Thiết lập chất đối chiếu và kiểm nghiệm tạp B và tạp C của Glimepirid trong nguyên liệu và chế phẩm Glimepirid

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 161 THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU VÀ KIỂM NGHIỆM TẠP B VÀ TẠP C CỦA GLIMEPIRID TRONG NGUYÊN LIỆU VÀ CHẾ PHẨM GLIMEPIRID Võ Thị Hằng Nga*, Trương Ngọc Tuyền*, Nguyễn Đức Tuấn* TÓM TẮT Mở đầu – Mục tiêu: Glimepirid sulfonamid (tạp B) và glimepirid urethan (tạp C) là tạp chất liên quan của glimepirid, có nguồn gốc từ quá trình tổng hợp và bảo quản glimepirid. Các tạp này gây ảnh hưởng đến hiệu quả điều trị và tính an toàn của thuốc. Do đó, trong chuyên luận glimepirid của dược điển một số nước như BP 2017 và USP 40 đều quy định phải kiểm tra giới hạn hàm lượng tạp B và tạp C cả trong nguyên liệu và thành phẩm chứa glimepirid. Hiện nay, nhóm nghiên cứu của chúng tôi đã tổng hợp thành công tạp B và tạp C với độ tinh khiết sắc ký trên 99% tính trên nguyên trạng, sử dụng phương pháp HPLC qui về 100% diện tích pic. Cho đến nay, chưa có công trình công bố về thiết lập chất đối chiếu tạp B và tạp C của glimepirid. Xuất phát từ những lý do trên, nghiên cứu này được thực hiện với mục tiêu thiết lập chất đối chiếu và kiểm nghiệm tạp B và tạp C của glimepirid trong nguyên liệu và chế phẩm glimepirid. Đối tượng – Phương pháp nghiên cứu: Đối tượng nghiên cứu: 3-ethyl-4-methyl-2-oxo-N-[2-(4- sulfamoylphenyl)ethyl]-2,3-dihydro-1H-pyrrol-1-carboxamid (tạp chất liên quan B của glimepirid, glimepirid sulfonamid) và methyl [[4-[2-[[(3-ethyl-4-methyl-2-oxo-2,3-dihydro-1H-pyrrol-l-yl) carbonyl] amino] ethyl]phenyl]sulfonyl] carbamat (tạp chất liên quan C của glimepirid, glimepirid urethan, glimepirid carbamat). Phương pháp nghiên cứu: Thiết lập chất đối chiếu tạp B và tạp C của glimepirid theo ISO guide 34:2009 và ISO 13528:2005; Kiểm tra tạp B và tạp C của glimepirid trong nguyên liệu và chế phẩm chứa glimepirid trên thị trường, sử dụng tạp đã được thiết lập chất đối chiếu. Kết quả: Kết quả đánh giá và thiết lập chất đối chiếu tạp B và C cho thấy chất này đủ điều kiện để đăng ký chuẩn quốc gia với độ tinh khiết sắc ký được xác định lần lượt là 99,43% và 99,87% tính trên nguyên trạng. Kết quả kiểm tra tạp B và tạp C trong một số nguyên liệu và chế phẩm chứa glimepirid đang lưu hành tại Việt Nam cho thấy hàm lượng tạp B và tạp C đều nằm trong giới hạn cho phép theo qui định của USP 40 . Kết luận: Tạp B và tạp C của glimepirid đã được thiết lập chất đối chiếu với độ tinh khiết trên 99% tính trên nguyên trạng. Đã kiểm tra tạp chất liên quan của một số mẫu nguyên liệu và thành phẩm chứa glimepirid, sử dụng tạp đã được thiết lập chất đối chiếu. Từ khóa: glimepirid sulfonamid, glimepirid urethan, glimepirid carbamat, tạp B của glimepirid, tạp C của glimepirid. ABSTRACT ESTABLISHEMENT OF REFERENCE STANDARD AND QUALITY CONTROL OF IMPURITY B AND IMPURITY C OF GLIMEPIRIDE IN MATERIAL GLIMEPIRIDE AND ITS PREPARATIONS Vo Thi Hang Nga, Truong Ngoc Tuyen, Nguyen Duc Tuan * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 - No 2- 2019: 161 – 169 Background – Objectives: Glimepiride sulfonamide (impurity B) and glimepiride urethane (impurity C) are impurities of glimepiride which arise from synthesis and during storage of glimepiride. The presence *Khoa Dược, Đại Học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: PGS.TS. Nguyễn Đức Tuấn ĐT: 0913799068 Email: ductuan@ump.edu.vn Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 162 of these impurities may influence on treatment efficacy and safety of glimepiride. The BP 2017 and USP 40 require conducting the impurity test in material glimepiride and its preparations. Glimepiride impurity B and C were successfully synthesized with their HPLC purity over 99% on the basis, using peak area normalization method. There has been no publication for establishment of reference standard of impurities B and C so far. Therefore, this study was carried out with the aim of establishment of reference standard and quality control of impurities B and C in material glimepiride and its preparations Method: The object of this study is 3-ethyl-4-methyl-2-oxo-N-[2-(4-sulfamoylphenyl)ethyl]-2,3- dihydro-1H-pyrrol-1-carboxamid (glimepiride impurity B, glimepiride sulfonamide) and methyl [[4-[2-[[(3- ethyl-4-methyl-2-oxo-2,3-dihydro-1H-pyrrol-l-yl) carbonyl] amino] ethyl]phenyl]sulfonyl] carbamat (glimepiride impurity C, glimepiride urethane, glimepiride carbamate). Method: Establishment of reference standard of glimepiride impurities B and C, basing on ISO guide 34:2009 and ISO 15328:2005 guide; Quality control of these impurities in material glimepiride and its preparations, using the established impurity B and C reference standards. Results: The results of evaluation and establishment of impurity B and C reference standards showed that these substances can be applied for registration of national reference standards. The HPLC purity of impurities B and C were 99.43% and 99.87% on the basis, respectively. All the calculations concerning the quantitative analysis showed that several material glimepirides and its preparations in Vietnam market contained an amount of glimepiride impurities B and C that was within accepted limits according to USP 40. Conclusion: Glimepiride impurities B and C were established reference standards with their HPLC purity over 99% on the basis. Quality control of these impurities in material glimepiride and its preparations was carried out, using the established impurity B and C reference standards. Key words: Glimepiride sulfonamide, glimepiride urethane, glimepiride carbamate, glimepiride impurity B, glimepiride impurity C. ĐẶT VẤN ĐỀ Glimepirid sulfonamid (tạp B) và glimepirid urethan (tạp C) là tạp chất liên quan của glimepirid, có nguồn gốc từ quá trình tổng hợp glimepirid(9,10,11) hay trong quá trình sản xuất, bảo quản và lưu thông phân phối thành phẩm glimepirid, do sự thủy phân nhóm amid(3,6). Theo Quy định (EC) số 1272/2008, tạp B gây nguy hiểm lâu dài cho sinh vật dưới nước và tạp C có ảnh hưởng đến sức khỏe con người, gây độc cấp tính nếu nuốt, hít phải, tiếp xúc với da và những tổn thương tạm thời có thể xuất hiện(7,8). Do đó, trong chuyên luận glimepirid của dược điển một số nước như BP 2017(2) và USP 40(12) đều quy định phải kiểm tra giới hạn hàm lượng tạp B và C cả trong nguyên liệu và thành phẩm. Trong khi đó, tạp B và tạp C chuẩn USP đang được bán với giá rất đắt và phải mua từ nước ngoài nên gây không ít khó khăn cho công tác kiểm nghiệm tạp chất này. Hiện nay, nhóm nghiên cứu của chúng tôi đã tổng hợp thành công tạp B và tạp C với độ tinh khiết sắc ký trên 99% tính trên nguyên trạng, sử dụng phương pháp HPLC qui về 100% diện tích pic. Trong bài báo này, chúng tôi công bố việc thiết lập chất đối chiếu tạp B và tạp C, kiểm nghiệm tạp B và tạp C của glimepirid trong nguyên liệu và chế phẩm glimepirid, sử dụng chất đối chiếu tạp B và tạp C đã được thiết lập. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu: Tạp B và tạp C của glimepirid. Nguyên vật liệu Nguyên liệu: Tạp B và tạp C đã được tổng hợp và được xác định độ tinh khiết trên 99% tính trên nguyên trạng, sử dụng phương pháp HPLC Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 163 qui về 100% diện tích pic. Nguyên liệu glimepirid do công ty TNHH Davipharm cung cấp, số kiểm soát GM/171202, hàm lượng 98,63%, điều kiện bảo quản 2-8oC. Trang thiết bị: Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu CTO-10AS, đầu dò PDA., cột sắc ký InertSustain RP C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm), cân phân tích HR – 250AZ, máy siêu âm S70H Elmasonic, máy đo pH Inolab WTW – pH 720. Hóa chất và dung môi: Acetonitril (ACN) đạt tiêu chuẩn dùng cho sắc ký lỏng (Merck). Natri dihydrophosphat và acid phosphoric đạt tiêu chuẩn phân tích (Merck). Phương pháp nghiên cứu Đánh giá tạp B và tạp C Tạp B và tạp C được đánh giá theo các chỉ tiêu sau: cảm quan, độ tan (trong nước, methanol, ethanol và một số dung môi hữu cơ) theo DĐVN V, điểm chảy, hàm ẩm, định danh bằng các phương pháp phổ nghiệm (UV, IR, MS, NMR) và độ tinh khiết sắc ký. Thiết lập chất đối chiếu tap B và tạp C Đánh giá độ đồng nhất của quá trình đóng lọ Các mẫu được lấy ngẫu nhiên theo công thức N +1 trong đó N là tổng số lọ. Việc xác định độ tinh khiết của tạp B và tạp C trong từng lọ được tiến hành theo phương pháp HPLC đã xây dựng và thẩm định, mỗi lọ được xác định 2 lần. Việc đánh giá độ đồng nhất của quá trình đóng lọ được dựa trên hướng dẫn của ISO guide 34:2009(5). Đánh giá độ đồng nhất lọ liên phòng thí nghiệm Tạp B và tạp C sau khi được đóng gói và đánh giá đồng nhất lọ đạt yêu cầu sẽ được lấy mẫu ngẫu nhiên và tiến hành xác định độ tinh khiết tại hai phòng thí nghiệm độc lập. Các phòng thí nghiệm được lựa chọn để gửi mẫu phải đạt GLP hoặc ISO/IEC 17025. Mỗi phòng thí nghiệm sẽ nhận được sáu lọ mẫu ngẫu nhiên kèm theo qui trình phân tích và các tài liệu liên quan. Trước khi phân tích, mỗi phòng thí nghiệm sẽ kiểm tra tính phù hợp của hệ thống với yêu cầu hệ số bất đối của pic tạp B và C nằm trong khoảng 0,8 – 1,5 và RSD giữa 6 lần đo lặp lại không được quá 2%. Nếu đạt yêu cầu, sẽ tiến hành xác định độ tinh khiết tạp B và tạp C trên 6 mẫu đã nhận, mỗi mẫu được xác định 2 lần. Các phòng thí nghiệm được lựa chọn để gửi mẫu là Khoa Thiết lập chất chuẩn & chất đối chiếu (PTN1) và Khoa Kiểm nghiệm mỹ phẩm (PTN2) thuộc Viện Kiểm nghiệm thuốc TP. Hồ Chí Minh. Việc đánh giá độ đồng nhất lọ liên phòng thí nghiệm sẽ được thực hiện bằng phép phân tích phương sai một yếu tố ANOVA(1,5). Xác định giá trị ấn định và độ không đảm bảo đo: Việc xác định giá trị ấn định trên phiếu kiểm nghiệm tạp B và tạp C và độ không đảm bảo đo được thực hiện theo hướng dẫn của ISO 13528:2005(4), dựa theo 12 kết quả xác định độ tinh khiết của tạp B và tạp C tại 2 phòng thí nghiệm. Kiểm tra tạp B và tạp C trong nguyên liệu và chế phẩm glimepirid Tạp B và tạp C sau khi được thiết lập chất đối chiếu sẽ được sử dụng để kiểm tra hai tạp này trong nguyên liệu glimepirid và các chế phẩm tương ứng. Áp dụng quy trình HPLC kiểm nghiệm tạp B và C theo USP 40(12) với điều kiện sắc ký như sau: cột sắc ký RP C18 (250 x 4,6 mm; 5 m), tốc độ dòng 1,0 ml/phút, bước sóng phát hiện 228 nm, thể tích tiêm 10 l (với mẫu chế phẩm glimepirid) và 20 µl (với mẫu nguyên liệu Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 164 glimepirid), pha động bao gồm 0,5 g natri dihydrophosphat trong 500 ml nước cất, điều chỉnh đến pH 2,5 bằng acid phosphoric đậm đặc, thêm 500 ml acetonitril, lắc đều; dung môi pha mẫu là nước và acetonitril có tỷ lệ lần lượt là 1:9 và 1:4 với mẫu chế phẩm và nguyên liệu, thời gian sắc ký mẫu chế phẩm và nguyên liệu lần lượt là 3,5 và 2,5 lần thời gian lưu của gliempirid. Chuẩn bị mẫu Kiểm nghiệm tạp B và tạp C trong nguyên liệu Dung dịch thử tính tương thích hệ thống Chuẩn bị dung dịch bao gồm glimepirid 4 µg/ml, tạp B 2 µg/ml và tạp C 2 µg/ml. Dung dịch đối chiếu (1): Pha dung dịch glimepirid có nồng độ 2000 µg/ml. Dung dịch đối chiếu (2) Pha dung dịch tạp B của glimepirid có nồng độ 2000 µg/ml. Hút 1 ml dung dịch này cho vào bình định mức 100 ml, định mức đến vạch. Dung dịch đối chiếu (3) Pha dung dịch tạp C của glimepirid có nồng độ 2000 µg/ml. Hút 1 ml dung dịch này cho vào bình định mức 100 ml, định mức đến vạch. Dung dịch đối chiếu: Hút 10 ml dung dịch đối chiếu (1), 4 ml dung dịch đối chiếu (2) và 1 ml dung dịch đối chiếu (3), cho vào bình định mức 100 ml, định mức đến vạch. Dung dịch thu được có nồng độ glimepirid 200 µg/ml, tạp B 0,8 µg/ml (tương ứng với giới hạn cho phép trong nguyên liệu là 0,4%) và tạp C 0,2 µg/ml (tương ứng với giới hạn cho phép trong nguyên liệu là 0,1%). Dung dịch thử Cân chính xác 20,0 mg glimepirid, cho vào bình định mức 100 ml, hòa tan và định mức đến vạch bằng dung môi pha mẫu, lắc đều. Tất cả các dung dịch đều được lọc qua màng lọc 0,45 µm trước khi tiến hành sắc ký. Các dung dịch được chuẩn bị trước khi sử dụng và thao tác nhanh, bảo quản dung dịch ở nhiệt độ không quá 12oC và sử dụng dung dịch trong vòng 15 giờ. Kiểm nghiệm tạp B trong thành phẩm Dung dịch đối chiếu (1) Cân 10 mg glimepirid, cho vào bình định mức 10 ml, pha loãng bằng dung môi pha mẫu đến vạch. Dung dịch đối chiếu (2) Cân 2,5 mg tạp B đối chiếu, cho vào bình định mức 100 ml, pha loãng bằng dung môi pha mẫu đến vạch. Dung dịch đối chiếu Hút 1 ml dung dịch đối chiếu (1), 1 ml dung dịch đối chiếu (2), cho vào bình định mức 10 ml, pha loãng bằng dung môi pha mẫu đến vạch. Dung dịch thu được có nồng độ glimepirid 100 µg/ml, tạp B 2,5 µg/ml (tương ứng với giới hạn cho phép trong chế phẩm là 2,5%). Dung dịch thử Cân chính xác 20 viên, xác định khối lượng trung bình của một viên, nghiền thành bột mịn. Cân chính xác một lượng bột thuốc tương đương với khối lượng trung bình của 10 viên, cho vào bình định mức 50 ml, thêm dung môi pha mẫu, pha dung dịch có nồng độ glimepirid 0,1 mg/ml (dựa vào hàm lượng ghi trên nhãn), siêu âm ở nhiệt độ không quá 20oC trong khoảng 5-10 phút, ly tâm lấy dịch. Tất cả các dung dịch đều được lọc qua màng lọc 0,45 µm trước khi tiến hành sắc ký. Dung dịch sau khi pha chỉ được sử dụng trong vòng 24 giờ. KẾT QUẢ Đánh giá tạp B và tạp C Bảng 1 và bảng 2 trình bày kết quả đánh giá tạp B và tạp C. Với độ tinh khiết trên 99% nên hai chất này đủ điều kiện để thiết lập chất đối chiếu. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 165 Bảng 1: Kết quả đánh giá tạp B Chỉ tiêu Phương pháp Kết quả Tính chất Cảm quan Tinh thể trắng, không mùi. Độ tan Hơi tan trong aceton, cloroform, methanol, dicloromethan, rất khó tan trong nước và ethanol Định tính Phổ hồng ngoại IR (KBr): max (cm -1 ) 3363,9 (N-H), 2880 (CH sp 3 ), 2938 (CHsp 3 ), 1660,7 (N-C=O), 1537,3 (N- H), 1438,9 (CH3) Phổ khối ESI-MS (+) có m/z = 374,0966 [M+Na] + ESI-MS (-) có m/z = 350,1077 [M-H] - Công thức phân tử: C16H21N3O4S Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 5 4 3 2 1 6 S NH2 O O 7 8 N H 9 O N 1011 12 13 O 14 H3C15 H3C 16 1 H-NMR (500 MHz, DMSO): δH (ppm) 8,36 (t, 1H, J=6,0 Hz, NH-CO), 7,75 (d, 2H, J = 8,0 Hz, H-2; H-6), 7,42 (d, 2H, J = 8,5 Hz, H-3; H-5), 7,29 (s, 2H, NH2), 4,17 (s, 2H, H-13), 3,49 (q, 2H, J = 6,5 Hz, H-8), 2,88 (t, 2H, J = 7,0 Hz, H-7), 2,18 (q, 2H, J = 7,5 Hz, H-14), 2,01 (s, 3H, H-16), 0,98 (t, 3H, J = 7,5 Hz, H-15) 13 C-NMR (125 MHz, DMSO): δC (ppm) 171,84 (C-9), 152,05 (C-10), 151,64 (C-12), 143,37 (C- 11), 142,14 (C-1), 131,92 (C-4), 129,08 (C-2, C- 6), 125,73 (C-3, C-5), 51,88 (C-13), 40,02 (C-8), 35,06 (C-7), 15,98 (C-14), 12,82 (C-16), 12,69 (C-15) Điểm chảy DSC 182 o C – 183 o C Hàm ẩm TGA ≤ 0,5% Tạp chất liên quan HPLC ≤ 2,0% Độ tinh khiết sắc ký HPLC ≥ 98,0% tính trên nguyên trạng Bảng 2: Kết quả đánh giá tạp C Chỉ tiêu Phương pháp Yêu cầu Tính chất Cảm quan Tinh thể vàng nhạt, không mùi. Độ tan Hơi tan trong aceton, cloroform, methanol, dicloromethan, rất khó tan trong nước và ethanol Định tính Phổ hồng ngoại IR (KBr): max (cm -1 ) 3242,3 (N-H), 2852 (CH sp 3 ), 2936 (CHsp 3 ), 1755,2 (C=O), 1654,9 (N- C=O), 1354,0 (SO2), 1161,2 (SO2) Phổ khối ESI-MS (+) có m/z = 432,1184 [M+Na] + ESI-MS (-) có m/z = 408,1212 [M-H] - Công thức phân tử: C18H23N3O6S Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H-NMR (500 MHz, DMSO): δH (ppm) 8,38 (s, 1H, NH-SO2), 7,80 (d, 2H, J = 8,0 Hz, H-2; H-6), 7,47 (d, 2H, J = 8,5 Hz, H-3; H-5), 4,17 (s, 2H, H-13), 3,54 (s, 3H, CH3(ester)), 3,50 (q, 2H, J = 6,5 Hz, H-8), 2,91 (t, 2H, J = 7,5 Hz, H-7), 2,18 (q, 2H, J = 7,5 Hz, H-14), 2,01 (s, 3H, H-16), 0,97 (t, 3H, J = 7,5 Hz, H-15) 13 C-NMR (125 MHz, DMSO): δC (ppm) 171,82 (C-9), 152,19 (C-10), 152,01 (CO ester), 151,64 (C-12), 145,16 (C-11), 137,69 (C-1), 131,93 (C- 4), 129,26 (C-2, C-6), 127,41 (C-3, C-5), 52,64 (CH3 ester), 51,87 (C-13), 39,86 (C-8), 35,18 (C- 7), 15,98 (C-14), 12,81 (C-16), 12,68 (C-15) Hàm ẩm TGA ≤ 4,0% Tạp chất liên quan HPLC ≤ 2,0% Độ tinh khiết sắc ký HPLC ≥ 98,0% tính trên nguyên trạng Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 166 Thiết lập chất đối chiếu tạp B và tạp C Một ngàn miligam tạp B được đóng 50 lọ, mỗi lọ 20 mg và 6 lọ được lấy ngẫu nhiên theo phần mềm Excel. Năm trăm miligam tạp C được đóng 50 lọ, mỗi lọ 10 mg và 6 lọ cũng được lấy ngẫu nhiên theo phần mềm Excel. Kết quả xác định tính phù hợp hệ thống tại hai phòng thí nghiệm đều đạt yêu cầu về hệ số bất đối của pic tạp B, tạp C và RSD của diện tích pic tạp B, tạp C nên có thể tiếp tục tiến hành xác định độ tinh khiết tạp B, tạp C. Bảng 3 và bảng 4 minh họa kết quả đánh giá độ đồng nhất của quá trình đóng lọ và độ đồng nhất lọ liên phòng thí nghiệm. Dựa vào kết quả phân tích ANOVA cho thấy các lọ đóng gói có hàm lượng đồng nhất, điều kiện đóng gói ổn định và phù hợp, kết quả định lượng giữa 2 phòng thí nghiệm khác biệt không có ý nghĩa thống kê, quy trình phân tích có độ lặp lại cao, độ tinh khiết chất phân tích không phụ thuộc vào phòng thí nghiệm tham gia đánh giá. Bảng 3: Kết quả đánh giá độ đồng nhất của quá trình đóng lọ (n=2) Số thứ tự lọ Độ tinh khiết tạp B (%) Số thứ tự lọ Độ tinh khiết tạp C (%) 23 99,50 13 99,89 20 99,45 15 99,83 28 99,42 10 99,84 24 99,43 19 99,87 17 99,43 4 99,87 9 99,43 16 99,87 Bảng 4: Kết quả đánh giá độ đồng nhất lọ liên phòng thí nghiệm Mẫu Độ tinh khiết tạp B (%) Độ tinh khiết tạp C (%) PTN1 PTN2 PTN1 PTN2 1 99,50 99,42 99,89 99,89 2 99,45 99,42 99,83 99,88 3 99,42 99,43 99,84 99,87 4 99,43 99,43 99,87 99,86 5 99,43 99,43 99,87 99,88 6 99,43 99,42 99,87 99,87 Bảng 5: Kết quả xác định giá trị ấn định của tạp B và tạp C (n=12) Số lần thay đổi Tạp B Tạp C x* 0 x* 1 x* 2 x* 3 x* 0 x* 1 x* 2 x* 3  = 1,5s* 0,067 0,038 0,038 0,067 0,031 0,031 x* - δ 99,36 99,40 99,40 99,80 99,84 99,84 x* + δ 99,50 99,47 99,47 99,94 99,90 99,90 Trung bình 99,43 99,43 99,43 99,43 99,87 99,87 99,87 99,87 Độ lệch s 0,0223 0,0223 0,0223 0,0223 0,0180 0,018 0,0180 0,0180 x* mới 99,43 99,43 99,43 99,43 99,87 99,87 99,87 99,87 s* mới 0,0445 0,0253 0,0253 0,0253 0,0445 0,0204 0,0204 0,0204 Nhận xét: Với tạp B, sau ba lần thay đổi, s* = 0,0253 không thay đổi, khi đó x* được chọn là 99,43%. Vậy giá trị ấn định của tạp B là 99,43% và độ không đảm bảo đo: µ = 1,25s*/ p = 0,01. Với tạp C, sau ba lần thay đổi, s* = 0,0204 không thay đổi, khi đó x* được chọn là 99,87%. Vậy giá trị ấn định của tạp C là 99,87% và độ không đảm bảo đo: µ = 1,25s*/ p = 0,018. Như vậy tạp B và tạp C đủ điều kiện để đăng ký chuẩn quốc gia với hàm lượng được xác định lần lượt là 99,43% và 99,87% tính trên nguyên trạng. Tiến hành lập hồ sơ chất chuẩn, dán nhãn lọ chuẩn và kèm theo phiếu kiểm nghiệm. Bảo quản các lọ chuẩn ở nhiệt độ 2- 8oC, tránh ánh sáng. Kiểm tra tạp B và tạp C trong nguyên liệu và chế phẩm glimepirid Tiến hành kiểm tra tạp B và tạp C trên 2 lô nguyên liệu và 4 lô chế phẩm được mã hóa. Kết quả định lượng được trình bày ở bảng 6. Sắc ký đồ các mẫu kiểm tra được minh họa ở hình 1. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 167 Bảng 6: Kết quả kiểm tra tạp B và tạp C trong một số nguyên liệu và chế phẩm chứa glimepirid trên thị trường (n=3) Sản phẩm Mã hóa Hạn dùng Hàm lượng tạp B (%) Hàm lượng tạp C (%) Nguyên liệu glimepirid, mẫu 1 NL 1 01/11/2022 0,13 0,01 Nguyên liệu glimepirid, mẫu 2 NL 2 03/07/2021 0,12 0,01 Viên nén bao phim glimepirid 2 mg (trong nước, công ty A) CP A 23/04/2020 0,55 - Viên nén bao phim glimepirid 2 mg (trong nước, công ty B) CP B 05/04/2020 0,24 - Viên nén bao phim glimepirid 2 mg (trong nước, công ty C) CP C 12/09/2020 1,31 - Viên nén bao phim glimepirid 2 mg (trong nước, công ty D) CP D 19/02/2020 0,29 - Nhận xét: Tất cả các mẫu nguyên liệu và thành phẩm đều cho kết quả kiểm tra tạp B và tạp C đạt giới hạn cho phép theo quy định USP 40. NL 1 NL 2 CP A CP B CP C CP D Hình 1: Sắc ký đồ các mẫu nguyên liệu và chế phẩm glimepirid kiểm tra tạp B và tạp C Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 168 BÀN LUẬN Việc kiểm soát các tạp chất liên quan trong nguyên liệu và đặc biệt là trong thành phẩm tương ứng chưa được quan tâm nhiều tại Việt Nam vì nhiều lý do như một số tạp chất chuẩn vẫn chưa có hoặc nếu có thường rất đắt tiền và phải mua từ nước ngoài. Tuy nhiên, phần lớn các chuyên luận trong dược điển tham chiếu (USP, EP, BP) cũng như dược điển Việt Nam V đều bắt buộc phải kiểm soát tạp chất liên quan. Gần đây, cục Quản lý Dược Việt Nam đã có yêu cầu phải kiểm tra tạp chất liên quan một cách chặt chẽ trong nguyên liệu và thành phẩm đăng ký cho sản xuất và lưu hành. Hiện nay hệ thống kiểm nghiệm thuốc quốc gia chưa cung cấp được tạp chuẩn B và C nên gây khó khăn cho công tác kiểm nghiệm tạp chất này tại các xí nghiệp dược trong nước có sản xuất thành phẩm glimepirid. Việc đặt mua các tạp chuẩn này từ nước ngoài phải mất 1 – 2 tháng với giá thành rất đắt. Kết quả đánh giá và thiết lập chất đối chiếu tạp B và C cho thấy chất này đủ điều kiện để đăng ký chuẩn quốc gia với độ tinh khiết sắc ký được xác định lần lượt là 99,43% và 99,87% tính trên nguyên trạng. Với hiệu suất tổng hợp và tinh chế khá cao (khoảng 74% với tạp B và 60% với tạp C), khối lượng tạp B và tạp C thu được khoảng 1,3 g và 0,5 g cho mỗi lần tổng hợp, nên chất đối chiếu tạp B và tạp C có thể cung cấp đủ cho các xí nghiệp dược trong nước có nhu cầu, góp phần làm tăng nguồn tạp chuẩn trong công tác kiểm tra chất lượng tạp chất liên quan. Quy trình kiểm tra tạp B và tạp C trong nguyên liệu và thành phẩm chứa glimepirid sử dụng quy trình trong USP 40 có sự thay đổi kích thước cột sắc ký C18 (250 x 4,0 mm; 4 m) bằng cột C18 (250 x 4,6 mm; 5 m). Tuy nhiên kết quả kiểm tra tính phù hợp hệ thống của quy trình kiểm tra tạp chất B và C trong nguyên liệu glimepirid theo USP 40 cho thấy quy trình vẫn đạt tính phù hợp hệ thống, thời gian lưu của các pic tạp B, tạp C và glimepirid đều thay đổi không đáng kể so với yêu cầu của dược điển, các pic chính đều tách tốt và đạt các thông số sắc ký. Hơn nữa, cột C18 (250 x 4,6 mm; 5 m) rất phổ biến ở các phòng thí nghiệm ở Việt Nam hơn. Do đó có thể sử dụng quy trình trong USP 40 và cột này để kiểm tra tạp B và tạp C trong nguyên liệu và thành phẩm chứa glimepirid. Kết quả định lượng tạp B và tạp C trong một số nguyên liệu và chế phẩm glimepirid trên thị trường cho thấy một số nguyên liệu và chế phẩm có hàm lượng tạp nằm dưới giới hạn cho phép. Đây là một kết quả khả quan vì glimepirid là một trong những thuốc điều trị đái tháo đường type II hiện đang được kê toa khá phổ biến, sử dụng dài và hàng ngày nên nếu hàm lượng tạp vượt quá giới hạn cho phép sẽ gây ảnh hưởng không nhỏ đến sức khỏe của người bệnh. KẾT LUẬN Tạp B và tạp C của glimepirid đã được thiết lập chất đối chiếu với độ tinh khiết trên 99% tính trên nguyên trạng. Đã kiểm tra tạp chất liên quan của một số mẫu nguyên liệu và thành phẩm chứa glimepirid theo qui định của USP 40, sử dụng tạp đã được thiết lập chất đối chiếu. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Asean document guidelines (2007). Guideline for the establishment, handing, storage and use of Asean reference sustances. 2. British Pharmacopoeia (2017). CD-ROMs. Monographs: glimepiride, glimepiride tablets. 3. Gulshan B, Manjeet S, Jindal KC, Saranjit S (2008). LC –UV- PDA and LC-MS studies to characterize degradation products of glimepiride. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, pp.788-795. 4. ISO 13528:2005 (2005). Statistical methods for use in proficiency testing by inter-laboratory comparisons, pp. 64. 5. ISO guide 34:2009 (2009). General requirements for the competence of reference material producers. 6. Lestari MLAD, Gunawan I (2011). Gimepiride. Profiles of Drug Substances, Excipients, and Related Methodology, Vol. 36, pp. 169-204. Elsevier Inc., Indonesia. 7. LGC standards (2014). Safety Data Sheet Sheet according to 1907/2006/EC. Article 31, Glimepiride Related Compound C, D, pp.1-6. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 169 8. LGC standards (2017). Safety Data Sheet Sheet according to 1907/2006/EC. Article 31, Glimepiride Related Compound B, pp.1-6. 9. Mubeen AK, Sukumar S, Santosh V, Atul B, Shanka K (2005). LC determination of glimepiride and its related impurities. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, pp.928-943. 10. Rohit RS, Thennati R, Rajeev BR (2006). Process for the preparation of trans-3-ethyl-2,5-dihydro-4-methyl n-2- 4-(4-methyl cyclohexyl) amino .carbonyl. amino. sulfonyl.phenyl.ethyl.-2-oxo-1h-pyrrole-1 carboxamide. United States Patent No. 7, 132, 444 B2. 11. Suresh MK, Venkatasubramanian RT, Sanjay JN, Sachin BG (2007). Process for the preparation of substantially pure Glimepiride. United States Patent No. 0082943. 12. USP 40 (2017). CD-ROMs. Monographs: glimepiride, glimepiride tablets. Ngày nhận bài báo: 18/10/2018 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 01/11/2018 Ngày bài báo được đăng: 15/03/2019