Tạo que thử phát hiện nhanh Vibrio cholerae trong nguồn nước sinh hoạt - Trần Thị Thanh Quỳnh

Hóa học & Kỹ thuật môi trường T.T.T. Quỳnh, , N.T.T. Thư, “Tạo que thử phát hiện nhanh nguồn nước sinh hoạt.” 146 TẠO QUE THỬ PHÁT HIỆN NHANH Vibrio cholerae TRONG NGUỒN NƯỚC SINH HOẠT Trần Thị Thanh Quỳnh1*, Phạm Kiên Cường1, Nguyễn Khánh Hoàng Việt1, Phan Tuấn Nghĩa2, Nguyễn Thị Tâm Thư1 Tóm tắt: Vibrio cholerae là một trong những tác nhân phổ biến gây bệnh nhiễm trùng tiêu chảy cấp hay còn gọi là bệnh tả. Vi khuẩn này lây lan nhanh chóng thông qua nguồn nước và thức ăn, thậm chí có khả năng bùng phát thành dịch bệnh trên diện rộng, trong thời gian ngắn. Hàng năm, trên thế giới ước tính có khoảng 3 - 5 triệu trường hợp mắc bệnh và 100.000 - 120.000 trường hợp tử vong do dịch/ bệnh tả. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã lựa chọn môi trường phù hợp nhất để tăng sinh tế bào vi khuẩn và sử dụng kỹ thuật sắc ký miễn dịch để chế tạo que thử phát hiện Vibrio cholerae trong nguồn nước sinh hoạt. Kết quả cho thấy, trong 3 môi trường: pepton kiềm, canh thang kiềm và LB kiềm thì môi trường pepton kiềm có khả năng tăng sinh tế bào vi khuẩn Vibrio cholerae tốt nhất, có thể đạt 106-107 CFU/ml sau 6-8 giờ nuôi cấy. Que thử tạo ra gồm có màng nitrocellulose và màng thấm hút trên, 2 kháng thể được cố định trên màng nitrocelluse lần lượt là: kháng thể đơn dòng kháng Vibrio cholerae được gây trênchuột với nồng độ 0,3 µg/mm và kháng thể đa dòng kháng chuột gắn enzyme peroxidase củ cải ngựa- HRP với nồng độ 0,2 µg/mm. Kết quả chỉ ra rằng, que thử cho phép phát hiện Vibrio cholerae trong nước ở nồng độ ≥ 105 CFU/ml trong thời gian 2-5 phút và có độ đặc hiệu là 94%. Từ khóa: Bệnh tả; Phát hiện nhanh; Que thử; Sắc ký miễn dịch; Vibrio cholerae. 1. MỞ ĐẦU Vi khuẩn tả Vibrio cholerae được Robert Koch tìm ra năm 1884 ở Đức [7]. Thế kỷ XIX đã xảy ra 6 vụ dịch lớn ở châu Á, Âu, Phi, Mỹ làm hàng triệu người tử vong. Ở Việt Nam, bệnh tả cũng đã xuất hiện từ năm 1850 và bùng phát thành dịch ở nhiều tỉnh, thành trong nhiều năm khiến hàng trăm người tử vong. Năm 2007 dịch lại bùng phát ở 19 tỉnh/thành phố phía Bắc và có hàng ngàn trường hợp mắc bệnh. Ngày nay, vi khuẩn này cũng là một trong những tác nhân chính gây ngộ độc thực phẩm và nước uống. Hàng năm, trên thế giới ước tính khoảng 3 - 5 triệu trường hợp mắc bệnh và 100.000 - 120.000 trường hợp tử vong do dịch/ bệnh tả [10]. Thời gian ủ bệnh ngắn khoảng từ 2 giờ đến 5 ngày, nhiều khả năng bùng phát dịch bệnh. Bệnh tả dễ truyền nhiễm qua phân và chất nôn của người bệnh hoặc từ các ổ chứa thiên nhiên như một số động vật thủy sinh, nhất là các loài nhuyễn thể (cá, cua, trai sò, ngao...) ở vùng cửa sông và ven biển. Vi khuẩn tả gây tiêu chảy cấp tính, nếu không phát hiện và chữa trị kịp thời có thể dẫn đến tử vong. Vì vậy, việc phát hiện sự có mặt của vi khuẩn tả V. cholerae trong nguồn nước và thực phẩm là hết sức cần thiết. Hiện nay, ở Việt Nam cũng như trên thế giới có rất nhiều phương pháp phát hiện vi khuẩn tả như: soi tươi, phân lập vi khuẩn, xét nghiệm huyết thanh học, PCR, ELISA, sắc ký miễn dịch...[1, 2, 4, 5]. Mỗi phương pháp đều có ưu nhược điểm riêng. Trong đó phương pháp PCR là phương pháp được áp dụng khá phổ biến, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Hiện nay, trên thị trường đã có các bộ kit phát hiện vi khuẩn tả V. cholerae bằng phương pháp PCR như bộ kit của hãng: VeTeKTM, Genesig. Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi máy móc và trang thiết bị hiện đại, khó áp dụng ngoài hiện trường. Chính vì vậy, để có thể vừa đảm bảo độ nhạy và độ đặc hiệu cao đồng thời đơn giản, dễ thao tác, thực hiện ngay tại hiện trường thì sắc ký miễn dịch là phương pháp phù hợp. Nghiên cứu khoa học công nghệ Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số 55, 06 - 2018 147 Năm 2013, Charaborty đã nghiên cứu chế tạo que thử phát hiện V. cholerae O1 và O139 trong các mẫu nước dựa trên phương pháp sắc ký miễn dịch [4]. Que thử cho phép phát hiện vi khuẩn ở nồng độ ≥10 CFU/ml với độ nhạy khoảng 90% và độ đặc hiệu 100% sau khi ủ mẫu trong môi trường peptone kiềm 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Debes và cộng sự [5] cũng đã sử dụng phương pháp này để phát hiện các mẫu phân và mẫu nước trong môi trường bị nhiễm V. cholerae O1 và O139 trong thời gian 5-8 giờ. Nhóm nghiên cứu đã sử dụng các kháng thể đặc hiệu với lipopolysaccharide (LPS) của V. cholerae O1 và O139. Ngưỡng phát hiện của phương pháp này là 10 ng LPS/ml với V. cholerae O1 (tương đương 106 CFU/ml) và 50 ng LPS/ml đối với V. cholerae O139 (tương đương 107 CFU/ml). Với những lý do nêu trên, chúng tôi sử dụng nguyên lý sắc ký miễn dịch để tạo que thử phát hiện nhanh vi khuẩn tả V. cholerae trong nguồn nước sinh hoạt và thực phẩm. 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu và hóa chất - Nguyên vật liệu: Màng nitrocelluse Immumopore FP và màng thấm hút trên được mua từ hãng Whatman (Anh), đĩa ELISA được mua từ hãng Beckman Coulter (Mỹ)... - Hóa chất: Kháng thể đơn dòng kháng V.cholerae (ABIN1825015 _KT1), kháng thể đơn dòng kháng V.cholerae (ABIN1825014 _KT2) được mua từ hãng Antibodies (Anh), Goat-antimouse IgG h&HPR (ab6789_KT3) được mua từ hãng Abcam (Anh). Các hóa chất còn lại đạt độ tinh khiết dùng trong nghiên cứu sinh học phân tử. 2.2. Thiết bị Các thiết bị chính dùng cho nghiên cứu bao gồm: Máy phun mẫu bán tự động Linomat5 được mua từ hãng Camag (Thụy Sĩ), tủ ấm được mua từ hãng Memmert (Đức), hệ thống ELISA được mua từ hãng Das (Ý), máy khuấy từ gia nhiệt và máy vortex được mua từ hãng Cole Palmer (Mỹ), máy short spin được mua từ hãng Hermle (Mỹ), máy ly tâm lạnh được mua từ hãng Orto alresa (Tây Ban Nha). 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phân lập vi khuẩn V. cholerae - Chuẩn bị môi trường chọn lọc (thạch TCBS): 8,8 g thạch TCBS được pha trong 100 ml cất, sau đó được đun sôi và đổ 15 ml vào đĩa Petri, để đông 15 phút ở nhiệt độ phòng [6]. - Cấy trải phân lập vi khuẩn (nước đầm tôm Hải Phòng, nước thoát cống Hà Nội và dịch nuôi vi khuẩn chuẩn mua ở Viện 103 được ký hiện là Vibrio cholerae O1): 50 µl dịch chứa vi khuẩn được cấy trải đều lên đĩa thạch TCBS và nuôi cấy qua đêm ở 37 oC. 2.3.2. Xác định trình tự gen 16S rRNA của chủng vi khuẩn phân lập được - Phản ứng PCR [6]: Từ mỗi đĩa vi khuẩn nuôi cấy, 1 khuẩn lạc được lựa chọn để nuôi cấy và tách genome. Sản phẩm genome được dùng như nguồn DNA làm khuôn cho phản ứng PCR. Thành phẩn của 1 phản ứng bao gồm: 12,5 µl Master mix 2X, 1 µl mồi 16S Fw 10 µmol, 1 µl mồi 16S Rv 10 µmol, 9,5 µl H2O và 1 µl khuôn. - Chu trình nhiệt: 94oC, 4 phút để khởi động nóng tiếp nối 30 chu kỳ của ba bước: 94 oC, 30 giây; 54 oC, 45 giây; 72 oC, 1 phút 30 giây, sản phẩm PCR được ủ ở 72 oC, 7 phút và giữ ở 4 oC. - Điện di sản phẩm PCR: Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1 % ở 90 V, 45 phút. - Giải trình tự: Sau khi điện di thu được băng kích thước khoảng 1,5 kb tương đương với kích thước gen 16S rRNA của V. cholerae, sản phẩm PCR được giải trình tự bởi First Base Laboratories (Singapore). Hóa học & Kỹ thuật môi trường T.T.T. Quỳnh, , N.T.T. Thư, “Tạo que thử phát hiện nhanh nguồn nước sinh hoạt.” 148 2.3.3. Xác định môi trường dùng để tăng sinh tế bào vi khuẩn V. cholerae - Chuẩn bị môi trường tăng sinh tế bào vi khuẩn: thành phần môi trường bao gồm 200 ml pepton kiềm pH 8.5 (2 g pepton, 2 g NaCl), 200 ml canh thang kiềm pH 8.5 (1g cao thịt, 2 g pepton, 1 g NaCl), 200 ml LB kiềm pH 8.5 (1 g yeast extract, 2 g pepton, 2 g NaCl). Các môi trường được khử trùng ở 121 oC trong 20 phút. - Nuôi cấy để làm tăng sinh tế bào vi khuẩn: Một khuẩn lạc vi khuẩn V. cholerae được nuôi trong 5 ml môi trường pepton kiềm qua đêm ở 37oC. 100 µl dịch nuôi cấy được cho vào 4,5 ml H2O cất đã khử trùng, được pha loãng ra các nồng độ 10 -1, 10-2, 10-3,10-4, 10- 5.500 µl dịch vi khuẩn pha loãng ở các nồng độ 10-3, 10-4, 10-5 được hút và cho vào các lọ chứa 10 ml môi trường chứa một trong 03 loại môi trường (LB kiềm, canh thang kiềm và pepton kiềm) và nuôi cấy ở 37 oC. Sau 4, 6, 8 giờ, 100 µl dịch nuôi cấy được pha loãng và cấy gạt trên đĩa thạch, tiếp tục nuôi cấy qua đêm ở 37 oC đến khi các khuẩn lạc hình thành rõ rệt. Các khuẩn lạc được đếm và kết quả được xử ý thống kê. 2.3.4. Đánh giá phản ứng giữa V. cholerae - kháng thể bằng phương pháp ELISA 100 µl poly L-lysine 0,01% được hút cho vào 03 giếng trong đĩa ELISA và được ủ ở 37 oC trong 1 giờ. Sau đó, các giếng được rửa bằng 200 µl đệm rửa (PBS 0,01 M, pH7.4; Tween 20 0,05%), 100 µl vi khuẩn ở nồng độ 108 CFU/ml được bổ sung và ủ ở 4 oC qua đêm. 200 µl BSA 1% được bổ sung vào mỗi giếng chứa vi khuẩn nuôi cấy, ủ ở 37 oC trong 2 giờ. Tương tự, các giếng được rửa sạch bằng đệm rửa và được bổ sung lần lượt như sau: 100 µl đệm PBS 0,01 M, pH 7,4; 100 µl kháng thể đơn dòng kháng V. cholerae gây trên chuột_KT1 nồng độ 5 µg/ml và 100 µl kháng thể đơn dòng kháng V. cholerae gây trên chuột _KT2 nồng độ 5 µg/ml, ủ 37 oC trong 1 giờ. Đĩa được rửa bằng đệm rửa để loại bỏ các kháng thể gắn không đặc hiệu. 100 µl kháng thể đa dòng kháng chuột gắn enzyme peroxidase củ cải ngựa-HRP (KT3), nồng độ 0,2 µg/ml được bổ sung tiếp tục vào mỗi giếng, hỗn hợp được ủ ở 37 oC trong 1 giờ, sau đó các kháng thể gắn không đặc hiệu được rửa bằng đệm rửa. 50 µl cơ chất 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) được bổ sung vào mỗi giếng và hỗn hợp được ủ 30 phút ở 37 oC trong tối, HRP thủy phân cơ chất tạo sản phẩm màu xanh. 50 µl H2SO4 1 N được bổ sung để làm ngừng phản ứng, trong môi trường axit, sản phẩm phản ứng chuyển sang màu vàng, cường độ màu phản ánh khả năng bắt cặp của kháng nguyên và kháng thể được đo ở bước sóng A450. 2.3.5. Chế tạo que thử phát hiện vi khuẩn V. cholerae - Cố định các kháng thể lên màng nitrocellulose: 02 loại kháng thể (kháng thể KT3 và KT1 hoặc KT3 và KT2) được được phun trực tiếp lên màng nitrocellulose thành 2 vạch bằng thiết bị in phun kháng thể Linomat5 với nồng độ là 0,2 µg/mm, tốc độ phun 40 nl/s. Sau đó, màng nitrocellulose được làm khô tự nhiên qua đêm ở nhiệt độ phòng để các kháng thể gắn cố định lên màng. Màng được ngâm trong dung dịch BSA 1%, 10 phút và được rửa lại bằng đệm PBS 0,01 M, pH 7,4; SDS 0,05 %, tiếp tục được để khô ở nhiệt độ phòng qua đêm. Màng được cắt thành các que thử rộng 2 mm có gắn thêm màng thấm hút ở trên. - Cộng hợp hạt vàng vào kháng thể: Dung dịch hạt vàng có kích thước nano được chuẩn bị theo phương pháp Turkevich [9]: 20ml dung dịch HAuCl4 0,1 % được đun sôi kết hợp khuấy từ trong bình tam giác 250 ml. Sau đó, 2 ml Natri citrate 1% được bổ sung vào bình dung dịch tiếp tục được đun sôi khoảng 5 phút (dừng khi dung dịch chuyển từ màu vàng thành màu đỏ rượu vang). Sau đó, dung dịch hạt vàng được làm nguội ở nhiệt độ phòng và được bảo quản trong bình tối ở 4 oC. Các hạt vàng có kích thước khoảng 20 nm và giữ ổn định bởi Natri citrate trong 1 tháng. Để cộng hợp hạt vàng vào kháng thể, dung dịch hạt vàngđược chuẩn về pH 9 bằng đệm borate 0,1 M. Sau đó, 100 µl kháng thể đơn dòng kháng V. cholerae gây từ chuột nồng độ 100 µg/ml được bổ sung vào 1,5 ml dung dịch hạt vàng đã được chuẩn pH, lắc ở tốc độ 650 vòng/phút trong 20 phút. Tiếp đến, hỗn Nghiên cứu khoa học công nghệ Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số 55, 06 - 2018 149 hợp dung dịch hạt vàng và kháng thể được ly tâm ở tốc độ 14.000 vòng/phút trong 5 phút ở 4 oC. Dịch nổi được loại bỏ và thu lại kháng thể đã cộng hợp vàng ở đáy ống. và 500 µl đệm phosphat 0,01 M, pH 7.4 tiếp tục được bổ sung. 2.3.6. Phân tích mẫu bằng que thử Mỗi mẫu phân tích được nhiễm chủ động vi khuẩn V. cholerae với liều lượng khác nhau trong 100 µl pepton kiềm và được đưa vào giếng ELISA. Sau đó, kháng thể cộng hợp với hạt vàng được bổ sung một lượng nhất định và cắm que thử vào giếng. Kết quả phân tích được đánh giá dựa vào việc xuất hiện vạch trên que thử và được coi là dương tính nếu xuất hiện cả 2 vạch, là âm tính nếu chỉ xuất hiện vạch kiểm chứng và không có giá trị nếu chỉ xuất hiện vạch thử nghiệm hoặc không có vạch nào xuất hiện [3]. 2.3.7. Xác định ngưỡng phát hiện của que thử Que thử được nhúng vào các dung dịch có chứa vi khuẩn V. cholerae với nồng độ khác nhau từ 104 -108 CFU/ml (sử dụng dịch nuôi V. cholerae pha loãng bằng nước cất đã khử trùng) và 10 µl kháng thể cộng hợp vàng 20 µg/ml. Giá trị thấp nhất mà que thử có thể phát hiện được chính là ngưỡng phát hiện của que thử. Thí nghiệm được lặp lại ít nhất 03 lần. 2.3.8. Xác định độ đặc hiệu của que thử Đánh giá độ đặc hiệu với một số chủng vi khuẩn chuẩn gây bệnh khác như Samonella, Shigella, E. coli, Listeria, S. aureus, Klebsiella. Các mẫu vi khuẩn chuẩn được cấy trên môi trường dịch tương ứng đến nồng độ 106 – 107 CFU/ml. Que thử được nhúng vào 100 l dịch nuôi mỗi loại vi khuẩn và 10 µl kháng thể cộng hợp vàng 20 µg/ml, đọc kết quả sau 5 phút. Mẫu thử được lặp lại 3 lần. Độ đặc hiệu của que thử được đánh giá thông qua tỷ lệ các mẫu âm tính đối với các vi khuẩn khác nhau [8]. 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập V. cholerae Kết quả phân lập bằng môi trường chọn lọc TCBS (Hình 1) cho thấy, cả 3 đĩa thạch đều thu được khuẩn lạc màu vàng đặc trưng của vi khuẩn V. cholerae. Trong đó, 01 mẫu là vi khuẩn V. cholerae O1 và 02 mẫu được thu từ môi trường tự nhiên. Tuy nhiên, môi trường TCBS có cũng cho phép một số vi khuẩn khác phát triển như: Vibrio parahaemolyticus,Vibrio fischeri, Pseudomonas.... Vì vậy, để khẳng định chắc chắn chủng vi khuẩn đã được phân lập, khuẩn lạc riêng rẽ trên mỗi đĩa đã được chọn để tiến hành PCR với mồi 16S và giải trình tự định danh vi khuẩn. Đồng thời, khuẩn lạc cũng được cấy chuyển và nuôi lỏng trong môi trường pepton kiềm (Do vi khuẩn này chỉ tồn tại trên TCBS khoảng 1 tuần). Hình 1. Sự phát triển của vi khuẩn V. cholerae trên môi trường thạch TCBS (A: Mẫu nước đầm tôm Hải Phòng; B: Mẫu nước thoát cống Hà Nội; C: Vi khuẩn V. cholerae chuẩn O1). 3.2. Xác định trình tự gen 16S rRNA của chủng vi khuẩn phân lập được Sản phẩm PCR sau khi được điện di trên gel agarose 1 %, thu được các băng có kích thước khoảng 1,5 kb tương đương với kích thước gen 16S rRNA của vi khuẩn V. cholerae Hóa học & Kỹ thuật môi trường T.T.T. Quỳnh, , N.T.T. Thư, “Tạo que thử phát hiện nhanh nguồn nước sinh hoạt.” 150 (hình 2). Sau đó, sản phẩm PCR được xác định trình tự nucleotide và so sánh trình tự đó với dữ liệu trên ngân hàng gen (sử dụng phần mềm Blast của NCBI). Kết quả cho thấy, 2 trong 3 mẫu phân lập được có độ tương là 99% so với trình tự gen 16S rRNA của V. cholerae trên ngân hàng gen (NR_044853.1). Trong khi đó, vi khuẩn được phân lập từ mẫu nước thoát chỉ tương đồng 65 %. 3.3. Xác định môi trường dùng để tăng sinh tế bào vi khuẩn V. cholerae Theo các kết quả nghiên cứu trước đây, ngưỡng phát hiện của vi khuẩn bằng que thử là từ 106-107 CFU/ml [4,5]. Tuy nhiên, trong các mẫu nước sinh hoạt, số lượng vi khuẩn tả bị nhiễm thường < 104 CFU/ml. Do đó, để đáp ứng nhu cầu phát hiện vi khuẩn ngay tại điều kiện hiện trường cần phải nuôi cấy để tăng sinh số lượng tế bào vi khuẩn này. Kết quả nuôi tăng sinh cho thấy vi khuẩn này có thể phát triển tốt ở cả 03 loại môi trường: LB kiềm, canh thang kiềm và pepton kiềm, sau 8 giờ nuôi cấy, lượng vi khuẩn V. cholerae trong cả 3 môi trường đều đạt đến 106-107 CFU/ml. Theo các nghiên cứu trước, đây là nồng độ mà que thử có thể phát hiện được dựa trên nguyên lý sắc ký miễn dịch [5]. Tuy nhiên, tại thời điểm 8 giờ, môi trường pepton kiềm là môi trường có số lượng tế bào vi khuẩn nhiều nhất (hình 3). Trong một số công trình đã công bố, môi trường chủ yếu được lựa chọn để nuôi cấy vi khuẩn V. cholerae là cũng pepton kiềm do vi khuẩn này có thể phát triển tốt trong môi trường nghèo dinh dưỡng có pH từ 8,5-9 [4, 5]. Do đó, chúng tôi lựa chọn môi trường này để nuôi cấy V. cholerae trong các thử nghiệm tiếp theo. Hình 3. Kết quả tăng sinh tế bào vi khuẩn V. cholerae 3.4. Đánh giá phản ứng giữa V. cholerae- kháng thể bằng phương pháp ELISA Kết quả phân tích phản ứng giữa V. cholerae - kháng thể bằng phương pháp ELISA cho thấy, cả hai giếng ủ V. cholerae với kháng thể đơn dòng đều xuất hiện màu vàng và có số đọc A450 tương ứng là 0,352 và 0,245 (hình 4), trong khi mẫu âm cho tín hiệu rất thấp. Điều này chứng tỏ, hai loại kháng thể đơn dòng kháng V. cholerae là KT1 và KT2 đều có khả năng bắt cặp với vi khuẩn này và đồng thời bắt cặp với kháng thể KT3. Vì vậy, KT3 Hình 2. Kết quả nhân bản gen 16S rRNA của vi khuẩn V. cholera. M: Marker 1 kb; 1: Đối chứng âm; 2: Vi khuẩn phân lập từ mẫu nước Đầm tôm Hải Phòng; 3: Vi khuẩn phân lập từ mẫu nước thoát Hà Nội; 4: Vibrio cholerae O1. Nghiên c Tạp chí Nghi có th làm kháng th tiến h 3.5. Ngư kháng th giá kh hai lo cho phép phát hi phát hi với kết quả tăng sinh tế b đư Hình 5 Hình 6 khá tương đ ể đ Sau khi t ợc từ 10 Kết quả phát triển que thử phát hiện nhanh vi khuẩn ư ành đ ả năng phát hiện vi khuẩn ại que thử đều có khả năng phát hiện vi khuẩn ện đến 10 ứu khoa học công nghệ ợc d ồng thời cả hai tr ỡng phát hiện của que thử ể bắt giữ) v 6 . Kết quả đánh giá ng . Kết quả đánh giá ng ên c ùng làm kháng th ể cộng hợp v ạo đ -10 ồng với kết quả nghi ứu KH&CN Gi ư ện ở ng 6 8 CFU/ml ếng 1: Đối chứng âm; Giếng 2: Vibrio cholera ợc 2 loại que thử: Loại1 (d CFU/ml, th à lo à KT2 dùng làm kháng th ại 2 (ng ưỡng nồng ào vi khu . cộng hợp v cộng hợp v quân s ường hợp để kiểm tra. Gi ể kiểm chứ ếng 3: Vibrio cholerae ư ời gian phát hiện từ 2 ưỡng phát hiện của que thử loại 1 ( ưỡng phát hiện của que thử loại 2 ( ự, Hình 4 ợc lại so với q V. cholerae ẩn ên c Số độ 10 V. cholerae à KT2 làm kháng th à KT1 làm kháng th ủa khác, Chakraborty v 55 . , 06 ng. Tuy nhiên, đ Kết quả ELISA ùng KT1 làm kháng th 5 CFU/ml ( - 20 của 2 loại que thử n 18 ue th , sau 6 ể bắt giữ hoặc ng -KT2 ử loại 1), chúng tôi đ V. cholerae h -5 phút ( . ình 5), trong khi que th -8 gi ể bắt giữ) ể bắt giữ) ể lựa chọn chính xác KT1 d -KT3. V. cholerae hình 6). ờ nuôi cấy số l à c -KT1 . Tuy nhiên, que th dùng KT1 làm kháng th . dùng KT2 làm kháng th . ộng sự, đ ể cộng hợp v ày. K ược lại, chúng tôi đ -KT3; ết quả cho thấy, cả Kết quả n c ã ti ủa chúng tôi cũng ã t ến h ượng tế b ạo th à KT2 làm ử loại 2 chỉ ày phù h ành đánh ử loại 1 ành công 151 ùng ào đ ã ợp ạt ể ể Hóa học & Kỹ thuật môi trường T.T.T. Quỳnh, , N.T.T. Thư, “Tạo que thử phát hiện nhanh nguồn nước sinh hoạt.” 152 que thử có ngưỡng phát hiện là 107 CFU/ml sau 24 h nuôi cấy [4]; Amanda Debes và cộng sự đã tạo thành công que thử có ngưỡng phát hiện là 106 CFU/ml đối với chủng V. cholerae O1 và 107 CFU/ml đối với chủng V. cholerae O139 sau 5-8 giờ nuôi cấy, thời gian phát hiện 5-10 phút [5]. 3.6. Độ đặc hiệu của que thử Độ đặc hiệu của que thử là khả năng có phản ứng chéo với các vi khuẩn khác. Các vi khuẩn được sử dụng trong nghiên cứu đánh giá độ đặc hiệu của que thử là một số vi khuẩn gây bệnh như Salmonella, Shigella, Listeria, Klebsiella, S. aureus và E. coli. Kết quả về độ đặc hiệu của que thử phát hiện V. cholerae được trình bày trên bảng 1 và hình 7. Bảng 1. Độ đặc hiệu của que thử phát hiện V. cholerae. Số que thử dương tính (3 lần lặp lại) Chủng S al m on el la S h ig el la L is te ri a K le bs ie ll a S . a u re u s E . co li Que thử V. cholerae 0/3 0/3 0/3 1/3 0/3 0/3 Hình 7. Kết quả đánh giá độ đặc hiệu của que thử phát hiện V. cholera. Kết quả trình bày trên bảng 1 cho thấy với 18 que thử phát hiện V. cholerae về khả năng phản ứng chéo với các vi khuẩn khác (3 que/loại vi khuẩn), có 1 que cho kết quả dương tính với vi khuẩn Klebsiella, 17 que cho kết quả âm tính. Từ đó, có thể xác định độ đặc hiệu kỹ thuật của que thử trong thử nghiệm này là 17/18 = 0,94 tương đương 94%. 4. KẾT LUẬN Qua nghiên cứu này, chúng tôi đã phân lập được 01 chủng vi khuẩn V. cholerae từ mẫu nước đầm tôm ở Hải Phòng, lựa chọn được môi trường peton kiềm thích hợp cho việc tăng sinh của vi khuẩn V. cholerae sau 8 giờ nuôi cấy, số lượng tế bào vi khuẩn có thể lên đến 106-107 CFU/ml.Chúng tôi đã bước đầu chế tạo thành công que thử và đánh giá được ngưỡng phát hiện là 105 CFU/ml trong 2-5 phút. Độ đặc hiệu của que thử với một số vi khuẩn gây bệnh khác là 94%. Lời cảm ơn: Công trình này được hoàn thành với sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài nghiên cứu khoa học thuộc chương trình AN-QP Thành phố Hồ Chí Minh năm 2015: "Nghiên cứu chế tạo kit phát hiện nhanh một số vi sinh vật gây bệnh đường ruột trong nguồn nước sinh hoạt, ứng dụng cho bộ đội đóng quân trên đảo và lực lượng tàu ngầm". TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Hà Thị Quyến, (2006), “Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong việc định typ vi khuẩn Vibrio cholerae phân lập ở Việt Nam”, Luận án tiến sĩ sinh học. Viện Công nghệ sinh học. [2]. Hà Thị Quyến, Dương Hồng Quân, Đinh Duy Kháng, Phùng Đắc Cam, (2005), “Nghiên cứu chế tạo bộ kit để phát hiện nhanh vi khuẩn tả (Vibrio cholerae) trong nước”, Tạp chí Sinh học, 27(4), 57-60. [3]. Trần Thị Sao Mai, Nguyễn Thị Khánh Trâm, Lê Quang Hòa (2015), “Nghiên cứu phát triển hệ thống sắc ký miễn dịch cạnh canh phát hiện các độc tố ruột tụ cầu trong sữa”, Tạp chí Khoa học Công nghệ, ĐHQGHN. [4]. Chakraborty S., Alam M., Scobie H.M., Sack D.A. (2013), “Adaptation of a simple Sal Shi Lis Kleb E.coli Stap Nghiên cứu khoa học công nghệ Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số 55, 06 - 2018 153 dipstick test detection of Vibrio cholerae O1 and O139 in environmental water”, Frontiers in Microbiology, 4(320), 1-3. [5]. Debes A., Chakraborty S., Ali M., Sack D.A.(2014), “Manual for detecting Vibrio cholerae O1 and O139 from Fecal sample and from environmental water using a dipstick assay” from the DOVE Project,based in the Department of International Health, JohnsHopkins Bloomberg School of Public Health. [6]. Huq A., Haley B.J., Taviani E., Chen A., Hasan N.A., Colwell R.R. (2012), “Detection, Isolation, and Identification of Vibrio cholerae from the Environment”, Current Protocols in Microbiology, chapter: Unit6A.5. [7]. Howard-Jones N. (1984), "Robert Koch and the cholera vibrio: a centenary". BMJ. 288 (6414): British Medical Journal. 288 (6414): 379-81. [8]. Sun Z., Bai X., Chen X., McCrae D., Saaki E. (2013), “A simple, specific and rapid lateral-flow immunochromatographic test method for detection of Legionella pneumophila in water samples”, International Conference on Biology Environment and Chemistry. IPCBEE vol 58, 125-130. [9]. Turkevich, J., Stevenson, P. C., Hillie, J. (1951), “A study of the nucleation and growth processes in the synthesis of colloidal gold”, Discussion of the. Faraday Society, 55-75. [10]. ABSTRACT PRODUCTION OF LATERAL TEST TRIPS FORDETECTION OF Vibrio cholerae IN WATER Vibrio cholerae also called cholera is one of the most common causes of acute diarrhea infection. This bacterium spreads rapidly through water and food, and even can cause disease outbreaks on wide areas in short time. Every year, there are about 3-5 millions infected cases and 100,000 to 120,000 deaths due to cholera attack in the world. In this study, we cultivated V. cholerae on three media including alkaline peptone, alkaline broth and alkaline LB and found that the alkaline peptone was the most suitable medium for growth of V. cholerae, up to 106-107 CFU/ml could be obtained after 6-8 hours. We also successfully made test strips for quick dectetion of V. cholerae. The strips consisted of nitrocellulose membrane and absorbent pad, mouse anti-Vibrio cholerae monoclonal IgG (as primary antibodies) at a concentration of 0.3 μg/mm and goat anti-mouse IgG conjugated with horseradish peroxidase (as secondary antibodies) at a concentration of 0.2 μg/mm. The obtained results showed that the test strips allowed to detect Vibrio cholerae in water at concentrations ≥ 105 CFU/ml for 2-5 minutes. The specificity of test trips was 94%. Keywords: Cholera; Immumochromatography; Quickly detect; Vibrio cholerae, Test trip. Nhận bài ngày 24 tháng 8 năm 2017 Hoàn thiện ngày 25 tháng 12 năm 2017 Chấp nhận đăng ngày 08 tháng 6 năm 2018 Địa chỉ: 1 Viện Công nghệ mới/Viện Khoa học và công nghệ quân sự; 2 Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội. * Email: tranthithanhquynhk55b2@gmail.com.