Thẩm định phương pháp định lượng chì máu bằng quang phổ hấp thụ nguyên tử

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 3 * 2018 190 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CHÌ MÁU BẰNG QUANG PHỔ HẤP THỤ NGUYÊN TỬ Trần Thị Chi Mai*, Vũ Thị Tú Uyên**, Nguyễn Thị Huệ**, Vi Mai Lan*** TÓM TẮT Mở đầu: Định lượng chì trong máu toàn phần được chấp nhận rộng rãi như một công cụ hữu ích trong sàng lọc và chẩn đoán và theo dõi điều trị ngộ độc chì. Mục tiêu: Xây dựng và thẩm định kỹ thuật định lượng trực tiếp chì máu bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử sử dụng lò điện (GFAAS). Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, khoảng tuyến tính, độ chụm, độ chính xác của phương pháp được đánh giá. Kết quả: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp tương ứng là 0,0217 µmol/L và 0,0724 µmol/L. Khoảng tuyến tính của phương pháp là 0,1- 4 mol/L. Độ lặp lại ở 3 mức nồng độ 0,223; 0,876 và 1,77 (mol/L) lần lượt là 1,93, 1,31 và 1,88 (%). Độ tái lặp ở ba mức nồng độ trên lần lượt là 11,1, 4,18 và 4,96 (%). Độ thu hồi của mẫu QC nằm trong giới hạn cho phép. Độ thu hồi mẫu thật thêm chuẩn là 93,6% và 97,4%, nằm trong khoảng 80- 110%; đạt tiêu chuẩn AOAC 2012. Kết luận: Phương pháp định lượng chì máu xây dựng tại phòng xét nghiệm bằng quang phổ hấp thụ nguyên tử là chính xác và tin cậy, có thể sử dụng trong chẩn đoán và theo dõi ngộ độc chì. Từ khoá: Ngộ độc chì, định lượng chì máu, quang phổ hấp thụ nguyên tử sử dụng lò điện. ABSTRACT VALIDATION OF BLOOD LEAD MEASUREMENT BY GRAPHITE FURNACE ATOMIC ABSORPTION SPECTROPHOTOMETRY Tran Thi Chi Mai, Vu Thi Tu Uyen, Nguyen Thi Hue, Vi Mai Lan * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 22 - No 3- 2018: 190 - 195 Background: Whole blood lead measurement has gained wide acceptance as the most useful tool for screening, diagnostic testing and treatment monitoring of lead poisoning. Objectives: The aim of this study was to develop and validate the blood lead quantitation method by graphite furnace atomic absorption spectrophotometry. Method: The limit of detection, limit of quantitation, linear range, precision and accuracy of the blood lead quantitation by GFAAS were evaluated. Results: The LOD and LOQ of this method were 0.0217 µmol/L and 0.0724 µmol/L respectively. The method linearity was from 0.1 to 4 (mol/L). The repeatability at the concentrations of 0,223; 0,876 và 1,77 (mol/L) were 1.93, 1.31 và 1.88 (%) respectively. The reproducibility at the three concentrations above were 11.1, 4.18 và 4.96 (%). respectively. The recovery of three QC levels fell into the acceptable ranges. The recovery of spiked samples were 93.6% and 97.4%, fell in range of 80- 110%; acceptable following the AOAC 2012 criteria. Conclusion: The developed direct method for blood lead quantitation by GFAAS was accurate and precise, can be used for diagnosis and treatment monitoring of lead poisoning. * Trường Đại học Y Hà Nội ** Bệnh viện Nhi Trung Ương *** Công ty CP TB-VT KHKT và DL Trung sơn T.S.S.E Tác giả liên lạc: TS.BS. Trần Thi Chi Mai, ĐT: 0934220994 Email: tranchimai@hmu.edu.vn Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 3 * 2018 Nghiên cứu Y học 191 Key words: Lead poisoning, lead blood measurement, graphite furnace atomic absorption spectrophotometry. ĐẶT VẤN ĐỀ Chì và các hợp chất của chì được sử dụng trong rất nhiều lĩnh vực như công nghiệp, y học, quân sự, năng lượng nguyên tử, kĩ thuật hạt nhân. Song song với những lợi ích mà chì mang lại thì nó luôn là một mối đe dọa môi trường nghiêm trọng đến sức khỏe con người, đặc biệt ở các đô thị lớn. Ảnh hưởng đáng lo ngại nhất là sự tác động của chì đến sự phát triển trí tuệ và sự phát triển của thế hệ trẻ – tương lai của xã hội. Tổ chức Y tế thế giới ước tính ngộ độc chì là nguyên nhân bệnh tật cho 13,9 triệu người năm 2012 và gây chậm phát triển tinh thần mức nhẹ đến trung bình cho 0,6 triệu trẻ em hàng năm(6,13). Tại các nước đang phát triển, phơi nhiễm chì chủ yếu liên quan đến các hoạt động nghề nghiệp như luyện kim, khai thác mỏ hoặc tái chế. Một nghiên cứu gần đây về nồng độ chì máu và các yếu tố nguy cơ phơi nhiễm chì ở trẻ em tại thành phố Hồ Chí Minh cho thấy tỷ lệ trẻ có nồng độ chì máu cao là 7,1%; tương đương với các nước khu vực Đông Nam Á(5). Tuy nhiên, mức độ chì máu cao ở trẻ em không đồng đều ở các vùng trong cả nước. Đáng lưu ý là hầu hết trẻ em sống ở vùng tái chế chì có nồng độ chì máu cao vượt ngưỡng cho phép và có tới 28% trẻ nồng độ chì máu ≥ 45 g/dL(3). Kết quả sàng lọc ngộ độc chì ở trẻ em đến khám và điều trị tại Bệnh viện Nhi trung ương trong 6 năm cho thấy ngộ độc chì không hiếm gặp (kết quả chưa công bố). Triệu chứng lâm sàng của ngộ độc chì có thể khó phát hiện khi không có bệnh sử rõ ràng phơi nhiễm chì; ngộ độc chì có thể không có triệu chứng; triệu chứng nếu có thường không đặc hiệu. Vì vậy xét nghiệm là thăm dò tin cậy để chẩn đoán ngộ độc chì và đóng vai trò cốt lõi trong xác định và quản lý ngộ độc chì, trong đánh giá phơi nhiễm nghề nghiệp hay phơi nhiễm môi trường với chì(12). Hiện nay, đánh giá ngộ độc chì chủ yếu là định lượng chì trong máu toàn phần. Mặc dù định lượng chì trong các mô và dịch cơ thể như tóc, răng, xương, nước tiểu cũng phản ánh phơi nhiễm chì, nhưng nồng độ chì trong máu toàn phần được chấp nhận rộng rãi như một công cụ hữu ích trong sàng lọc và chẩn đoán ngộ độc chì(2,8). Có nhiều phương pháp định lượng chì trong máu như quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS), đo điện thế (AVS) và phổ khối (ICP-MS). Hiện nay phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử sử dụng lò điện (Graphite furnace atomic absorption spectrometry) là phương pháp hay dùng nhất để định lượng chì trong máu(12). Mục tiêu nghiên cứu của đề tài là xây dựng và thẩm định kỹ thuật định lượng trực tiếp chì máu bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử sử dụng lò điện (GFAAS). ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nghiên cứu được tiến hành tại Khoa Hóa sinh- Bệnh viện Nhi trung ương, từ tháng 11- 02/2018. Trang thiết bị và hóa chất - Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AA- 7000 với lò điện GFA-7000 và bộ hút mẫu tự động ASC-7000 của Shimadzu. - Dung dịch chuẩn Pb 1g/L, axit nitric đặc 65% của Merck, Triton X-100 và Ammoni dihydro phosphate của Sigma-Aldrich. Khí Argon 99,999%, nước khử ion. - Mẫu đối chứng Whole blood control- ClinCheck 3 mức của Recipe. Mẫu máu toàn phần của bệnh nhân có nồng độ chì thấp. Nguyên lý kỹ thuật phương pháp định lượng chì bằng quang phổ hấp thụ nguyên tử sử dụng lò điện: Một lượng nhỏ mẫu được hóa hơi và nguyên tử hóa ở nhiệt độ cao trong ống graphit. Các nguyên tử chì tự do sinh ra trong ống graphit hấp thụ tia sáng đơn sắc từ đèn catot rỗng tạo thành phổ hấp thụ nguyên tử và được xác định bởi detector nhân quang điện. Việc định lượng chì trong mẫu được thực hiện với một đường chuẩn xây dựng từ một dãy dung dịch chuẩn được chuẩn bị song song với Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 3 * 2018 192 mỗi mẻ mẫu. Mẫu bệnh phẩm Máu toàn phần tĩnh mạch của bệnh nhân nghi ngờ ngộ độc chì được thu thập trong ống chống đông EDTA. Quy trình kỹ thuật Điều kiện phân tích trên thiết bị AA-7000 được trình bày trong Bảng 1 và Bảng 2. Bảng 1. Điều kiện phân tích trên AA-7000 Điều kiện Cường độ dòng đèn catot rỗng Pb 10 mA Độ rộng khe đo 0,7 nm Chế độ bổ chính nền BGC-D2 Ống graphit Pyrolysis graphite tube Thể tích tiêm mẫu 10 µL Bảng 2. Chương trình lò điện Giai đoạn Nhiệt độ Thời gian (giây) Phương pháp gia nhiệt Tốc độ dòng khí (ml/phút) 1 60 3 RAMP 0,1 2 120 20 RAMP 0,1 3 250 10 RAMP 0,1 4 700 10 RAMP 1 5 700 10 STEP 1 6 700 3 STEP 0 7 2000 3 STEP 0 8 2500 2 STEP 1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn và mẫu đo Mẫu chuẩn, mẫu chứng và máu toàn phần được pha loãng 10 lần trong dung dịch 0,5% Triton X-100; 0,2% NH4H2PO4 và 0,2% HNO3 (v/v) trong nước khử ion (dung dịch cải biến nền mẫu). Các dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ Pb 0,1; 0,2; 0,5; 1; 2; 3 µmol/L pha trong axit HNO3 1%. Các dung dịch chuẩn dựng đường chuẩn và mẫu đo được chuẩn bị bằng cách trộn 50 µL dung dịch chuẩn làm việc hoặc mẫu với 450 µL dung dịch pha loãng (pha loãng 10 lần). Thẩm định phương pháp Các thông số thẩm định được áp dụng theo hướng dẫn của AOAC 2012(4). Giới hạn phát hiện (Limit of detection - LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp Sử dụng mẫu bệnh nhân có nồng độ chì rất thấp (nhỏ hơn LOD dự kiến), thêm dung dịch chuẩn chì với nồng độ 0,1 µmol/L (nồng độ thấp nhất của dãy dung dịch chuẩn ). Chuẩn bị 10 lần mẫu độc lập theo qui trình pha loãng trên. Tính giá trị trung bình, SD. Xác định LOD và LOQ: LOD = 3SD và LOQ= 10SD (SD = độ lệch chuẩn của mẫu thêm chuẩn). Khoảng tuyến tính của phương pháp Chuẩn bị dung dịch làm việc có nồng độ Pb 0,1; 0,2; 0,5; 1; 2; 3; 4, 5 mol/L, sau đó pha loãng theo tỉ lệ 1:10 trong dung dịch pha loãng. Tiến hành đo lặp lại mỗi dung dịch 3 lần. Tính giá trị trung bình của mỗi nồng độ. Sử dụng phương pháp phân tích hồi quy đa thức bằng phần mền Lincheker của Phillipe Marquis để đánh giá xem khoảng giá trị đánh giá có tuyến tính hay không. Phân tích hồi quy đa biến bằng phần mềm sẽ cho biết phương trình tương quan giữa nồng độ đo được Y với giá trị mong đợi x. Nếu phương trình tương quan là phương trình hồi quy bậc 1 thì phương pháp là tuyến tính(11). Đánh giá độ chụm (Precision) Tiến hành đánh giá độ lặp lại (repeatability) và độ tái lặp (intermediate repeatability). Sử dụng mẫu QC 3 mức nồng độ QC1, QC2, QC3. Độ lặp lại: Mỗi mức nồng độ chuẩn bị 10 lọ mẫu. Tiến hành phân tích trong cùng một mẻ. Độ tái lặp: Mỗi mức nồng độ chuẩn bị 10 lọ mẫu. Tiến hành phân tích trong 10 ngày khác nhau (10 mẻ). Tính TB, SD, độ lệch chuẩn tương đối (RSD hay CV) tại mỗi nồng độ. Độ lệch chuẩn tương đối được so sánh với tiêu chuẩn cho phép của AOAC 2012. Đánh giá độ chính xác (Accuracy) Độ chính xác của phương pháp được xác định bằng độ thu hồi của mẫu QC mức 1, 2, 3 và độ thu hồi của mẫu bệnh nhân thêm chuẩn. Mỗi nồng độ chuẩn bị 10 mẫu đo. Độ thu hồi thêm chuẩn được tính theo công thức sau: % thu hồi = (Cs – C) x 100/Ca ; Trong đó: Cs là nồng độ đo được trong mẫu thêm chuẩn, C là nồng độ đo được trong mẫu không thêm chuẩn, Ca là Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 3 * 2018 Nghiên cứu Y học 193 nồng độ chuẩn thêm vào. Độ thu hồi được so sánh với tiêu chuẩn của AOAC 2011. KẾT QUẢ Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp Bảng 3. Kết quả xác định LOD và LOQ của phương pháp Nồng độ chì Pb (µmol/L) Trung bình (n = 10) 0,0904 SD 0,0072 LOD 0,0217 LOQ 0,0724 R = Trung bình/LOD 4,2 Giá trị R đánh giá LOD tính được là 4,2 nằm trong khoảng 4 – 10(9), như vậy nồng độ Pb được lựa chọn để đánh giá (0,1 µmol/L) là phù hợp. Phương pháp phân tích chì trong máu theo qui trình đưa ra trên có giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng tương ứng là 0,0217 µmol/L và 0,0724 µmol/L. Khoảng tuyến tính của phương pháp Bảng 4. Đánh giá khoảng tuyến tính của phương pháp Mẫu Lần chạy 1 Lần chạy 2 Lần chạy 3 Trung bình (y) Giá trị mong đợi (x) 1 0,093 0,093 0,093 0,09475 0,1 2 0,219 0,193 0,198 0,2025 0,2 3 0,513 0,498 0,51 0,50525 0,5 4 1,015 1,012 0,992 1,00475 1 5 1,927 2,042 1,999 1,992 2 6 2,991 2,982 3,009 2,9955 3 7 3,994 3,9 3,919 3,95325 4 Độ dốc a 0,9874 Giao điêm b 0,009543 Phương trình tương quan Y=0,9874x +0,009543 Nhận xét: Khoảng tuyến tính của phương pháp là 0,1- 4 mol/L, phương trình tương quan là y= 0,9874 x + 0,009543. Độ chụm của phương pháp Theo tiêu chuẩn đánh giá của AOAC, đối với nồng độ chất phân tích trong khoảng 100 – 1000 µg/L thì CV cho phép là 11 – 15%. Ba mẫu phân tích trong thí nghiệm này có nồng độ chì trong khoảng 54 – 425 µg/L, như vậy độ lặp và độ tái lặp thu được trong bảng trên là chấp nhận được. Bảng 5. Đánh giá độ chụm của phương pháp Mẫu QC1 QC2 QC3 Độ lặp lại (n=10) Trung bình (µmol/L) 0,223 0,876 1,77 SD 0,0043 0,0115 0,033 CV (%) 1,93 1,31 1,88 Độ tái lặp (n=10) Trung bình (µmol/L) 0,251 0,981 1,87 SD 0,028 0,041 0,092 CV (%) 11,1 4,18 4,96 Độ chính xác của phương pháp P b ( u m o l/ L ) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0 5 10 QC 1 n 0 0.25 0.5 0.75 1 1.25 1.5 0 5 10 P b ( u m o l/ L ) QC 2 n Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 3 * 2018 194 P b ( u m o l/ L ) 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 0 5 10 QC 3 n Hình 1. Độ thu hồi mẫu QC Giá trị đo được Linear (Trung bình của mẫu QC) Linear (Giới hạn trên mẫu QC) Linear (Giới hạn dưới của mẫu QC) Bảng 6. Độ thu hồi mẫu QC Mẫu QC Nồng độ TB đo được (µmol/L) CV Nồng độ mẫu QC Trung bình (µmol/L) Khoảng cho phép (µmol/L) QC 1 0,251 11,1 0,263 0,210 – 0,315 QC 2 0,981 4,18 1,06 0,847 – 1,27 QC 3 1,87 4,96 2,05 1,64 – 2,46 Kết quả phân tích cho thấy nồng độ chì trung bình đo được khá sát với giá trị trung bình đưa ra của mẫu QC (Bảng 6), các giá trị đo được đều nằm trong khoảng giới han cho phép (Hình 1). Độ chụm của các kết quả đo cũng đạt tiêu chuẩn giới hạn chấp nhận theo AOAC. Bảng 7. Độ thu hồi mẫu thêm chuẩn Thông số Mức 1 Mức 2 Nồng độ Pb thêm chuẩn (µmol/L) 0,600 2,00 Nồng độ Pb trung bình đo được trong mẫu thêm chuẩn (n = 10) (µmol/L) 0,561 1,95 CV (%) 1,42 0,74 Độ thu hồi trung bình (%) 93,6 97,4 Tiêu chuẩn AOAC (%) 80 – 110 Độ thu hồi mẫu thêm chuẩn đo được của cả hai mức nồng độ đều nằm trong khoảng cho phép theo tiêu chuẩn AOAC. BÀN LUẬN Định lượng chì máu được khuyến cáo là xét nghiệm sàng lọc và chẩn đoán, theo dõi điều trị ngộ độc chì. Hai phương pháp định lượng chì máu hay được sử dụng là quang phổ hấp thụ nguyên tử sử dụng lò điện (GFAAS) và đo điện thế (ASV), trong đó GFAAS là phương pháp hay được sử dụng nhất. Hiện tại Khoa Sinh hoá Bệnh viện Nhi trung ương có máy định lượng chì máu Leadcare II với nguyên lý kỹ thuật là ASV. Tuy nhiên dải đo của máy là từ 0.159 - 3,14 mol/L (3,3 - 65 g/dL)(7) và máy chỉ sử dụng với mục đích sàng lọc nên cần thiết phải có một phương pháp định lượng chính xác nồng độ chì máu khi bệnh nhân có nồng độ chì máu cao. Chính vì vậy phương pháp định lượng chì máu bằng quang phổ hấp thụ nguyên tử sử dụng lò điện đã được xây dựng. Kết quả thẩm định cho thấy độ chụm của phương pháp đạt tiêu chuẩn của AOAC 2011(4). Khi so sánh với các nghiên cứu định lượng chì máu bằng GFAAS, độ chụm của nghiên cứu này là tương tự(1,7,9). Đặc biệt độ lặp lại và độ tái lặp trong phương pháp của chúng tôi còn cho thấy tốt hơn các nghiên cứu này ở mức nồng độ chì thấp (0,223 mol/L). Độ chụm của phương pháp này tốt hơn hẳn công bố của nhà sản xuất với phương pháp ASV trên máy Leadcare II(7). Do không có các vật liệu tham chiếu, trong nghiên cứu này độ chính xác của phương pháp được đánh giá thông qua độ thu hồi. Độ thu hồi cho thấy phương pháp có độ chính xác cao. Ở cả 3 mức nồng độ thấp, trung gian và cao của đường chuẩn, độ thu hồi đều nằm trong giới hạn cho phép. Kết quả này tương đồng với kết quả đánh giá độ thu hồi của phương pháp định lượng chì trong máu và trong huyết thanh của một số nghiên cứu đã công bố(1,3). Giới hạn định lượng của phương pháp là 0,072 µmol/L. Khoảng tuyến tính của đường chuẩn phương pháp là từ 0,1 đến 5 µmol/L. Khoảng tuyến tính này rộng hơn khoảng tuyến tính của máy Leadcare II. Hơn nữa, việc đo Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 3 * 2018 Nghiên cứu Y học 195 lường chì bằng phương pháp GFAAS còn cho phép pha loãng mẫu khi nồng độ vượt quá giới hạn khoảng tuyến tính, do vậy khoảng báo cáo kết quả rộng, thích hợp cho việc theo dõi kết quả điều trị ngộ độc chì. KẾT LUẬN Nghiên cứu cho thấy phương pháp định lượng chì máu bằng quang phổ hấp thụ nguyên tử xây dựng tại phòng xét nghiệm là chính xác và tin cậy, có thể sử dụng trong chẩn đoán và theo dõi ngộ độc chì. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Andrada D, Pinto FG, Magalhaes CG et al (2006). Direct determination of lead in human urine and serum samples by electrothermal atomic absorption spectrometry and permanent modifiers. J Braz Chem Soc, 17(2): 328-332. 2. Barbosa F (2005). A critical review of biomarkers used for monitoring human exposure to lead: advantages, limitations and future needs. Environmental Health Perspectives, 113: 1669- 1674. 3. Croteau GA, Beaudet NJ, Bao ND (2015). Childhood lead exposure from battery recycling in Vietnam. BioMed Res Int, 193715. doi: 10.1155/2015/193715. 4. Guidelines for Collaborative Study Procedures to Validate Characteristics of a Method of Analysis (2012). Official Methods of Analysis, Appendix D. AOAC INTERNATIONAL, Gaithersburg, MD 5. Havens D, Pham MH, Karr CJ, Daniell WE (2018). Blood Lead Levels and Risk Factors for Lead Exposure in a Pediatric Population in Ho Chi Minh City, Vietnam. Int J Environ Res Public Health, 15(1): 93. 6. Landrigan P, Fuller R, Acosta NJ, Adeyi O, Arnold R, Basu N, Baldé A, Bertollini R, Bose-O’Reilly S, Boufford J, et al (2017). The lancet commission on pollution and health. Lancet, 391(10119):462-512. 7. Magellan Diagnostics, Inc (2016). Lead Care II Package Insert. Magellan Diagnostics, Inc. North Billerica, MA, USA:.[(accessed on 4 March 2018)]. Available online: 480f-9586-128f1dbc568f/80-0-052-Package-Insert,-LeadCare-II- Test-Kit-v109-Rev02.pdf.aspx. 8. Parson PJ (2001). C40-A: Analytical procedures for the determination of lead in blood and urine; approved guideline. Wayne, PA, National Committee for Clinical Laboratory Standards. 9. Parson PJ, Slavin W (1993). A rapid Zeeman graphite furnace atomic absorption spectrometric method for the determination of lead in blood. Spectrochim Acta, 48B: 925-39. 10. Viện KN VSANTPQG (2010). Thẩm định phương pháp phân tích hóa học và vi sinh vật. 11. Westgard JO (2009). Basic method validation, 3rd edition. Westgard QC, Inc. 12. World Health Organization (2011). Brief guide to analytical methods for measuring lead in blood. IOMC. 13. World Health Organization. International Programme on Chemical Safety The Public Health Impact of Chemical: Knowns and Unknowns. [(accessed on 4 March 2018)], _PHE_EPE_16.01_eng.pdf Ngày nhận bài báo: 17/12/2017 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 09/02/2018 Ngày bài được đăng: 10/05/2018