Thẩm định quy trình định lượng steroid niệu bằng kỹ thuật sắc ký khí khối phổ

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 21 * Số 3 * 2017 Nghiên cứu Y học 73 THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG STEROID NIỆU BẰNGKỸ THUẬT SẮC KÝ KHÍ KHỐI PHỔ Trần Thị Ngọc Anh*, Trần Thị Chi Mai**,***, Trần Minh Điển*** TÓM TẮT Đặt vấn đề: Kỹ thuật sắc ký khí - khối phổ (gas chromatography/ mass spectrometry: GC/MS) được áp dụng rất hiệu quả trong chẩn đoán rối loạn sinh tổng hợp hormon steroid trên thế giới nhưng chưa được triển khai tại Việt Nam. Nghiên cứu này nhằm ứng dụng và thẩm định phương pháp định lượng steroid niệu bằng kỹ thuậtGC/MS tại Việt Nam. Phương pháp: Các steroid niệu được thủy phân nhờ enzym glucuronidase và arylsulphatase, tách chiết rồi tạo dẫn xuất với methoxyamin và trimethylsilylimmidazol (TMSI), phân tách và định lượng các steroid trên máy GC/MS. Kết quả:Độ chính xác ngắn hạn CV đạt 1,01-7,72(%) ở mẫu nước tiểu bình thường và 0,78-9,2(%) ở mẫu bệnh lý. Độ chính xác dài hạn CV đạt 10,16-14,53(%) ở mẫu bình thường và 12,51-16,95(%) ở mẫu bệnh lý. Giới hạn định lượng 0,05 - 0,16(μmol/L) ở phần lớn các sản phẩm chuyển hóa steroid. Độ thu hồi của các sản phẩm chuyển hoá steroid đạt 90-115(%). Kết luận: Quy trình kỹ thuật định lượng steroid niệu bằng GC/MS xây dựng được là chính xác và xác thực, có thể sử dụng để chẩn đoán và theo dõi điều trị một số rối loạn sinh tổng hợp hormon steroid. Từ khóa: steroid niệu, sắc ký khí khối phổ, rối loạn tổng hợp steroid, thẩm định phương pháp ABSTRACT VALIDATION OF URINE STEROID PROFILING BY GAS CHROMATOGRAPHY/MASS SPECTROMETRY Tran Thi Ngoc Anh, Tran Thi Chi Mai, Tran Minh Dien * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 21 - No 3 - 2017: 73 - 78 Backgrounds: This study aimed to develop and validate the urinary steroid profiling by gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS). Methods: The urine samples are subjected to enzyme hydrolysis using β-glucuronidase/ arylsulfatase. The unconjugated steroids are extracted, derivatized using methoxyamine and trimethylsilylimmidazol (TMSI). The derivatives were separated and quantified on GCMS. Results: The short-term imprecision were 1.01-7.72(%) and 0.78-9.2(%) for the pooled normal urine and pooled abnormal urine respectively, the long-term imprecision were10.16-14.54(%) and 12.51-16.95(%) for the pooled normal urine and pooled abnormal urine respectively. The limits of quantitation were 0.05-0.16 (μmol/L) for most of steroid metabolites except α-Cortol. The recovery percentages ranged from 90% to 115(%). Conclusions: This method was accurate, precise and can be applied to the routine diagnosis and treatment monitoring of patients with congenital adrenal hyperplasia due to various enzyme defects. Keys words: urinary steroids, GC/MS, abnormal steroidogenesis, method validation *Bệnh viện HN Việt Đức, ** Trường ĐH Y Hà nội, ***Bệnh viện Nhi trung ương Tác giả liên lạc: BS. Trần Thị Ngọc Anh ĐT: 0904395444 Email: ngocanhbm@gmail.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 21 * Số 3 * 2017 74 ĐẶT VẤN ĐỀ Định lượng các sản phẩm chuyển hoá của steroid trong nước tiểu bằng sắc ký khí khối phổ được sử dụng như một tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán nhiều rối loạn sinh tổng hợp và chuyển hoá hormon steroid(4). Kỹ thuật phân tích steroid niệu bằng GC/MS đặc biệt phù hợp với trẻ em vì mẫu nước tiểu không thâm nhập và có độ nhạy, độ đặc hiệu cao(2). Phân tích steroid niệu bằng GC/MS đã được xem như công cụ dùng để chẩn đoán xác định tăng sản thượng thận bẩm sinh (TSTTBS) từ hơn 35 năm qua. GC/MS dùng trong chẩn đoán các rối loạn sinh tổng hợp và chuyển hóa hormon steroid bẩm sinh(1,2,3), và được dùng trong chẩn đoán và theo dõi các bệnh lý mắc phải của tuyến vỏ thượng thận nhưkhối u lành tính hoặc ác tính, hội chứng Cushing(5,6). Hiện tại, ở Việt Nam các trường hợp nghi ngờ TSTTBS được chẩn đoánsơ bộ dựa trên xét nghiệm định lượng 17 hydroxy Progesterone trong máu (17-OHP) bằng phương pháp miễn dịch gắn enzyme (ELISA). Kỹ thuật nàykhông thể loại bỏ hết phản ứng chéo và các yếu tố nhiễu đặc biệt ở trẻ sơ sinh(4). Định lượng 17 OH Progesterone không xác định chính xác nguyên nhân rối loạn tổng hợp steroid như thiếu hụt enzyme 21-hydroxylase, 11β-hydroxylase, 17α -hydroxylase, 20-22 desmolase, 3 β- hydroxysteroid dehydrogenase và 5α-reductase nhưng GC/MS có thể chẩn đoán được nguyên nhân này(7). Những ca bệnh khó thường phải gửi mẫu phân tích ở nước ngoài nên cần nhiều thời gian và kinh phí. Việc áp dụng và triển khai kỹ thuật phân tích định lượng steroid niệu bằng GC/MS tại Việt Nàm là nhu cầu cần thiết và cấp bách. Vì vậy, đề tài này được tiến hành nhằm mục tiêuxây dựng và thẩm định quy trình định lượng steroid niệu bằng phương pháp sắc ký khối phổ tại khoa Hóa sinh – Bệnh viện Nhi Trung ương. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Trang thiết bị và chất liệu nghiên cứu Máy GC/MS (GC 7890A- MS 5975C) của Agilent. Cột sắc ký HP-5MSkích thước 30m x 0,25mm x 0,25 µm (Agilent). Hoá chất: Chuẩn steroid của SKML, các steroid tinh khiếtvà chuẩn nội Androstanol của hãng Sigma Aldrich, enzymeglucuronidase/ sulphatase của hãngKura Biotec (Chi lê). Methoxyamine, Pyridine và Trimethylsilylimmidazol (TMSI), hóa chất cần thiết khác của Merck đều có độ tinh khiết ở mức phân tích. Cột Bond Elut C18 của Agilent và các trang thiết bị khác cho phòng xét nghiệm như máy ly tâm, tủ lạnh, tủ sấy, thiết bị làm khô sử dụng khí ni tơ Bệnh phẩm: Mẫu nước tiểu bình thường được thu thập từ nước tiểu ngẫu nhiên của 10người bình thường không mắc bệnh lý tuyến thượng thận và mẫu nước tiểu bệnh lý được thu thập từ mẫu nước tiểu ngẫu nhiên của 10 bệnh nhân đã chẩn đoán và điều trị tăng sản thượng thận bẩm sinhtại khoa Nội tiết-chuyển hóa –di truyền.Mẫu được bảo quản ở -200C đến khi phân tích. Phương pháp nghiên cứu Quy trình định lượng steroid niệu bằng kỹ thuật GC/MS Chuẩn bị mẫu: Thủy phân các steroid liên hợp trong mẫu nước tiểu cần phân tích bằng enzyme β-glucuronidase/ arylsulfatase ở 370C qua đêm. Các steroid tự do được chiết tách bằng cột Bond- Elut C18. Sau đó tiến hành tạo dẫn xuất: đầu tiên là với methoxyamin ủ 1,5 ±0,5 giờ ở 80oC, sau đó thêm TMSI và ủ 3,5 ± 0,5 giờ ở 110oC để tạo dẫn xuất silyl với tất cả các nhóm –OH. Steroid được chiết tách bằng iso-octan và mẫu thu được dùng để phân tích trên hệ thống GC/MS. Phân tích trên GC/MS được tiến hành trên GC 7890A – MS 5975C (Agilent), cột sắc ký HP- 5MS 30m x 0,25 mm id x 0,25 µm film thickness (Agilent). Mẫu được bơm bằng bộ bơm mẫu tự động Agilent 7693. Chương trình nhiệt độ lò từ 180oC đến 300oC trong vòng 30 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 21 * Số 3 * 2017 Nghiên cứu Y học 75 phút. Tốc độ khí Heli qua cột là 1 ml/ phút. Các steroid rửa giải được phát hiện bằng phổ khối theo phương pháp SIM (selected ion monitoring). Các ion đặc hiệu cho mỗi steroid được lựa chọn để xác định và định lượng mỗi sản phẩm chuyển hóa steroid. Đường chuẩn được xây dựng bằng cách chạy hỗn hợp chất chuẩn chứa một lượng các steroid chuẩn đã biết và chuẩn nội. Chuẩn được phân tích trên GC/MS mỗi khi chạy mẫu thử. Sau khi đường chuẩn được thiết lập cho mỗi steroid cần đo lường, định lượng các steroid trong mẫu thử bằng phần mềm Chemstation. Sử dụng chuẩn nội để hiệu chỉnh sự mất mát trong quá trình chuẩn bị mẫu. Các thực nghiệm thẩm định quy trình kỹ thuật Dựa theo các hướng dẫn của Westgard(9) bao gồm: - Xác định độ chính xác: Xác định độ lặp lại trong một lần chạy (độ chính xác ngắn hạn): phân tích hai mẫu nước tiểu bình thường và bệnh lý lặp lại 20 lần trong một mẻ chạy. Xác định độ tái lặp giữa các lần chạy (độ chính xác dài hạn): phân tích mẫu nước tiểu bình thường và bệnh lý lặp lại trong 20 lần phân tích khác nhau (20 mẻ). Thu thập số liệu tính giá trị trung bình, độ lệch chuẩn, CV% để đánh giá độ chính xác ngắn hạn và dài hạn. - Xác định giới hạn định lượng: Tiến hành pha loãngmẫu chuẩn steroid2, 4, 8, 16và 32 lần. Mỗi mẫu được đo lặp lại 7 lần trong một lần phân tích. Thu thập số liệu, tính giá trị trung bình, SD, CV% và xác định giới hạn định lượng cho từng chất. - Xác định độ thu hồi: Sử dụng nước tiểu bình thường chia làm 2 mẫux 2ml, mẫu 1 thêm 0,1 ml dung dịch chuẩn. Mẫu 2thêm0,1 ml nước cất. Tiến hành phân tích steroid niệu bằng GC/MS ở hai mẫu trên. Độ thu hồi tương đối được tính dựa vào lượng mẫu chuẩn thêm vào đã biết so với mẫu nước cất với nồng độ sản phẩm chuyển hóa đo được trong mẫu phân tích giữa hai mẫu trên. Các vật liệu ngoại kiểm steroid được phân tích đồng thời để so sánh với giá trị trung vị và độ lệch chuẩn của tất cả các phòng xét nghiệm tham gia chương trình ngoại kiểm giúp so sánh phương pháp, đánh giá độ đúng của phương pháp. KẾT QUẢ Thông số SIM 11 sản phẩm chuyển hoá steroid được trình bày theo thứ tự xuất hiện trên sắc ký đồ theo trình tự thời gian lưu tăng dần. Chương trình chạy sắc ký 30 phút/mẫu. Bảng 1: Thông số thời gian lưu, ion định lượng, ion đích. Số TT Tên viêt tắt Tên đầy đủ Thời gian lưu (phút) Ion định lượng (m/z) Ion đích (m/z) A1 A1 Androstanol 13,443 243 258 1 A Androsterone 17,075 270 360 2 E Etiocholanolone 17,278 270 360 3 PD Pregnandiol 20,592 269 284 4 PT Pregnantriol 21.020 435 255 5 THE Tetrahydrocortisone 23,556 488 578 6 THF Tetrahydrocortisol 24,037 562 472 7 Allo-THF Allo-Tetrahydrocortisol 24,172 562 472 8 α-Cortolone 24,501 449 359 9 β-Cortol 24,623 445 343 10 β-Cortolone 24,937 449 359 11 α-Cortol 25,227 445 343 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 21 * Số 3 * 2017 76 Kết quả sắc ký đồ (hình 1) cho thấy nội chuẩn A1 (Androstanol) có thời gian lưu là 13,44 phút. Mỗi steroid tương ứng với một đỉnh, 11 steroid trình bày trong bài báogồm: 1- Androsterone (A), 2-Etiocholanolone (E), 3- Prengandiol (PD), 4-Pregnantriol (PT), 5- Tetrahydrocortisone (THE), 6- Tetrahydrocortisol (THF), 7-Allo tetrahydrocortisol (Allo-THF), 8-α-Cortolone, 9- β-Cortol, 10-β-Cortolone, 11-α-Cortol. Hình 1: Sắc ký đồ tổng số của mẫu chuẩn phân tích. Độ chính xác của phương pháp Bảng 2: Độ chính xác ngắn hạn của phương pháp. Sản phẩm chuyển hóa Mẫu bình thường Mẫu bệnh lý X (µmol/L) SD (µmol/L) CV (%) X (µmol/L) SD (µmol/L) CV (%) A 1,25 0,096 7,72 18,44 1,695 9,2 E 1,50 0,098 6,53 12,63 1,091 8,64 PD 2,31 0,06 2,72 2,61 0,093 3,54 PT 1,49 0,015 1,01 86,87 0,677 0,78 THE 7,47 0,314 4,2 22,33 1,362 6,1 THF 2,87 0,107 3,72 6,15 0,355 5,8 Allo-THF 3,03 0,132 4,34 8,02 0,459 5,7 α-Cortolone 3,13 0,051 1,62 4,42 0,090 2,04 β-Cortol 1,22 0,053 2,82 1,23 0,041 3,33 β-Cortolone 2,13 0,045 2,11 3,16 0,075 2,36 α-Cortol 0,49 0,030 6,12 0,80 0,031 3,95 Nhận xét: độ chính xác ngắn hạn của các steroid có CV từ 1,01 - 7,72(%) ở mẫu mẫu nước tiểu bình thường và CVtừ 0,78- 9,2(%) ở mẫu nước tiểu bệnh lý. Giá trị trung bình ± SD của CV ở mẫu bình thường là4,0 ± 2,2(%) và mẫu bệnh lý là 4,7 ± 2,7(%) ( X ± SD). Nhận xét (bảng 3): Độ chính xác dài hạn của các steroid có CV 10,16 - 14,53(%) ở mẫu nước tiểu bình thường và 12,51 – 16,95(%) ở mẫu nước tiểu bệnh lý.Giá trị trung bình± SD của CV ở mẫu bình thường là 12,85 ± 1,24(%) và mẫu bệnh lý là 14,86± 1,4 (%) ( X ± SD). Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 21 * Số 3 * 2017 Nghiên cứu Y học 77 Bảng 3: Độ chính xác dài hạn của phương pháp. Sản phẩm chuyển hóa Mẫubình thường Mẫubệnh lý X (µmol/L) SD (µmol/L) CV (%) X (µmol/L) SD (µmol/L) CV (%) A 1,23 0,15 12,55 15,00 2,44 16,26 E 1,48 0,18 11,87 10,14 1,61 15,91 PD 2,42 0,34 14,04 2,50 0,35 14,13 PT 1,72 0,23 13,61 89,33 11,17 12,51 THE 8,08 1,04 12,9 22,96 3,68 16,01 THF 3,14 0,32 10,16 6,34 0,87 13,7 Allo-THF 3,46 0,48 13,81 8,48 1,23 14,53 α-Cortolone 3,36 0,40 11,83 5,19 0,78 15,7 β-Cortol 1,39 0,20 14,53 1,47 0,22 15,26 β-Cortolone 2,37 0,30 12,65 3,56 0,47 13,14 α-Cortol 0,58 0,08 13,37 0,85 0,14 16,95 Độ thu hồi của phương pháp Bảng 4: Độ thu hồi của phương pháp. Sản phẩm chuyển hóa Lượng thu hồi μmol/L Lượng thêm vào μmol/L % thu hồi A 1,21 1,184 102,2 E 0,78 0,68 114,71 PD 0,06 0,06 100,0 PT 0,41 0,404 101,49 THE 1,42 1,26 112,7 THF 0,91 0,826 110,17 Allo-THF 0,88 0,828 106,28 α-Cortolone 0,40 0,438 91,32 β-Cortol 0,47 0,512 91,8 β-Cortolone 0,35 0,352 99,43 α-Cortol 0,12 0,132 90,91 Nhận xét: Độ thu hồi các sản phẩm chuyển hóa steroid niệu từ 90% đến 115%. Trung bình là 101,9 ± 8,4% ( X ± SD). Bảng 5: Giới hạn định lượng của phương pháp. Sản phẩm chuyển hóa Giới hạn định lượng (μmol/L) CV(%) A 0,11 13,18 E 0,05 10,69 PD 0,07 14,64 PT 0,07 16,86 THE 0,16 11,28 THF 0,11 18,43 Allo-THF 0,11 18,07 α-Cortolone 0,09 8,32 β-Cortol 0,11 15,16 β-Cortolone 0,06 10,9 α-Cortol 0,27 13,09 Nhận xét: Giới hạn định lượng của phần lớn các chất từ 0,05 đến 0,16(µmol/L), riêng α-Cortol là 0,27(µmol/L). BÀN LUẬN Phân tích steroid niệu giúp chẩn đoán bệnh lý rối loạn sinh tổng hợp và chuyển hóa hormon steroid được thực hiện từ những năm 1960(4). Tuy nhiên, kỹ thuật sắc ký khí khối phổ sử dụng ion chọn lọc (GC/MS-SIM) được sử dụng những năm gần đây nhằm phân tích các sản phẩm chuyển hóa của hormon steroid và tiền chất của các hormon đó. Rất nhiều sản phẩm chuyển hóa của hormon và tiền chất trong nước tiểu được phát hiện, đến nay có hơn 100 sản phẩm được công bố. Tuy nhiên, chỉ có một số sản phẩm chuyển hóa quan trọng cần được định lượng nhằm chẩn đoán các nhóm bệnh lý rối loạn chuyển hóa steroid riêng biệt. Quy trình định lượng steroid niệu khác nhau tùy theo từng tác giả đã công bố về cách thức tiến hành, thời gian và nhiệt độ tạo dẫn xuất(1,2,6,8). Chúng tôi đã thực hiện và thay đổi các điều kiện sao cho phù hợp với phòng xét nghiệm để đạt được kết quả tốt nhất.Quy trình sau khi xác định là phù hợp được tiến hành thẩm định: xác định độ chính xác, giới hạn định lượng và độthu hồi nhằm đánh giá sai số ngẫu nhiên và sai số hệ thống. Bảng 1 cho thấy các sản phẩm chuyển hóa steroid được định lượng có giá trị CV trong một lần chạy 1,01-7,72 (%) ở mẫu nước tiểu bình thường và 0,78-9,2(%) ở mẫu bệnh lý. Trong khi ở bảng 2 cho thấy CV đạt 10,16-14,53 (%) và 12,51-16,95 (%) ở mẫu bình thường và bệnh lý Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 21 * Số 3 * 2017 78 tương ứng khi thực hiện ở 20 lần chạy khác nhau. Theo tác giả Angel O.K Chan, khi xây dựng giá trị tham chiếu steroid niệu bằng GC/MS tại Hồng Kông đã công bố độ chính xác trong một lần chạy và giữa các lần chạy là 1,3- 11,9(%) và 1,3-13,3(%)(2). Keiko Homma công bố độ lặp lại trong một lần chạy ở mẫu nước tiểu tổng hợp là 11 ± 6%(3). Như vậy độ chính xác trong một lần chạy là tương tự độ lặp lại trong nghiên cứu của Angel và tốt hơn của Homma. Độ chính xác qua nhiều lần chạy trong nghiên cứu này không được tốt bằng nghiên cứu của Angel. Tuy nhiên, so với tiêu chuẩn về độ chính xác chấp nhận được cho kỹ thuật phân tích steroid niệu là CV ≤ 25% thì độ chính xác của phương pháp được thẩm định trong nghiên cứu này hoàn toàn có thể chấp nhận được(4). Bảng 3 cho thấy tỷ lệ % độ thu hồi tương đối của các sản phẩm chuyển hóa steroid niệu trong khoảng 90-115 (%). Tác giả Keiko Homma khi tiến hành xây dựng giá trị tham chiếu cho trẻ sơ sinh tại Nhật Bản công bố công bố tỷ lệ thu hồi các sản phẩm steroid niệu là 103 ± 12(%)tương tự kết quả của chúng tôi 101,9 ± 8,4(%)(3). Bảng 4 cho thấy giới hạn định lượng của các sản phẩm chuyển hóa steroid niệu là rất tốt với phần lớn các chất, giới hạn này thấp hơn 0,16µmol/L với các chất aldosterone, etiocholanolone, pregnandiol, pregnantriol, tetrahydrocortisone và tetrahydrocortisol, cortolone. Riêng α-Cortol có giới hạn định lượng là 0,27µmol/L. Giới hạn định lượng này cho phép xác định các sản phẩm chuyển hóa steroid niệu chính xác ngay cả với mẫu nước tiểu trẻ sơ sinh rất loãng. Kết quả ngoại kiểm chỉ mới được thực hiện từ tháng 4/2016, đến nay có 4 kết quả phản hồi nên chưa đủ dữ liệu để tiến hành so sánh, đánh giá độ xác thực của phương pháp(8). Tuy vậy, kết quả độ thu hồi có thể sử dụng như một phương pháp thay thế để đánh giá độ xác thực của phương pháp khi chưa thể thực hiện so sánh phương pháp (4). KẾT LUẬN Các thực nghiệm thẩm định quy trình kỹ thuật định lượng các sản phẩm chuyển hóa steroid niệu bằng sắc ký khí khối phổ cho thấy phương pháp được thực hiện có kết quả chính xác và xác thực, có thể sử dụng trong chẩn đoán và theo dõi điều trị các rối loạn chuyển hoá và sinh tổng hợp steroid. Lời cảm ơn: Chúng tôi xin cảm ơn TS. Ronda Greaaves đã hỗ trợ kỹ thuật, APFCB đã cung cấp kinh phí cho việc thực hiện đề tài, Ban Giám đốc Bệnh viện Nhi Trung ương đã cho phép triển khai đề tài. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Caulfield MP, Lynn T, Gottschalk ME et al (2002). The diagnosis of congenital adrenal hyperplasia in the newborn by Gas Chromatography/Mass Spectrometry analysis of random urine specimens. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism 87, pp. 3682-3690. 2. Chan AO, Shek CC (2012). Urinary steroid profiling in the diagnosis of congenital adrenal hyperplasia and disorders of sex development: Experience of a urinary steroid referral centre in Hong Kong. Clinical Biochemistry 46: pp. 327-334. 3. Homma K, Hasegawa T, Masumoto M, Takeshita E, Wantanabe K et al (2003). Reference values for urinary steroids in Japanese newborn infants: Gas chromatography/Mass spectrometry in selected ion monitoring, Endocrine Journal, 50: pp. 783-792. 4. Honour J.W (1997). Steroid profiling. Ann Clin Biochem 34: pp. 32-44. 5. Krone N, Beverly AH, Gareth GL, Paul MS, Arlt W and Shackleton CHL (2010). Gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS) remains a preeminent discovery tool in clinical steroid investigations even in the era of fast liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC/MS/MS). J Steroid Biochem Mol Biol 121, pp. 496-504. 6. Kerkhofs.T.M.A, Kestens.M.N, Kema.I.P, vWillems.T.P, Haak.H.R (2015). Diagnosis value of urine steroid profiling in the evaluation of adrenal tumor, Hormone Cancer 6: pp. 168-175. 7. New MI, Oksana L, Karen LS, Alan P et al (2013). Congenital Adrenal Hyperplasia, Genetic Steroid Disorders,Elsevier, San Diego, CA. 8. Philips IJ, Conway EM, Hodkinson RA and Honour JW (2004). External quality assessment of urinary steroid profile analysis. Ann Clin Biochem 41: pp. 474-478. 9. Westgard JO (1999).Basic Method Validation, Training in analytical quality management for healthcare laboratories, Westgard Quality Corporation: pp. 104-121. Ngày nhận bài báo: 28/11/2016 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 29/11/2016 Ngày bài báo được đăng: 15/05/2017