Tài liệu Tạo nguyên liệu in vitro và bước đầu khảo sát khả năng tạo rễ tơ cây bạch hoa xà (plumbago zeylanica L.) - Bùi Đình Thạch: TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 161-169
161
TẠO NGUYÊN LIỆU IN VITRO VÀ BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT KHẢ NĂNG
TẠO RỄ TƠ CÂY BẠCH HOA XÀ (Plumbago zeylanica L.)
Bùi Đình Thạch*, Nguyễn Minh Hiếu, Phạm Thị Phương Uyên,
Ngô Kế Sương, Nguyễn Hữu Hổ
Viện Sinh học nhiệt đới, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, (*)thachden78@yahoo.com
TÓM TẮT: Với mục tiêu nhân giống in vitro cây bạch hoa xà (Plumbago zeylanica L.) từ đoạn thân tạo
nguồn nguyên liệu cho nuôi cấy in vitro và chuyển gen, kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy, thời
gian khử trùng 20 phút, 10% dung dịch javel là điều kiện tối ưu cho tạo mẫu in vitro (41,29%), môi trường
MS có bổ sung 1,5 mg/L BA và 0,1 mg/L IBA tạo được chồi tối ưu (4,67 chồi/mẫu) sau 4 tuần nuôi cấy,
chồi in vitro phát triển thành cây tốt nhất ở môi trường MS có bổ sung 0,1 mg/L IBA. Hai chủng vi khuẩn
Agrobacterium rhizogen 11325 và 15834 được sử dụng trong công thức chuyển gen tạo rễ tơ, kết quả
bước đầu đã chọn lọc 5 dòng rễ được cho là t...
9 trang |
Chia sẻ: quangot475 | Lượt xem: 465 | Lượt tải: 0
Bạn đang xem nội dung tài liệu Tạo nguyên liệu in vitro và bước đầu khảo sát khả năng tạo rễ tơ cây bạch hoa xà (plumbago zeylanica L.) - Bùi Đình Thạch, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 161-169
161
TẠO NGUYÊN LIỆU IN VITRO VÀ BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT KHẢ NĂNG
TẠO RỄ TƠ CÂY BẠCH HOA XÀ (Plumbago zeylanica L.)
Bùi Đình Thạch*, Nguyễn Minh Hiếu, Phạm Thị Phương Uyên,
Ngô Kế Sương, Nguyễn Hữu Hổ
Viện Sinh học nhiệt đới, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, (*)thachden78@yahoo.com
TÓM TẮT: Với mục tiêu nhân giống in vitro cây bạch hoa xà (Plumbago zeylanica L.) từ đoạn thân tạo
nguồn nguyên liệu cho nuôi cấy in vitro và chuyển gen, kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy, thời
gian khử trùng 20 phút, 10% dung dịch javel là điều kiện tối ưu cho tạo mẫu in vitro (41,29%), môi trường
MS có bổ sung 1,5 mg/L BA và 0,1 mg/L IBA tạo được chồi tối ưu (4,67 chồi/mẫu) sau 4 tuần nuôi cấy,
chồi in vitro phát triển thành cây tốt nhất ở môi trường MS có bổ sung 0,1 mg/L IBA. Hai chủng vi khuẩn
Agrobacterium rhizogen 11325 và 15834 được sử dụng trong công thức chuyển gen tạo rễ tơ, kết quả
bước đầu đã chọn lọc 5 dòng rễ được cho là thể chuyển gen.
Từ khóa: Agrobacterium rhizogen, Plumbago zeylanica, in vitro, nuôi cấy.
MỞ ĐẦU
Cây bạch hoa xà, có tên khoa học là
Plumbago zeylanica L., thuộc họ
Plumbaginaceae, là một cây dược liệu có nguồn
gốc từ vùng Tây Bắc châu Á [2], được phân bố
ở một số vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới như
Úc, châu Á và châu Phi [19].
Theo y học cổ truyền, cây Bạch hoa xà được
sử dụng điều trị một số bệnh về da như bị vết
thương, chàm, bệnh ghẻ, bệnh phong [1]. Nhiều
nghiên cứu cho thấy nhiều bộ phận như rễ, lá và
cành của cây được sử dụng như nguồn dược liệu.
Rễ cây chứa một acrid crystalline gọi là
plumbagin, một naphtoquinone màu vàng được
sử dụng như dược chất ở Ấn Độ từ khoảng 750
năm trước công nguyên dùng kháng ký sinh, bổ
tim, bảo vệ gan và bảo vệ thần kinh. Ngoài ra,
nhiều hoạt chất khác nhau được ghi nhận trong rễ
cây này, bao gồm phenolic acids, tannins,
anthocyanin... có hoạt tính kháng khuẩn [13].
Nhiều nghiên cứu cho thấy, plumbagin được
chiết tách từ cây có khả năng kháng ung thư
[12], kháng khuẩn [4, 5], kháng sốt rét [8], ức
chế hoạt động phân chia tế bào [3], kháng đột
biến, kháng côn trùng [8] và làm giảm
cholesterol tổng số [12].
Cây bạch hoa xà sinh trưởng chậm trong điều
kiện tự nhiên, các rễ của cây dùng để thu nhận
plumbagin cần nhiều năm mới cho hàm lượng
hoạt chất cao [7]. Ở Việt Nam, do chưa có qui
hoạch tổng thể vùng trồng thu nguyên liệu, vì
vậy, việc khai thác rễ tự nhiên dùng làm nguồn
dược liệu chế biến sản phẩm tiêu tốn nhiều thời
gian, làm cạn kiệt lượng cây phân bố ngoài tự
nhiên.
Trong bài báo này, chúng tôi trình bày kết
quả nghiên cứu tạo nguyên liệu cây in vitro và
bước đầu khảo sát khả năng tạo rễ tơ cây bạch
hoa xà (Plumbago zeylanica) nhờ vi khuẩn
Agrobacterium rhizogenes trên cơ sở dùng mô
nguyên liệu in vitro đã tạo được hướng mục đích
dài hạn là nuôi nhân quy mô lớn sinh khối rễ tơ
bằng phương pháp công nghệ sinh học, góp phần
đáp ứng nguồn nguyên liệu dùng chế biến sản
phẩm sử sụng trong lĩnh vực y dược.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu
Cây bạch hoa xà (Plumbago zeylanica) sinh
trưởng trong điều kiện tự nhiên ở tỉnh Phú Yên
được lấy mẫu đọan thân để khử trùng; sử dụng 2
chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes
ATCC (American Type Culture Collection)
15934 và ATCC 11325 [dạng hoang dại (wild
type), đều chứa plasmid pRi mang các gen rol
(root loci) như rolB và rolC trên vùng T-DNA]
được cung cấp bởi Phòng Công nghệ gen, Viện
Sinh học nhiệt đới.
Phương pháp
Khử trùng mẫu cấy
Bui Dinh Thach et al.
162
Đoạn thân (dài khoảng 1,5 cm) chứa chồi
ngủ được rửa dưới vòi nước máy trong 10-15
phút, sau đó tiến hành rửa sạch bề mặt bằng
nước xà phòng loãng và rửa lại bằng nước cất
vô trùng. Tiếp theo, mẫu được khử trùng bằng
dung dịch javel thương mại nồng độ 10% (v/v)
trong thời gian 20 phút. Mẫu được rửa lại bằng
nước khử ion vô trùng, loại bỏ phần mô chết
trắng và cấy mẫu lên môi trường MS
(Murashige và Skoog, 1962) [10] đặc.
Khảo sát sự tăng sinh chồi nách
Các đoạn thân mang chồi nách 4 tuần tuổi
(chồi cao khoảng 0,5 cm) được nuôi cấy trên
môi trường MS có bổ sung BA 1,0-2,5 mg/L và
IBA 0,1-0,5 mg/L. pH môi trường được điều
chỉnh về 5,8 trước khi hấp khử trùng ở nhiệt độ
121oC, áp suất 1atm trong thời gian 30 phút.
Các mẫu được nuôi trong điều kiện chiếu sáng
10 h/ngày ở nhiệt độ 22 ± 2oC.
Khảo sát phát triển cây
Mẫu cấy dùng cho thí nghiệm là những
chồi in vitro có chiều cao khoảng 1,5 cm,
được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ
sung IBA nồng độ 0,1-0,35 mg/L, pH 5,8;
điều kiện khử trùng môi trường và điều kiện
nuôi như trên.
Khảo sát sự tạo rễ bất định
Nghiên cứu này nhằm mục đích tạo nguồn
nguyên liệu rễ bất định dùng nuôi cấy so sánh
với rễ tơ.
Đoạn thân (dài khoảng 1,5 cm) và lá cây in
vitro (có cuống) được nuôi cấy trên môi trường
MS bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật
NAA (0,1-1,5 mg/L) và IBA (0,1-1,5 mg/L). pH
5,8; điều kiện khử trùng môi trường và điều
kiện nuôi như trên.
Khảo sát khả năng tạo rễ tơ
Vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ATCC
15834 và ATCC 11325 bảo quản ở -80oC được
hoạt hoá bởi quá trình nuôi trải trên môi trường
LB (đặc) trong 2 ngày ở 25oC và điều kiện tối.
Vi khuẩn, qua cấy chuyển vào môi trường lỏng
LB và nuôi lắc 280 vòng/phút ở 25oC trong 24
giờ, được dùng để xử lý chuyển gen tạo rễ tơ.
Mẫu lá (có cuống) của cây in vitro được gây
nhiễm (infection) trong 15 phút với từng chủng
vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes nói trên
(hai lô thí nghiệm khác nhau). Thấm khô nhẹ
dịch vi khuẩn thừa ở mẫu lá và nuôi chung (co-
cultivation) mô với vi khuẩn trong 3 ngày. Sau
nuôi chung, tiến hành rửa loại bỏ vi khuẩn
bằng kháng sinh cefotaxime (500 g/ml). Mẫu
sau khi rửa được nuôi trên môi trường MS
đặc có bổ sung cefotaxime (nồng độ như trên).
Theo dõi sự hình thành rễ tơ sau 2-4 tuần nuôi ở
25oC và điều kiện tối, ghi nhận hình thái mẫu rễ
tơ và tách dòng nuôi cấy rễ tơ trong môi trường
MS lỏng không bổ sung chất điều hòa sinh
trưởng sau khi rễ phát triển đạt chiều dài khoảng
1 cm.
Xử lý thống kê
Các thí nghiệm được thiết kế theo thể thức
hoàn toàn ngẫu nhiên. Mỗi thí nghiệm được lặp
lại 3 lần, số liệu được xử lý bằng phần mềm
Statgraphics Centurion XV theo phương pháp
Duncan multiple Range Test (Duncan, 1995) ở
mức ý nghĩa 5%.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Khảo sát sự tăng sinh chồi nách
Cytokinin là nhóm các chất điều hòa sinh
trưởng thực vật, có một trong các hoạt tính sinh
lý là kích thích sự phát triển chồi nách. Đặc biệt,
khi tương tác với auxin ở nồng độ thích hợp,
cytokinin sẽ thúc đẩy phân chia tế bào ở mô
phân sinh đỉnh, nâng cao tỷ lệ tạo chồi, tạo số
lượng chồi hình thành nhiều hơn so với không
bổ sung hai nhóm chất này.
Khi không bổ sung/bổ sung ít cytokinin,
chồi tăng trưởng chủ yếu theo chiều cao, không
được kích thích tạo nhiều chồi bên. Không phải
nồng độ cytokinin và auxin cao quyết định sự
tạo chồi mà chính tỷ lệ thích hợp giữa cytokinin
và auxin đã làm tăng khả năng tạo chồi (hình 1;
bảng 1). Nồng độ BA 1,5 mg/L kết hợp IBA 0,1
mg/L là tổ hợp tạo chồi tốt nhất trong các
nghiệm thức (4,76 chồi/mẫu) và kết quả nhận
được ở nghiên cứu này của chúng tôi phù hợp
với kết quả nghiên cứu của Verma et al. (2002)
[18], qua nghiên cứu khả năng tạo chồi trực tiếp
từ chồi bên cây bạch hoa xà với số chồi trung
bình là 3,5 trên môi trường MS bổ sung 2 mg/L
BA và 0,1 mg/L IBA.
TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 161-169
163
A. Nghiệm thức đối chứng
sau 4 tuần nuôi cấy
B. MS+ 1,5 mg/L BA + 0,1mg/L IBA
sau 4 tuần nuôi cấy
C. MS +1,0 mg/L BA + (0,1-0,5) mg/L IBA D. MS + 1,5 mg/L BA + (0,1-0,5) mg/L IBA
E. MS + 2,0 mg/L BA + (0,1-0,5) mg/L IBA F. MS + 2,5 mg/L BA+ (0,1-0,5) mg/L IBA
Hình 1. Tạo chồi bạch hoa xà từ chồi bên trên các môi trường khác nhau sau 4 tuần nuôi cấy
A. Đối chứng; B. Môi trường MS+ 1,5 mg/L BA + 0,1 mg/L IBA; C. Môi trường MS +1,0 mg/L BA + (0,1-
0,5) mg/L IBA; D. Môi trường MS + 1,5 mg/L BA + (0,1-0,5) mg/L IBA; E. Môi trường MS + 2,0 mg/L BA +
(0,1-0,5) mg/L IBA; F. Môi trường MS + 2,5 mg/L BA+ (0,1-0,5) mg/L IBA. Các chữ cái a, b, c, d,... trên hình 1
tương ứng môi trường A1, A2, A3,... ở bảng 1.
a
b c d
e f
g
h
i
j
k
l m n
o
r
q
p t
s
Bui Dinh Thach et al.
164
Bảng 1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng BA và IBA đến khả
năng tạo chồi từ chồi bên in vitro của cây bạch hoa xà
Môi
trường
Ký
hiệu
BA
(mg/L)
IBA
(mg/L)
Tỷ lệ tạo chồi
(%)
Số chồi trung
bình/mẫu
Chiều cao trung
bình của chồi
(cm)
O 0 0 100 1,00 5,33 a
A1 a 1,0 0,1 88,89 4,45 1,56 b
A2 b 1,0 0,2 77,78 4,00 1,47 bc
A3 c 1,0 0,3 83,33 2,67 1,59 b
A4 d 1,0 0,4 77,78 3,56 1,31 bcd
A5 e 1,0 0,5 55,56 3,78 1,12 bcde
B1 f 1,5 0,1 100 4,67 1,40 bcd
B2 g 1,5 0,2 88,89 4,33 1,45 bcd
B3 h 1,5 0,3 88,89 1,89 0,69 de
B4 i 1,5 0,4 100 2,44 0,73 cde
B5 j 1,5 0,5 77,78 3,78 0,88 bcde
C1 k 2,0 0,1 100 2,44 1,33 bcd
C2 l 2,0 0,2 88,89 1,89 1,07 bcde
C3 m 2,0 0,3 77,78 1,33 0,84 bcde
C4 n 2,0 0,4 100 2,78 1,11 bcde
C5 o 2,0 0,5 77,78 3,56 1,27 bcde
D1 p 2,5 0,1 88,89 1,44 1,05 bcde
D2 q 2,5 0,2 88,89 1,22 0,69 de
D3 r 2,5 0,3 88,89 2,44 1,28 bcde
D4 s 2,5 0,4 66,67 1,78 0,52 e
D5 t 2,5 0,5 66,67 2,11 0,71 cde
Các chữ cái khác nhau (a, b, c, ...) chỉ sự khác biệt có ý nghĩa ở mức thống kê, α = 0,05.
Khảo sát sự phát triển cây
Các chồi phát triển tốt được cắt ngang và
cấy thẳng đứng trên môi trường MS có bổ sung
IBA với các nồng độ khác nhau (bảng 2) để
đánh giá khả năng tạo rễ. Kết quả cho thấy, ở tất
cả các chồi rễ đều phát triển trên môi trường
MS có bổ sung IBA sau 2 tuần nuôi cấy. Môi
trường E1 (0,1 mg/L IBA) là môi trường thích
hợp cho sự phát triển cây với số rễ trung bình
11,33; chiều dài rễ trung bình 2,27 và số lá
trung bình 6,67 (bảng 2). Kết quả này cũng phù
hợp với kết quả nghiên cứu của Verma et al.
(2002), Wei et al. (2006) [18, 20] qua nghiên
cứu khả năng tạo rễ từ chồi cây Bạch hoa xà
trên môi trường MS bổ sung 0,1 mg/L IBA - tốt
nhất cho sự tạo rễ và tăng trưởng cây.
Hình 2. Ảnh hưởng IBA lên sự phát triển cây sau 2 tuần nuôi cấy
Các chữ cái a, b, c,... trên hình 2 tương ứng với các môi trường E0, E1, E3 ở bảng 2.
a
b
c d
f
e
g
TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 161-169
165
Bảng 2. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật IBA lên sự phát triển cây bạch hoa xà từ
chồi in vitro sau 2 tuần nuôi cấy
Môi
trường
Ký
hiệu
Nồng độ
IBA(mg/L)
Tỷ lệ tạo
rễ (%)
Số rễ trung
bình/mẫu
Chiều dài
rễ (cm)
Số lá trung
bình/mẫu
E0 a 0,00 100 4,33 d 2,93 a 4,00
E1 b 0,10 100 11,33 ab 2,27 a 6,67
E2 c 0,15 100 13,00 a(*) 1,30 b 6,33
E3 d 0,20 100 9,00 bc 1,13 b 5,33
E4 e 0,25 100 10,33 ab 1,07 b 5,00
E5 f 0,30 100 12,67 a 0,97 b 5,67
E6 g 0,35 100 5,67 cd 0,67 b 4,67
Các chữ cái khác nhau (a, b, c,...) chỉ sự khác biệt có ý nghĩa ở mức α = 0,05.
Khảo sát sự tạo rễ bất định
Kết quả nghiên cứu cảm ứng tạo rễ bất định
từ lá và đoạn thân trên môi trường MS có bổ
sung nồng độ khác nhau của các chất điều hòa
sinh trưởng IBA và NAA được trình bày ở
bảng 3.
Bảng 3. Ảnh hưởng các chất điều hòa sinh trưởng IBA và NAA đến khả năng tạo rễ bất định từ lá
và đoạn thân sau 4 tuần nuôi cấy
Hàm lượng (mg/L) Trọng lượng rễ TB/nghiệm thức (g TLT)
IBA NAA Lá Đoạn thân
0 0,0 1,210 j 0,4300i
0 0,1 2,610b 0,6800 h
0 0,5 2,500bc 0,8200 gh
0 1,0 1,810gh 1,130f
0 1,5 1,700hi 1,220ef
0,1 0,0 1,600i 1,25 ef
0,1 0,1 2,000ef 1,780a(*)
0,1 0,5 2,110de 1,550bc
0,1 1,0 2,190d 0,8500g
0,1 1,5 2,400c 1,670ab
0,5 0,0 1,720hi 1,450cd
0,5 0,1 3,020a(*) 1,230ef
0,5 0,5 1,710hi 0,7700gh
0,5 1,0 1,830gh 1,120f
0,5 1,5 1,830gh 1,250ef
1,0 0,0 1,830gh 0,8800g
1,0 0,1 2,120de 0,7700gh
1,0 0,5 2,200d 1,500c
1,0 1,0 2,400c 1,170ef
1,0 1,5 2,580b 0,8500g
1,5 0,0 1,870fg 0,7700gh
1,5 0,1 2,380c 1,300de
1,5 0,5 1,750gh 1,220ef
1,5 1,0 1,310j 1,120f
1,5 1,5 1,240j 1,180ef
Các chữ cái khác nhau (a, b, c,...) chỉ sự khác biệt có ý nghĩa ở mức α = 0,05.
Bui Dinh Thach et al.
166
Hình 3. Ảnh hưởng các chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tạo rễ bất định từ lá và đoạn thân
Kết quả nghiên cứu cho thấy, tất cả các
công thức đều kích thích tạo rễ bất định sau 4
tuần nuôi cấy. Tuy nhiên, tổ hợp nồng độ IBA
0,5 mg/L và NAA 0,1 mg/L có tác động tối ưu
đến sự hình thành rễ bất định ở lá với trọng
lượng tươi rễ trung bình đạt 3,02 g; IBA 0,1
mg/L phối hợp NAA 0,1 mg/L có tác động tối
ưu cho sự tạo rễ từ đoạn thân với trọng lượng
tươi rễ trung bình đạt 1,78 g (bảng 3 và hình 8).
Như vậy, kết quả nhận được cho thấy sự hình
thành rễ được kích thích mạnh khi có sự kết hợp
của IBA và NAA trong môi trường nuôi cấy;
kết quả này khá phù hợp với kết quả nghiên cứu
của Sivanesan & Jeong (2009) [16] khi cho rằng
rễ được tạo ra tốt nhất trong môi trường có bổ
sung 1,0 mg/L IBA và 0,5 mg/L NAA. Lá là bộ
phận cho kết quả tạo rễ bất định tốt hơn so với
đoạn thân.
Khảo sát tạo rễ tơ
Hai tuần sau nuôi chung, chúng tôi nhận thấy
có sự hình thành rễ tơ ở một số mẫu lá (hình 4).
Tuy chưa thực hiện phản ứng PCR các gen rol để
khẳng định là rễ chuyển gen nhưng dựa vào tần
số tạo rễ cao (công bố ở bài báo khác), dựa vào
quan sát hình thái rễ qua kính hiển vi (rễ có rất
nhiều lông hút) và sự tăng sinh rất nhanh với tính
ổn định cao của chúng trong môi trường MS lỏng
không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng so với
mẫu rễ đối chứng, chúng tôi cơ bản cho rằng 5
TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 161-169
167
dòng rễ tạo được là các dòng rễ tơ (2 dòng qua
dùng chủng vi khuẩn ATCC 11325 và 3 dòng
qua dùng chủng vi khuẩn ATCC 15834) (hình 5,
6, 7). Kết quả của chúng tôi phù hợp với kết quả
nghiên cứu của Verma et al. (2002) [18] khi kết
luận sinh khối tươi của rễ tơ/rễ chuyển gen cao
gấp 2,5 lần so với rễ đối chứng.
Hình 4. Sự hình thành rễ tơ từ mảnh lá
a. Rễ tơ từ mảnh lá ở giai đoạn 14 ngày sau nuôi
chung với Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834
(vị trí mũi tên), b. Đối chứng (ĐC).
Hình 5. Rễ tơ từ mảnh lá chụp dưới kính hiển vi
(vị trí mũi tên) qua nuôi chung với
Agrobacterium rhizogenes ATCC 11325
Hình 6. Đoạn rễ tơ (chụp qua kính hiển vi, do
Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834) nuôi
trên môi trường MS không bổ sung chất điều
hòa sinh trưởng
Hình 7. Rễ tơ (do Agrobacterium rhizogenes
ATCC 15834) nuôi trong môi trường MS lỏng
lắc không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng sau
30 ngày
KẾT LUẬN
Trên đối tượng cây dược liệu bạch hoa xà
(Plumbago zeylanica L.), qua thực hiện một số
nghiên cứu về nuôi cấy mô in vitro bao gồm nuôi
cấy đoạn thân mang chồi ngủ, nuôi cấy tăng sinh
chồi, tăng trưởng cây và nuôi cấy tạo rễ bất định
dùng môi trường khoáng cơ bản MS có bổ sung
một số loại chất điều hòa sinh trưởng (BA, IBA,
NAA) thích hợp với nồng độ thích hợp ở từng
giai đoạn nuôi cấy khác nhau; nghiên cứu đã xây
dựng được nguồn nguyên liệu cây in vitro có
sinh trưởng tốt dùng cho nghiên cứu tạo rễ tơ
nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ở giai
đoạn tiếp theo.
Đã tạo được 5 dòng rễ tơ qua xử lý gây
nhiễm và nuôi chung mẫu lá với 2 chủng vi
khuẩn Agrobacterium rhizogenes ATCC 11325
và ATCC 15834. Các dòng rễ tơ này mang nhiều
lông hút, có khả năng tăng sinh khối nhanh và ổn
định khi được nuôi lắc (ở điều kiện tối) trong môi
trường MS không bổ sung chất điều hòa sinh
trưởng.
Lời cảm ơn: Các tác giả chân thành cảm ơn
Phòng thí nghiệm trọng điểm phía Nam về công
a b
Bui Dinh Thach et al.
168
nghệ tế bào thực vật đã tạo điều kiện thuận lợi
về trang thiết bị để thực hiện nghiên cứu này.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Abebe D., Ayehu A., 1993. Medicinal plants
and enigmatic health practices of northern
Ethiopia. BSPE, Addis Ababa.
2. Aditi G., Anjali G., Singh J., 1999. New
naphtoquinones from Plumbago zeylanica.
Pharm. Biol., 37: 321-323.
3. Bhargava S. K., 1994. Effects of plumbagin
on reproductive function of male dog.
Indian J. Exp. Biol., 22: 153-156.
4. Didery N., Dubrevil L., Pinkas M., 1994.
Activity of anthraquinonic and
naphtoquinonic compounds on oral bacteria.
Die Pharm., 49: 681-683.
5. Duraga R., Sridhar P., Polasa H., 1990.
Effect of plumbagin on antibiotic resistance
in bacteria. Indian J. Med. Res., 91: 18-20.
6. Idayat T., Gbadamosi, Egunyomi A., 2010.
Micropropagation of Plumbago zeylanica L.
(Plumbaginaceae) in Ibadan, Southwestern,
Nigeria. J. Med. Plant Res., 4(4): 293-297.
7. Kitanow G. M., Pashankov P. P., 1994.
Quantitative investigation on the dynamics of
plumbagin in Plumbago europea L. roots and
herb by HPLC. Pharmazie, 49: 462.
8. Kubo I., Uchida M., Klocke J. K., 1983. An
insect ecolysis inhibitor from the African
medicinal plant, Plumbago capsensis
(Plumbaginaceae). Agric. Biol. Chem., 47:
911-913.
9. Mohana K., Purushothoman K. K., 1980.
Plumbagin: a study of its anticancer,
antimicrobial and antifungal properties.
Indian J. Exp. Biol., 18: 876-888.
10. Murashige T., Skoog F., 1962. A revised
medium for rapid growth and bioassays with
tobacco tissue cultures. Physiol. Plant., 15:
473-479.
11. Parimala R., Sachdanandam P., 1983. Effect
of plumbagin on some glucose metabolizing.
J. Ethnopharmacol., 37: 85-91.
12. Ram A., 1996. Effect of Plumbago
Zeylanica in hyperlipidaemic rabbits and its
modification by vitamin E. Indian J.
Pharmacol., 28:161-166.
13. Rang D. D., Dung N. X., 1996. Chemical
constituents of Plumbago zeylanica. J. of
Chemicals (Vietnam), 34: 67-70.
14. Satheeshkumar K., Jose B., Soniya E. V. and
Seeni S., 2009. Isolation of morphovariants
through plant regeneration in Agrobacterium
rhizogenes induced hairy root cultures of
Plumbago rosea L. Indian J. Biotechnol., 8:
435-441.
15. Sivanesan I., Jeong B. R., 2009. Induction
and establishment of adventitious and hairy
root cultures of Plumbago zeylanica L. Afr.
J. Biotechnol., 8(20): 5294-5300.
16. Sivanesan I., Jeong B. R., 2009.
Micropropagation of Plumbago zeylanica L..
Afr J. Biotechnol., 8(16): 3761-3768.
17. Sivanesan, 2007. Shoot regeneration and
somaclonal variation from leaf callus cultures
of Plumbago zeylanica Linn. Asian J. Plant
Sci., 6(1): 83-86.
18. Verma P. C., Singh D., Rahman L. U.,
Gupta M. M. and Banerjee S., 2002. In
vitro-studies in Plumbago zeylanica: rapid
micropropagation and establishment of
higher plumbagin yielding hairy root
cultures. J. Plant Physiol., 159: 547-552.
19. Vijver L. M, Looter A. P., 1971. The
constituents of the roots of Plumbago
auriculata and P. zeylanica responsible for
antimicrobial activity. Plant Med., 20: 8-13.
20. Wei X., Gou X., Yuan T. and Russell S. D.,
2006. A highly efficient in vitro plant
regeneration system and Agrobacterium-
mediated transformation in Plumbago
zeylanica. Plant Cell Rep., 25: 513-521.
TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 161-169
169
CREATION OF IN VITRO MATERIALS AND INITIAL STUDY
OF CREATING HAIRY ROOT FROM Plumbago zeylanica L.
Bui Dinh Thach, Nguyen Minh Hieu, Pham Thi Phuong Uyen,
Ngo Ke Suong, Nguyen Huu Ho
Institute of Tropical Biology, VAST
SUMMARY
Plumbago zeylanica L. is a medicinal plant that contains high levels of the active ingredient plumbgin.
With the goal of creating raw materials in vitro, 20-minute disinfection time, 10% solution is the optimum
level to create templates in vitro (41.29%), MS medium supplemented with 1.5 mg/L BA and 0.1 mg L IBA
create optimal shoots (4.67 shoots/sample) after 4 weeks of culture. In vitro shoots developed into the best
tree in each MS supplemented with 0.1 mg / L IBA. Two strains of Agrobacterium rhizogen ATCC-15834
and ATCC-11325 used for transgenic stimulation ofhairy roots from in vitro leaves. The initial results have
been selected for hairy root 5 lines.
Keywords: Agrobacterium rhizogen, Plumbago zeylanica, hairy root, in vitro.
Ngày nhận bài: 21-6-2012
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- 1796_5754_1_pb_8994_2180561.pdf