Thiết lập chất chuẩn berberin chloride

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 3 * 2019 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch 361 THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN BERBERIN CHLORIDE Huỳnh Thị Ngọc Ngân*, Trương Vũ Hoài Thu*, Nguyễn Minh Đức** TÓM TẮT Mục tiêu: Berberin clorid là alkaloid quan trọng có trong nhiều loài dược liệu khác nhau. Đề tài này nhằm thiết lập chất chuẩn berberin chloride đạt tiêu chuẩn chất chuẩn gốc (primary reference standard) theo hướng dẫn trong các ISO Guide. Phương pháp: Chất điều chế được định tính bằng TLC, IR, HR-MS và định lượng bằng HPLC. Sau đó đóng gói và đánh giá đồng nhất lô, đánh giá liên phòng thí nghiệm. Xử lý kết quả theo Anova và ISO Guides. Kết quả: chất chuẩn berberin chlorid thiết lập được có hàm lượng 93,73%, theo nguyên trạng. Kết luận: Đã thiết lập chất chuẩn berberin cloride theo ISO Guides. Chất chuẩn này có thể dùng trong nghiên cứu hay kiểm nghiệm dược liệu chứa berberin chlorid. Từ khóa: berberin chlorid, ISO Guide 35, ISO 13528, đồng nhất lô, đánh giá liên phòng thí nghiệm, giá trị ấn định, z-core ABSTRACT PREPARE BERBERIN CHLORIDE AS REFERENCE STANDARD Huynh Thi Ngoc Ngan, Truong Vu Hoai Thu, Nguyen Minh Duc * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 - No 3- 2019: 361-365 Objective: Berberin chloride is a major alkaloid in plants. In this paper we report the establishment of berberin chloride as reference standards following validation requirements of ISO Guides. Method: The substance was identified by TLC, IR, HR-MS and assayed by HPLC. The interlaboratory validation was performed after the substance was packaged to 10 mg/vial and tested for batch homogeneity. The results was evaluated by Anova and ISO Guides. Results: Berberin chloride was prepared as a reference standard with 93.73% purity as basis. Conclusion: Berberin cloride reference standard was well prepared according to ISO Guides. This reference standard can be used for reseach purpose or to control the quality of medical plant that contain berberin chlorid. Keywords: berberin chlorid, ISO Guide 35, ISO 13528, batch homogeneity, interlaboratory validation, assigned value, z-core ĐẶT VẤN ĐỀ Berberin clorid là alkaloid quan trọng có trong nhiều loài dược liệu khác nhau như vàng đắng, hoàng liên, hoàng bávà các chế phẩm như Berberal, Strep-Berin. Vì vậy, hợp chất này được sử dụng như chất chuẩn để kiểm định các dược liệu và thành phẩm trên thị trường. Đề tài này nhằm thiết lập chất chuẩn berberin chloride đạt tiêu chuẩn chất chuẩn gốc (primary reference standard) theo hướng dẫn trong các ISO Guide. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Berberin clorid (10,93 g) được Ban nghiên cứu Khoa học – Thư viện, Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh cung cấp. Chất chuẩn đối chiếu: Chuẩn của Viện *Trường Đại học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch, Thành phố Hồ Chí Minh. **Trường Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: ThS.DS. Huỳnh Thị Ngọc Ngân ĐT: 0988 334 618 Email: nganhtn@pnt.edu.vn Tác giả liên liên lạc: BS CK2. Nguyễn Phú Hữu ĐT: 0918650345 Email: bsphuhuu2012@gmail.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 3 * 2019 Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch 362 Kiểm nghiệm thuốc TP. Hồ Chí Minh, số lô QT122 030910, hàm lượng 90,62% tính theo nguyên trạng. Phương pháp nghiên cứu Định tính, xác định cấu trúc và định lượng Định tính Berberin clorid được định tính bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKLM) với 3 hệ dung môi khác nhau, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), hồng ngoại (IR) so với chất chuẩn. Xác định cấu trúc Phổ hồng ngoại đo trên máy Shimadzu FTIR-8201PC, phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) thực hiện trên máy Bruker 500 MHz NMR, phổ khối có độ phân giải cao (HR-MS) đo trên máy Bruker µQ-TOF MS. Định lượng bằng HPLC Tiến hành theo Dược điển Việt Nam (DĐVN) IV, chuyên luận “Berberin clorid”. Định lượng HPLC được thực hiện trên máy Shimadzu LC-20A (Nhật) và Agilent (Anh) với detector dãy diod quang (PDA) và sử dụng các chất chuẩn đối chiếu. Điều kiện sắc ký Cột: C18, 250 x 4,6 mm, 5m. Pha động: Hoà tan 3,4 g kali dihydro phosphat và 1,7 g natri lauryl sulfat trong hỗn hợp nước - acetonitril (1:1) vừa đủ 1000 ml. Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút. Thể tích tiêm: 10 l. Bước sóng phát hiện: 345 nm. Nồng độ dung dịch chuẩn và thử: 100 ppm. Lựa chọn cột: Hoà tan 1 mg berberin clorid và 1 mg palmatin clorid trong 10 ml pha động. Tiến hành sắc ký và chọn cột sắc ký cho độ phân giải giữa palmatin và berberin không nhỏ hơn 1,5. Kiểm tra khả năng thích hợp của hệ thống sắc ký: Tiêm riêng biệt 5 lần dung dịch chuẩn, độ lệch chuẩn tương đối của diện tích pic berberin không được lớn hơn 1,5%. Đóng gói và đánh giá đồng nhất lô trong quá trình đóng gói Berberiin clorid sau khi định tính, định lượng sẽ được đóng lọ ở điều kiện tiêu chuẩn trong Glove-Box (chứa 99,9% nitơ, độ ẩm 10%) vào các lọ thủy tinh màu nâu và đóng kín, có lớp đệm teflon, mỗi lọ 20 mg, đóng 100 lọ. Lấy 11 lọ ( N + 1) để đánh giá đồng nhất lô trong quá trình đóng gói, mỗi lọ kiểm tra 2 lần. Đánh giá kết quả theo ISO Guides(1,2). Đánh giá chất chuẩn liên phòng thí nghiệm Thành phẩm sau khi được đóng gói và đánh giá đồng nhất lô đạt yêu cầu được lấy mẫu ngẫu nhiên và tiến hành định lượng tại ba phòng thí nghiệm (PTN) độc lập đạt GLP hoặc ISO 17025, trong đó có ít nhất một phòng thí nghiệm có đủ thẩm quyền và có ý nghĩa pháp lý đối với Việt Nam. Mỗi PTN định lượng 6 lọ. Tính thống kê kết quả từ 3 phòng thí nghiệm theo Anova (n=18). Nếu Ftn ≤ Ftc, kết quả trung bình của 3 PTN khác nhau không có nghĩa, phương pháp phân tích có độ lặp lại cao, hàm lượng chất chuẩn đánh giá không phụ thuộc vào PTN tham gia đánh giá. Xác định giá ấn định, độ không đảm bảo đo và giá trị công bố trên phiếu kiểm nghiệm(3) Tiến hành xác định giá trị công bố trên phiếu kiểm nghiệm khi kết quả đánh giá liên phòng thí nghiệm đạt yêu cầu (Ftn ≤ Ftc). Giá trị ấn định x*(n) được chọn khi giá trị s* không thay đổi sau n lần tính (lấy 3 số lẻ phía sau dấu phẩy); sử dụng giá trị ấn định x*(n) để đánh giá từng kết quả phân tích theo test-z, loại bỏ các kết quả phân tích có z > 2,0; chọn các giá trị z ≤ 2,0, tính giá trị trung bình. KẾT QUẢ Định tính và xác định cấu trúc SKLM: Trên ba hệ dung môi sắc ký khác nhau, berberin clorid đều cho một vết có màu sắc và Rf trùng với berberin clorid chuẩn. Khi Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 3 * 2019 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch 363 thêm palmatin vào mẫu thử thấy có vết palmatin tách ra rõ, chứng tỏ hệ dung môi khai triển đặc hiệu đối với berberin clorid và mẫu thử không lẫn palmatin, nếu có chỉ với lượng không đáng kể. Phổ IR của mẫu berberin clorid điều chế phù hợp với phổ của mẫu chuẩn (Hình 1). HPLC: Thời gian lưu của mẫu điều chế và mẫu chuẩn trùng nhau khi tiêm triển khai trên HPLC trong cùng điều kiện sắc ký. Phổ HR-MS của mẫu điều chế cho các mảnh có số khối 336,1257 m/z, 337,1282 m/z, (M+) = 336,36 tương ứng với công thức C20H18NO4 của berberin clorid. Phổ NMR: Phổ 1H-NMR và 13C-NMR của berberin clorid điều chế phù hợp với berberin clorid theo tài liệu đã công bố(4) (Bảng 1, Hình 2). Bảng 1. So sánh dữ liệu phổ 13C-NMR của berberin clorid điều chế (125 MHz, m = ppm) trong CD3OD) với chất chuẩn(4) Aglycon Đường Vị trí Berberin (4) Berberin điều chế Vị trí Berberin (4) Berberin điều chế 1 105,43 106,57 10 150,36 152,26 2 147,63 150,00 11 126,67 128,35 3 149,76 152,06 12 123,53 124,49 4 108,43 109,40 12a 132,94 135,33 4a 130,64 131,92 13 120,18 121,54 5 26,35 28,25 13a 137,41 139,80 6 55,19 57,26 13b 120,42 121,89 8 145,42 146,35 OCH2O 102,07 103,63 8a 121,37 123,40 9-OMe 61,95 62,58 9 143,61 145,93 10-OMe 57,06 57,78 Hình 1. Phổ IR của berberin clorid điều chế (a) và chuẩn (b) Hình 2. Phổ 1H-NMR (a) và phổ 13C-NMR của berberin clorid điều chế Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 3 * 2019 Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch 364 Định lượng berberin clorid bằng phương pháp HPLC Bảng 2. Kết quả kiểm tra tính tương thích hệ thống berberin clorid (n=6) Thời gian lưu Diện tích đỉnh Hệ số kéo đuôi T Số đĩa lý thuyết Trung bình RSD% 97 9,744 0,40 2153136 0,70 1, 1,5 32403 Định lượng: Kết quả định lượng cho thấy hàm lượng trung bình của berberin clorid được xác định là 92,99% (n = 6), tính theo hiện trạng. Suy ra hàm lượng berberin clorid tính theo chế phẩm khan là 101,08%> 95,00%. Vậy, berberin clorid điều chế đủ điều kiện để thiết lập chất chuẩn theo DĐVN IV. Hình 3. Sắc ký đồ định lượng berberin clorid (a): dung dịch phân giải chứa berberin clorid và palmatin; (b): mẫu thử: (c): mẫu chuẩn Đóng gói và đánh giá đồng nhất lô trong quá trình đóng gói Bảng 3. Kết quả định lượng đánh giá đồng nhất lô STT Lọ số Lần 1 (%) Lần 2 (%) 1 5 93,97 93,84 2 21 94,03 94,36 3 29 93,54 94,38 4 32 93,93 94,02 5 66 94,00 94,29 6 67 93,55 92,87 7 77 94,66 93,72 8 83 94,23 93,25 9 87 93,22 93,42 10 92 93,95 94,22 11 95 94,16 92,94 Loại giá trị bất thường bằng trắc nghiệm Dixon: Xếp các kết quả trên theo thứ tự tăng dần, xét hai kết quả nhỏ nhất và lớn nhất so với chuỗi dữ liệu: Xmin = 92,87% G = 0,235 < G0,05 = 0,468, Xmax = 94,66% G = 0,208 < G0,05 = 0,468. Vậy, kết quả 92,87% và 94,66% không bất thường, nghĩa là chuỗi dữ liệu trên không có giá trị bất thường. Đánh giá sự đồng nhất giữa các lọ theo ISO GUIDE 35, ta có: Do đó áp dụng công thức chuyển đổi để tínhubb. Kết quả thu được như sau: 0,010 <ubb 2 = 0,047 < 0,120, do đó kết luận các lọ berberin clorid điều chế được đóng gói đồng nhất. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 3 * 2019 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch 365 Đánh giá liên phòng thí nghiệm Bảng 4. Kết quả định lượng berberin clorid điều chế (%) tại ba phòng thí nghiệm Mẫu PTN1 PTN2 PTN3 1 93,84 92,89 93,31 2 94,36 94,18 93,9 3 94,38 93,44 93,48 4 94,02 93,81 93,26 5 94,29 93,31 93,96 6 92,87 94,01 93,55 TB 93,96 93,61 93,58 PTN1: Phòng kiểm tra chất lượng Công ty Cổ phần Hóa Dược phẩm Mekophar. PTN2: Khoa Thiết lập chất chuẩn – chất đối chiếu, Viện Kiểm nghiệm thuốc TP. Hồ Chí Minh. PTN3: Khoa Vật lý đo lường, Viện Kiểm nghiệm thuốc TP. Hồ Chí Minh. Phân tích phương sai một yếu tố theo Anova cho thấy Ftn = 1,259 < Ftc = 3,682, do đó kết luận kết quả trung bình của ba phòng thí nghiệm khác nhau không có nghĩa, phương pháp phân tích có độ lặp lại cao, hàm lượng berberin clorid điều chế được không phụ thuộc vào phòng thí nghiệm tham gia đánh giá. Xác định giá trị ấn định, độ không đảm bảo đo và giá trị công bố trên phiếu kiểm nghiệm của berberin clorid Bảng 5. Kết quả tính giá trị ấn định hàm lượng berberin clorid điều chế (n = 18) Số lần thay đổi x*(0) x*(1) x*(2) x*(3) δ = 1,5 x s* - 0,90 0,80 0,80 s* - δ - 93,00 92,93 92,93 s* + δ - 94,65 94,54 94,54 TB 93,71 93,73 93,73 93,73 Độ lệch s 0,47 0,45 0,45 0,45 x* mới 93,83 93,73 93,73 93,73 s* mới 0,550 0,508 0,508 0,508 Sau ba lần thay đổi, giá trị s* không thay đổi (= 0,508), khi đó giá trị x* được chọn là 93,73%. Từ kết quả trên, tính z-core. Kết quả tất cả 18 giá trị đều có |z| ≤ 2,0. Do đó, hàm lượng trung bình berberin clorid được tính như sau: Hàm lượng trung bình: X = 93,73% (n = 18). Độ lệch s: 0,45. Độ không đảm bảo đo µ: 0,150. Như vậy, chất điều chế berberin điều chế đạt tiêu chí của một chuẩn gốc với hàm lượng được xác định là 93,73% tính theo nguyên trạng. KẾT LUẬN Qua nghiên cứu này, chúng tôi đã thiết lập chất chuẩn berberin clorid từ dược liệu có hàm lượng cao (93,73%) tính theo nguyên trạng. Trong quy trình thiết lập, chất chuẩn này được định tính, xác định cấu trúc, định lượng dựa vào quy trình HPLC đã thẩm định và chất chuẩn gốc, đánh giá tính đồng nhất lô đóng gói. Các chất chuẩn cũng đã được thẩm định tại ba phòng thí nghiệm độc lập đạt tiêu chuẩn ISO/GLP. Kết quả đánh giá và thẩm định cho thấy chất chuẩn berberin clorid thiết lập có chất lượng cao, đáng tin cậy, đạt tiêu chí chuẩn gốc để đưa vào phục vụ yêu cầu nghiên cứu, kiểm nghiệm các dược liệu chứa berberin clorid. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. ISO Guide 34 (2009). General requirements for the competence of reference material producers. 2. ISO Guide 35 (2006). Reference materials — General and statistical principles for certification. 3. ISO 13528 (2005). Statistical methods for use in proficiency testing by interlaboratory comparisons. 4. Grycová L, Dotál J, Marek R (2007). Quaternary protoberberine alkaloids. Phytochemistry, 68:pp.150-175. Ngày nhận bài báo: 31/01/2019 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 12/02/2019 Ngày bài báo được đăng: 20/04/2019