lắc đều, quay ly tâm lạnh 2000 vòng/phút, 5 phút ở 4oC. Thu cặn lắng, rửa lại 1-2 lần bằng 10ml RPMI mới. Lần rửa cuối cùng, thu cặn lắng (tế bào), trộn đều tế bào trong 1ml RPMI mới. Đếm tế bào bằng phương pháp trypan blue trên hematocytometer. Điều chỉnh số tế bào thích hợp đưa vào nuối cấy trong 20ml RPMI trong flask T75 và đặt vào tủ ấm 37oC, 5% CO2. Theo dõi tình trạng tế bào mỗi 12 giờ. Thay Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 21 * Số 1 * 2017 Nghiên cứu Y học Tiêu Hóa 93 môi trường mỗi 2 ngày, cắt giảm số tế bào sau mỗi 24h. Làm thí nghiệm tính thời gian số tế bào tăng sinh gấp đôi, ghi nhận. Chuẩn bị môi trường DMEM: 1 lọ Hyclone classical DMEM chứa nồng độ glucose caodạng bột khô 67g pha được 1L DMEM 5X. Bổ sung thêm sodium bicarbonate 7,5g. Từ stock 5X pha 1L DMEM 1X sẵn sàng sử dụng. Chỉnh pH 7.0 – 7.4. Lọc bởi filter cup 0,02nm trong tủ hood. Kiểm tra tránh nhiễm khuẩn. Từ DMEM 1X pha môi trường hoàn chỉnh để sử dụng (cho thêm vào 1L DMEM 1X: 1% (v/v) L-glutamine, 10% (v/v) FBS (Hyclone), chú ý khi đổi DMEM và FBS của hãng khác. Vial được lưu trữ ở nito lỏng, rã đông nhanh 1 phút trong tủ ấm 37oC hoặc water bath, chuyển tế bào qua 10ml DMEM, lắc đều rửa, quay ly tâm lạnh 2000 vòng/phút trong 5 phút ở 4oC, thu cặn lắng (tế bào), đổ bỏ môi trường. Pha loãng tế bào trong 1ml DMEM, đếm tế bào bằng phương pháp trypan blue trên hematocytometer. Nuôi cấy 1x 104 tế bào với 5ml DMEM hoàn chỉnh trong flask T25. Quy trình lây nhiễm Sau khi tế bào RAW 264.7 được nuôi cấy khoảng 10canh cấy (passage) trong T25 flask, tế bào được thu hoạch bằng scraper, quay ly tâm lạnh, lấy tế bào, rửa và đếm. Tế bào RAW 264.7 được chuyển qua đĩa cấy tế bào 12 giếng mỗi giếng 5 x 104 cells. Đến ngày làm lây nhiễm lớp tế bào trên bề mặt đĩa được rửa 2 lần bằng dung dịch PBS (phosphate buffered saline) pH7.4, trước khi cho 2ml DMEM hoàn chỉnh. Song song đó vi khuẩn B. pseudomallei cũng được thu hoạch bằng ly tâm lạnh, rửa, đo mật độ quang OD600 và hiệu chỉnh số vi khuẩn cho thích hợp. Quá trình lây nhiễm bắt đầu khi cho vi khuẩn B. pseudomallei vào các giếng đã có sẵn tế bào RAW 264.7 vớilần lượt MOI (multiplicity of infection) là 1, 10 và 100. Lắc nhẹ để phân bổ đều vi khuẩn cho mỗi tế bào. Trong 12 giếng, 1 giếng sẽ chỉ có tế bào RAW 264.7 (mock) để kiểm soát lây nhiễm chéo. Để đĩa nuôi cấy 12 giếng vào tủ ấm 5% CO2, 37oC trong 2 giờ để vi khuẩn có thể xâm nhập vào tế bào. Sau đó lớp tế bào RAW 264.7 đã bị vi khẩn xâm nhập, sẽ được rửa 2 lần với PBS để loại bỏ hết vi khuẩn ở bên ngoài chưa vào trong tế bào được. Mỗi giếng trong đĩa nuôi cấy tế bào 12 giếng sẽ được cho vào 2ml DMEM mới chứa Kanamycin 250 µg/ml, ủ tiếp 2 giờ trong tủ ấm 5% CO2 để loại bỏ hoàn toàn vi khuẩn bên ngoài tế bào. Sau 2h, đổ bỏ DMEM, rửa 2 lần với PBS. Cho vào mỗi giếng 2ml DMEM mới chứa Kanamycin 50µg/ml và nuôi cấy RAW 264.7 đã bị lây nhiễm cho tới thời điểm kết thúc, thu mẫu tế bào sau 0 giờ, 2 giờ và 4 giờ sau lây nhiễm. Đối với đĩa 12 giếng nuôi cấy U937 cũng tiến hành tương tự. Để kiểm tra xem Kanamycin 250 µg/ml có loại bỏ hết vi khuẩn ngoài tế bào RAW 264.7 và U937 hay không, trước khi hút bỏ môi trường, mẫu môi trường sẽ được cấy trên đĩa thạch agar để tìm khuẩn lạc vi khuẩn. Thí nghiệm lây nhiễm sẽ làm lại 3 lần độc lập, mỗi lần làm sẽ lặp lại 3 giếng cùng một MOI để lấy số liệu thống kê. Tại mỗi thời điểm thu nhận mẫu tế bào ở 0 giờ, 2 giờ, 4 giờ sau lây nhiễm, môi trường sẽ được hút bỏ, rửa tế bào RAW 264.7 hoặc U937 2 lần với PBS và ly giải tế bào bằng 200µl 0.1% Triton X-100 (Sigma Chemicals, Co) để giải phóng ra vi khuẩn. Để đánh giá mức độ xâm lấn, dịch ly giải tế bào tại thời điểm 0 giờ, 2 giờ, 4 giờở mỗi MOI 2, 10, 20 sẽ được pha loãng 1:10; 1:100; 1: 1000; 1: 10 000; 1: 100 000 và 1: 1 000 000 và cấy trên đĩa thạch TSA và sẽ đếm số khuẩn lạc CFU sau 48 giờ ủ ở 37oC trong tủ ấm. Song song với thí nghiệm xác định khả năng xâm lấn của vi khuẩn, thí nghiệm lây nhiễm được tiến hành đồng thời trên những đĩa nuôi cấy tế bào 12 giếng khác để quan sát mức độ tạo thành tế bào đa nhân ở những tế bào RAW 264.7 và U937 bị nhiễm B. pseudomallei. Tại mỗi thời điểm sau lây nhiễm 0h, 2h, 4h mẫu tế bào được thu thập, hút bỏ môi trường DMEM, rửa 2 lần Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 21 * Số 1 * 2017 Chuyên Đề Nội Khoa 94 với PBS, nhuộm Giemsa, chụp hình, đếm tế bào đa nhân, thống kê số liệu. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN B. pseudomallei kích thích sự tạo thành tế bào đa nhân ở RAW 264.7 chứ không kích thích sự tạo tế bào đa nhân (MNGC) ở U937 Tại mỗi thời điểm sau lây nhiễm 0 giờ, 2 giờ, 4 giờ các tế bào RAW 264.7 được rửa 2 lần với PBS, để khô ở nhiệt độ phòng và nhuộm với Giemsa, để quan sát sự tạo thành tế bào đa nhân. Sau lây nhiễm 2 giờ số tế bào đa nhân quan sát được còn nhỏ và ít. 4 giờ sau lây nhiễm số tế bào đa nhân tăng lên cả về kích thước và số lượng (Hình 2B). Hình 1. RAW 264.7 mock (A) và RAW 264.7 lây nhiễm với B.speudomallei (B,C) Hình 2. Các tế bào U937 mock (A) và U937 lây nhiễm với (B), không có sự hình thành tế bào lớn đa nhân Tuỳ thuộc vào MOI (lượng vi khuẩn dùng để tiến hành thí nghiệm lây nhiễm so với số tế bào ký chủ)và tùy thuộc vào thời gian mà sự hình thành tế bào đa nhân nhiều hơn hay ít hơn. Để quan sát kỹ hơn tế bào lớn đa nhân, ở thí nghiệm lặp lại đã làm thêm giếng và để tới 16 giờ mới thu thập tế bào, kết quả cho thấyởthời điểm 16 giờ sau lây nhiễm, tế bào lớn đa nhân hầu như đạt kích thước tối đa, sau đó tế bào bị ly giải, giải phóng ra B. pseudomallei (Hình 1C). Cùng tại thời điểm 4giờ sau lây nhiễm sự tạo thành tế bào lớn đa nhân ở RAW264.7, lây nhiễm B. pseudomalli với MOI 20, sẽ thấy rõ hơn và lớn hơn về kích thước so với tế bào RAW264.7 lây nhiễm B. pseudomallei MOI 2. Khi để lâu hơn, sẽ quan Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 21 * Số 1 * 2017 Nghiên cứu Y học Tiêu Hóa 95 sát thấy sự ly giải các tế bào lớn đa nhân. Điều này phù hợp với kết quả của những nghiên cứu khác cho rằng khả năng kích thích sự tạo tế bào lớn đa nhân là độc tính của B. pseudomallei mà không quan sát thấy ở các vi khuẩn Gram- âm khác. Từ kết quả thí nghiệm này cũng đưa ra nhận xét về thời gian kéo dài thí nghiệm lây nhiễm không nên quá 16giờ đối với MOI 2, 10, 20. Nếu giảm MOI xuống 0.1 thì có thể kéo dài thời gian lây nhiễm. Hoặc rút ngắn thời gian thí nghiệm nếu lây nhiễm với MOI 50 hoặc 100 để đảm bảo kết quả có độ tin cậy cao, vì khi tế bào lớn đa nhân bị ly giải sẽ phóng thích B. pseudomallei và tiếp tục lây nhiễm sang các tế bào bên cạnh, sẽ không so sánh được với số vi khuẩn đưa vào khi bắt đầu quá trình lây nhiễm.Đối với thí nghiệm trên dòng tế bào U937 người, mặc dù quan sát thấy rõ B. pseudomallei xâm nhập vào tế bào, tăng sinh nội bào, nhưng không quan sát thấy sự tạo thành tế bào lớn đa nhân dưới kính hiển vi. Kéo dài thí nghiệm lây nhiễm lâu hơn, chỉ thấy ly giải từng tế bào U937 khi số vi khuẩn tăng sinh đủ nhiều. Điều này phù hợp với những báo cáo quốc tế và có thể giải thích tại sao B. pseudomallei có thể tồn tại trong cơ thể người tới 60 năm mới phát bệnh, khi có cơ hội. Khả năng xâm lấn và tồn tại nội bào của B. pseudomallei đã được báo cáo từ năm 1990. Những năm gần đây nghiên cứu sự ảnh hưởng các yếu tố của vi khuẩn này tới sự hình thành tế bào lớn đa nhân đang được đặc biệt quan tâm(2). Tuy nhiên dùng dòng tế bào nào làm mô hình lây nhiễm hiệu quả để khảo sát sự hình thành tế bào lớn đa nhân vẫn đang còn tranh cãi. Từ quan sát trong thí nghiệm này, có thể đưa ra kết luận, sự hình thành tế bào lớn đa nhân sẽ dễ dàng hơn ở dòng tế bào kết dính (RAW 264.7 là tế bào bán kết dính, U937 là tế bào không kết dính). Khả năng xâm lấn của vi khuẩn B. pseudomallei vào RAW 264.7 cao hơn vào U937 Tại mỗi thời điểm sau lây nhiễm 0 giờ, 2 giờ, 4 giờ tế bào RAW 264.7 và U937 được thu thập. Tế bào được ly giải bằng 200µl 0,1% Triton X-100 (Sigma Chemicals, Co) để giải phóng ra vi khuẩn. Dịch ly giải được pha loãngdần 10, 100, 1000, 10 000 lần và nuôi cấy trên đĩa thạch TSA 48 giờ. CFU được đếm và tính toán dựa trên phần mềm Sigma stat với p 0.01, kết quả được biểu diễn bằng đồ thịvà bảng (hình 3 và bảng 1). Hình 3. Sự xâm lấn của B.pseudomallei MOI khác nhau vào RAW 264.7 và U937 Như vậy với từng MOI khác nhau số vi khuẩn vào tế bào chủ khác nhau, tuy nhiên theo cùng một tỷ lệ là khoảng 4.5% số vi khuẩn lây nhiễm ban đầu vào được RAW 264.7 và 0,1% B. pseudomallei vào được U937 sau 4h lây nhiễm (Bảng 1). Khả năng xâm lấn của B. pseudomallei vào RAW 264.7 (4,5%) cao hơn vào U937 (0,1%) (Hình 3). Cả hai mô hình tế bào này đều thích hợp cho thí nghiệm lây nhiễm. Tuy nhiên, nếu để quan sát và đếm tế bào lớn đa nhân thì mô hình tế bào RAW 264.7 thích hợp hơn U937. Tế bào U937 có thể được kích hoạt bởi PMAphorbol 12 – myristate 13-acetate để bám dính vào đĩa nuôi cấy, trước khi làm lây nhiễm, nhưng khảo sát sự hình thành tế bào đa nhân ở dòng tế bào này vẫn còn cần phải nghiên cứu thêm. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 21 * Số 1 * 2017 Chuyên Đề Nội Khoa 96 Bảng 1. So sánh khả năng lây nhiễm của B.pseudomallei MOI khác nhau vào RAW 264.7 và U937 KẾT LUẬN Melioidosis là một bệnh dịch địa phương, thường gặp ở vùng nhiệt đới, gây nên bởi vi khuẩn Gram-âm B. pseudomallei. CDC Hoa kỳ xếp vi khuẩn này vào loại B tác nhân sinh học nguy hiểm. Tuy nhiên hiện nay chưa cóvaccine cho bệnh này, biểu hiện bệnh rất khác nhau ở từng bệnh nhân và điều trị khó khăn, vì vi khuẩn kháng với hầu hết các loại kháng sinh thông thường. Ngay cả sau khi điều trị kháng sinh thành công, tỷ lệ tái phát là 30-40%. Vì vậy nghiên cứu sinh bệnh học của B. pseudomallei được sự quan tâm lớn của các nhà khoa học. Ở Việt nam có ghi nhận những ca bệnh melioidosis, tuy nhiên nghiên cứu công bốcủa Việt nam lại vô cùng hạn chế. Nghiên cứu này nhằm thiết lập một mô hình lây nhiễm hiệu quả, có thể thực hiện được trong phòng thí nghiệm, giúp ích một cách thiết thực cho nghiên cứu sinh bệnh học của B. pseudomallei. Nghiên cứu này cho thấy B. pseudomallei có thể lây nhiễm cả 2 dòng tế bào RAW 264.7 chuột và U937 người.Tuy nhiên khả năng kích thích tạo thành tế bào đa nhân, được cho là tính độc của B. pseudomallei, lại chỉ quan sát được ở dòng tế bào RAW 264.7. Vì vậy tùy mục đích nghiên cứu sẽ lựa chọn những dòng tế bào khác nhau để làm mô hình lây nhiễm. Mô hình lây nhiễm này sẽ được tác giả sử dụng để khảo sát vai trò yếu tố phiên mã RpoS và RpoN2 của B. pseudomallei trong điều hòa biểu hiện gene gây bệnh và dùng để so sánh khả năng lây nhiễm của vi khuẩn này vào dòng tế bào gan người. Cám ơn: Trân trọng cám ơn GS.TS. Sumalee Tungpradabkul, GS.TS. Ratchanee đại học Mahidol, Thái lan đã cung cấp chủng vi khuẩn B. pseudomallei và giúp đỡ hoàn thành nghiên cứu này. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Cheng, AC, and Currie BJ (2005), Melioidosis: epidemiology, pathophysiology, and management. Clin Microbiol Rev, 18(2): p. 383-416. 2. Currie B (1995), Pseudomonas pseudomallei-insulin interaction. Infection and immunity, 63(9): p. 3745. 3. Dance D (2014), Treatment and prophylaxis of melioidosis. International journal of antimicrobial agents, 43(4): p. 310-318 4. Holden MT, et al. (2014), Genomic plasticity of the causative agent of melioidosis, Burkholderia pseudomallei. Proc Natl Acad Sci U S A, 101(39): p. 14240-5. 5. Ngauy V, et al. (2005), Cutaneous melioidosis in a man who was taken as a prisoner of war by the Japanese during World War II. Journal of Clinical Microbiology, 43(2): p. 970-972. 6. Parry C.M., et al. (1999), Melioidosis in Southern Vietnam: clinical surveillance and environmental sampling. Clinical Infectious Diseases, 29(5): p1323-1326. 7. Phuong, DM., et al (2008),Clinical and microbiological features of melioidosis in northern Vietnam. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, 102 (Supplement 1): pS30-S36. 8. Simpson AJ and Wuthiekanun V (2005), Interaction of insulin with Burkholderia pseudomallei may be caused by a preservative. Journal of clinical pathology, 53(2): p. 159-160. 9. Wiersinga WJ, Currie BJ, and Peacock SJ (2012), Melioidosis. N Engl J Med, 367(11): p. 1035-44. Ngày nhận bài báo: 18/11/2016 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 01/12/2016 Ngày bài báo được đăng: 01/03/2017