Tài liệu Tăng sinh vi khuẩn Pseudomonas fluorescens trên môi trường LB: 44
3.3.2.1 Tăng sinh vi khuẩn Pseudomonas fluorescens trên môi trường LB
Bộ mẫu Pseudomonas fluorescens được giữ - 70oC, do các anh chị trước đã phân
lập và giữ nguồn. Các dòng được chọn từ bộ mẫu này được đem ra rã đông và tăng
sinh trên môi trường LB. Phần sinh khối thu được dùng cho việc ly trích và giữ làm bộ
mẫu nguồn riêng phục vụ cho việc thiết lập qui trình.
Sử dụng micropipette 10 – 100 µl, hút 10 µl dịch khuẩn cho vào ống nghiệm đựng
5 ml môi trường LB đã hấp vô trùng, đậy lại bằng nút bông. Các ống nghiệm này được
gói lại thành bó và cho vào tủ lắc định ôn, nhiệt độ nuôi là 27oC, tốc độ lắc là 150
vòng / phút. Sau 48 giờ tăng sinh, dịch khuẩn thu được đem đi ly tâm để thu sinh khối.
3.3.2.2 Ly trích genomic DNA từ các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens
* Qui trình ly trích
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng phương pháp tách chiết DNA theo
phương pháp sử dụng CTAB / NaCl đã có cải tiến, qui trình thực hiện như sau:
1. Sử dụng sinh khối...
13 trang |
Chia sẻ: hunglv | Lượt xem: 1575 | Lượt tải: 0
Bạn đang xem nội dung tài liệu Tăng sinh vi khuẩn Pseudomonas fluorescens trên môi trường LB, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
44
3.3.2.1 Tăng sinh vi khuẩn Pseudomonas fluorescens trên môi trường LB
Bộ mẫu Pseudomonas fluorescens được giữ - 70oC, do các anh chị trước đã phân
lập và giữ nguồn. Các dòng được chọn từ bộ mẫu này được đem ra rã đông và tăng
sinh trên môi trường LB. Phần sinh khối thu được dùng cho việc ly trích và giữ làm bộ
mẫu nguồn riêng phục vụ cho việc thiết lập qui trình.
Sử dụng micropipette 10 – 100 µl, hút 10 µl dịch khuẩn cho vào ống nghiệm đựng
5 ml môi trường LB đã hấp vô trùng, đậy lại bằng nút bông. Các ống nghiệm này được
gói lại thành bó và cho vào tủ lắc định ôn, nhiệt độ nuôi là 27oC, tốc độ lắc là 150
vòng / phút. Sau 48 giờ tăng sinh, dịch khuẩn thu được đem đi ly tâm để thu sinh khối.
3.3.2.2 Ly trích genomic DNA từ các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens
* Qui trình ly trích
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng phương pháp tách chiết DNA theo
phương pháp sử dụng CTAB / NaCl đã có cải tiến, qui trình thực hiện như sau:
1. Sử dụng sinh khối vi khuẩn đã được tăng sinh ở trên để tiến hành ly trích
genomic DNA.
2. Thu sinh khối vi khuẩn bằng cách ly tâm 10000 vòng/5phút/4oC. Rửa sinh khối
thu được với 1 ml nước cất hai lần vô trùng và đánh tan bằng vortex (3 lần).
3. Hoà tan sinh khối vi khuẩn thu được trong 567 µl dung dịch TE và đánh tan
bằng vortex, thêm 30 µl dung dịch SDS 10 % và đánh tan bằng vortex. Sau đó ủ ở
37
o
C khoảng 1 - 2 giờ.
4. Cho thêm vào 100 µl dung dịch NaCl 5M, hòa tan thật kỹ bằng vortex.
5. Thêm vào 80 µl dung dịch CTAB / NaCl (khoảng 1 / 10 thể tích). Pha trộn (đánh
tan bằng vortex), ủ ở 65oC trong 10 phút.
6. Thêm 780 µl dung dịch hổn hợp chloroform / isoamyl alcohol (24 : 1 ; v/v). Hòa
lẫn đều bằng lắc tay, ly tâm 10 phút ở 12000 vòng/ 4oC.
7. Thu hết dung dịch bên trên (dung dịch DNA) cho vào ống ly tâm mới (nếu
không thể phân biệt mặt phân cách chung giữa các dung dịch, có thể ly tâm lần nữa
ở tốc độ lớn hơn).
8. Chiết xuất dung dịch DNA với phenol / chloroform / isoamyl alcohol (25 : 24 :
1; v/v). Hòa lẫn đều bằng cách lắc tay, ly tâm 14000 vòng/10 phút /4oC.
9. Thu lấy dung dịch bên trên cho vào ống ly tâm mới (khoảng 500 µl). Kết tủa
DNA với isopropanol, dùng khoảng 0,6 thể tích cùa dung dịch (khoảng 300 µl) và
45
ủ ở tủ - 20oC / 30 phút. Sau đó ly tâm 12000 vòng/10 phút /4oC, lấy kết tủa sau khi
ly tâm.
10. Rửa kết tủa bằng cồn 70% (khoảng 500 µl). Tốt hơn có thể dùng ethanol 70 %
được làm lạnh ở - 20 oC, nghiêng nhẹ qua lại, ly tâm 13000 vòng/10 phút/4oC. Đổ
cồn ra hết và làm khô bằng cách cho cồn bay hơi.
11. Hòa tan kết tủa trong 40 µl dung dịch TE 1X, đem mẩu giữ ở tủ 4oC trong suốt
thời gian thử nghiệm.
* Kiểm tra kết quả ly trích genomic DNA
Chuẩn bị gel agarose 0,8%
Cân 0,1 g agarose cho vào 12,5 ml TAE 0,5X, lắc nhẹ cho agarose phân tán đều,
đem đun trong lò viba ở 650 W, 2 phút. Để nguội, đổ vào khuôn có gắn lược với số
giếng mong muốn. Chờ gel đông (thường 30 phút), rút lược ra và bắt đầu tiến hành
nạp mẫu.
Nạp mẫu, xác lập các thông số điện di và đọc kết quả
Hút 2 µl genomic DNA đã ly trích ở trên, trộn đều với 2 µl đệm tải mẫu (loading
buffer) 6X, sau đó hút hỗn hợp dung dịch bơm vào giếng tương ứng với số mẫu đã xác
lập trước của gel agarose 0,8 %. Gel được đặt trong đệm TAE 0,5 X, hiệu điện thế 100
V, 250 mA và thời gian chạy là 15 phút. Sau đó, gel được lấy ra và nhuộm trong
ethidium bromide 10 phút, rửa sạch và xem kết quả ly trích bằng máy Gel Doc 2000,
sử dụng phần mềm Quatity One 2000 (Bio - Rad).
3.3.2.3 Hiệu chỉnh nồng độ và định lượng DNA bằng phân tử Mass
* Hiệu chỉnh nồng độ
Từ các mẫu DNA đã được ly trích, chọn một mẫu DNA có nồng độ loãng nhất
trong các mẫu còn lại dựa trên kết quả kiểm tra sản phẩm ly trích genomic DNA bằng
điện di làm mẫu chuẩn. Cũng từ đó, ta tính được số lần cần pha loãng của các mẫu có
nồng độ cao so với mẫu chọn làm chuẩn.
Mẫu được chọn làm chuẩn phải có nồng độ sử dụng được, không nên quá loãng, vì
như thế sẽ gây khó khăn trong quá trình tiến hành các thử nghiệm đòi hỏi phải sử dụng
nồng độ DNA tương đối lớn như thực hiện phản ứng cắt genomic DNA.
* Định lượng DNA bằng phân tử Mass
Chuẩn bị gel agarose 2%
46
Cân 0,2 g agarose cho thêm vào 10 ml TAE 0,5X, lắc cho agarose phân tán đều,
đem đun trong lò viba ở 500 W, cứ mỗi phút đem ra xem agarose tan hoàn toàn chưa.
Khi agarose thật sự tan hết trong TAE, để nguội, đổ vào khuôn với lược 6 giếng. Chờ
gel đông khoảng 30 phút, sau đó tiến hành nạp mẫu.
Thiết lập phương pháp định lượng bằng phân tử Mass
Giếng đầu tiên và giếng cuối cùng sử dụng Mass, các giếng còn lại theo thứ tự sử
dụng một mẫu genomic DNA bất kì đã hiệu chỉnh nồng độ được pha loãng theo cách
sau:
4 µl DNA đã hiệu chỉnh nồng độ + 4 µl nước cất hai lần vô trùng
4 µl DNA đã hiệu chỉnh nồng độ + 8 µl nước cất hai lần vô trùng
4 µl DNA đã hiệu chỉnh nồng độ + 12 µl nước cất hai lần vô trùng
4 µl DNA đã hiệu chỉnh nồng độ + 16 µl nước cất hai lần vô trùng
4 µl DNA đã hiệu chỉnh nồng độ + 20 µl nước cất hai lần vô trùng
4 µl DNA đã hiệu chỉnh nồng độ + 24 µl nước cất hai lần vô trùng
Nạp mẫu, xác lập các thông số điện di và đọc kết quả
Giếng 1: hút 2 µl phân tử Mass, trộn đều với 2 µl loading dye 6X, hút hỗn hợp
dung dịch bơm vào giếng 1.
Giếng 2: hút 1 µl phân tử Mass, trộn đều với 2 µl loading buffer 6X, hút hỗn hợp
dung dịch bơm vào giếng cuối cùng.
Các giếng còn lại theo thứ tự là mẫu DNA gốc trước khi pha loãng, kế đến là các
mẫu pha loãng 1 lần, 2 lần, 3 lần, 4 lần , 5 lần , 6 lần, 7 lần, 8 lần với thể tích như sau:
2 µl mẫu + 2 µl loading buffer, trộn đều và bơm vào với giếng tương ứng.
Điều kiện chạy trong đệm TAE 0,5X, ở hiệu điện thế 70 V trong 60 phút. Sau đó,
gel được nhuộm ethidium bromide trong 15 phút và đem ra rửa thật kỹ bằng nước
sạch. Đọc gel bằng máy Gel Doc 2000 và phân tích kết quả.
3.3.2.4 Thiết lập phản ứng cắt genomic DNA bằng enzyme giới hạn
* Thiết lập phản ứng
Sử dụng enzyme cắt giới hạn BamH I, Eco RV và Hind III để cắt genomic DNA,
chúng tôi đã thiết lập phản ứng cắt ở hai thể tích khác nhau 25 µl và 50 µl như sau:
47
Bảng 3.1 Thành phần phản ứng cắt với tổng thể tích phản ứng là 25 µl.
BamH I Eco RV Thể tích
DNA DNA 5 µl
10X đệm BamH I 10X đệm Eco RV 2.5 µl
Enzyme BamH I Enzyme Eco RV 0.1 µl
Nước Nước 17.4 µl
Tổng cộng 25 µl
Phản ứng được ủ ở 37oC trong 2 giờ.
Thể tích các thành phần phản ứng cắt ở bảng 3.1 được thực hiện theo khuyến
cáo chỉ dẫn của nhà sản xuất.
Bảng 3.2 Thành phần phản ứng cắt với tổng thể tích phản ứng là 50 µl.
BamH I Eco RV Hind III Thể tích
DNA DNA DNA 30 µl
10X đệm BamH I 10X đệm Eco RV 10X đệm Hind III 5 µl
Enzyme BamH I Enzyme Eco RV Enzyme Hind III 1 µl
Nước Nước Nước 14 µl
Tổng cộng 50 µl
Phản ứng được ủ ở 37oC qua đêm.
Thể tích các thành phần phản ứng cắt ở bảng 3.2 đã được thay đổi.
Các thành phần trên đã được khảo sát và hiệu chỉnh cho phản ứng cắt tốt nhất.
* Trộn phản ứng cắt
Đầu tiên cần xác định lượng sản phẩm cắt cần sử dụng, tính toán thể tích hút, số
phản ứng và điều chỉnh nhiệt độ ủ ở bồn ủ water bath. Thông thường, người ta hay
trộn các thành phần chung trong một hỗn hợp rồi mới phân chia thành các phản ứng
riêng lẻ. Tiến hành trộn phản ứng cắt theo thứ tự sau:
- Hút nước
- Hút dung dịch đệm của enzyme
- Hút enzyme
48
- Trộn các thành phần trên thật nhẹ và đều, phân chia ra các eppendorf dùng
để thực hiện phản ứng cắt.
- Bơm mẫu DNA vào các eppendorf đã trộn ở trên, đậy nắp kỹ và đem đi ủ ở
nhiệt độ thích hợp.
* Kiểm tra kết quả phản ứng cắt
Bố trí mẫu
Bố trí giống như phương pháp định lượng DNA bằng phân tử Mass, giếng đầu tiên
và giếng cuối cùng là genomic DNA lúc chưa thực hiện phản ứng cắt, các giếng còn
lại là sản phẩm cắt của các mẫu. Cũng có thể bố trí theo kiểu xen kẻ, liên tiếp nhau
mẫu DNA chưa cắt, đến mẫu sản phẩm cắt.
Nạp mẫu, chạy điện di, đọc kết quả
Hút 4 µl mẫu, trộn đều với 2 µl loading buffer 6X, bơm vào giếng tương ứng đã bố
trí. Thực hiện điện di trên gel agarose 0,8 % trong đệm TAE 0,5X, hiệu điện thế 50 V
trong 90 phút. Xem kết quả cắt bằng cách nhuộm gel trong ethidium bromide 10 phút,
rửa sạch và đọc kết quả bằng phần mềm Quatity One của máy Gel Doc 2000 (Bio-
Rad).
3.3.2.5 Thực hiện phản ứng PCR khuếch đại gen phlD trên hai cặp primer
B2BF, BRR4 và phl- 2a, phl- 2b.
Trong vi khuẩn có lợi, gen mã hóa các đặc tính thường là một tổ hợp các gen có
chức năng khác nhau, trong đó một số gen đóng vai trò quan trọng trong quá trình mã
hóa các chất kháng sinh chính và một số gen có vai trò mã hóa các chất phụ như là các
chất xúc tác phản ứng tổng hợp chất kháng sinh chính.
Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng các kết quả nghiên cứu đã được công bố
để thiết lập các primer chuyên biệt dùng để phát hiện các gen mã hóa các chất kháng
sinh và dùng dòng vi khuẩn P. fluorescens 2P24 cung cấp bởi tiến sỹ Zhang, Liqui Đại
học Nông Nghiệp Bắc Kinh, Trung Quốc làm dòng vi khuẩn đối chứng.
- Cặp primer ngoài: Khuếch đại trình tự 745 bp
Phl - 2a: GAGGACGTCGAAGACCACCA
Phl - 2b: ACCGCAGCATCGTGTATGAG
- Cặp primer trong: Khuếch đại trình tự 629 bp
B2BF: ACCCACCGCAGCATCGTTTATGAGC
BRR4: CGCCGGTATGGAAGATGAAAAAGTC
49
Trình tự primer được thiết kế trên gen phlD
* Thực hiện phản ứng PCR
DNA 1 µl
10X PCR buffer 2,5 µl
dNTP 2,5 µl
MgCl2 0,75 µl
Primer 1 1 µl
Primer 2 1 µl
iTaq 0,1 µl
H2O 16,15 µl
Tổng thể tích 25 µl
Các thành phần trên đã được khảo sát và làm tối ưu các điều kiện để tạo ra kết quả
ổn định và lượng sản phẩm khuếch đại thu được nhiều.
Hình 3.2 Tổ hợp 6 gen sinh tổng hợp chất 2,4 – DAPG
Trong đó gen phlD tổng hợp monoacetylphloroglucinol (MAPG) và các gen
phlA, phlC, phlB cần thiết cho quá trình chuyển đổi MAPG thành DAPG. Sử dụng
cặp primer Phl2a và Phl2b phát hiện 2,4 – DAPG.
50
* Chương trình khuếch đại PCR
Thực hiện theo các bước sau: Biến tính hoàn toàn DNA khuôn ở 94oC trong 3 phút;
lặp lại 30 chu kỳ với các bước: biến tính ở 94oC trong 1 phút, bắt cặp giữa primer và
khuôn ở 56oC trong 45 giây, kéo dài sợi DNA ở 72oC trong 1 phút. Sau khi kết thúc
các chu kỳ, mẫu được giữ ở 72oC trong 10 phút để Taq DNA polymerase tổng hợp
hoàn chỉnh các đoạn còn dang dở. Giữ mẫu ở 4oC cho đến khi phân tích.
* Điện di và phân tích kết quả
Sản phẩm của phản ứng PCR được phân tích trên gel agarose 0,8 %. Quá trình thực
hiện như sau: 4 µl sản phẩm khuếch đại được nhuộm với 2µl đệm tải mẫu (loading
buffer), trộn thật đều và bơm hỗn hợp vào giếng trên gel. Quá trình điện di được thực
hiện với hiệu điện thế 100 V, 250 mA trong 20 phút. Nhuộm gel với dung dịch
ethidium bromide trong 5 – 10 phút, rửa thật kỹ bằng nước sạch, đem đọc kết quả
trong hệ thống máy GELDOC 2000 (Bio - Rad).
Mẫu được coi là dương tính khi xuất hiện sản phẩm khuếch đại với kích thước 745
bp với cặp primer phl – 2a, phl – 2b và 629 bp với cặp primer B2BF, BRR4; Mẫu
được coi là âm tính khi không có sản phẩm khuếch đại hay sản phẩm không có kích
thước tương ứng như trên.
3.3.2.6 Tinh sạch sản phẩm PCR bằng phương pháp cắt gel
* Qui trình thực hiện
1. Mẫu cần được tinh sạch (thường là sản phẩm PCR) được đem chạy điện di trên
gel agarose 0,8 % tan ở nhiệt độ thấp. Gel sau khi chạy điện di, được nhuộm
ngắn (1 - 2 phút) trong ethidium bromide nồng độ thấp, sau đó rửa gel bằng
nước sạch và rửa lại bằng nước cất vô trùng, gel được đặt trên máy chiếu UV
đã được bọc kỹ bằng saran wrap và phủ lên trên bởi giấy bạc được cắt một lổ có
kích thước bằng miếng gel.
2. Bật UV, định vị band cần lấy, dùng dao lam cắt gel chứa band DNA cần được
tinh sạch, cho vào eppendorf 1,5 ml. Sử dụng cân phân tích để xác định trọng
lượng gel chứa band vừa cắt ở trên.
3. Dùng micropipette hút capture buffer theo mg/v (10 mg gel ≈ 10 µl capture
buffer), đậy nắp eppendorf đem ủ ở 60oC trong 5 phút, lấy ra vortex nhẹ và tiếp
tục ủ ở 60oC cho đến khi agarose tan hết (5 - 15 phút).
4. Đem ly tâm 3000 vòng / 30 giây để tập trung mẫu ở đáy eppendorf.
51
5. Hút mẫu cho vào cột GFX, ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút.
6. Đem ly tâm 10000 vòng / 30 giây.
7. Cho thêm vào cột 500 µl wash buffer, ly tâm 10000 vòng / 30 giây.
8. Lấy cột ra và đặt vào eppendoft 1,5 ml mới.
9. Hút 20 µl elution buffer nhỏ vào cột GFX, ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút.
10. Ly tâm 10000 vòng / 1 phút, lấy cột GFX ra, đậy nắp eppendorf và đem mẫu
giữ ở 4oC.
Những điều cần lưu ý khi tinh sạch sản phẩm từ gel
- Khi nhỏ elution buffer phải nhỏ ở giữa cột, từng giọt một.
- Khi rửa cột bằng wash buffer hoặc khi thêm capture buffer phải nhỏ từ từ trên
thành của cột.
- Cân eppendorf trước khi tiến hành cắt gel.
- Sử dụng low melting agar.
- Sau quá trình ủ 60oC agarose phải tan hết.
- Máy điện di cần được rửa sạch trước khi sử dụng
- Bảng gel cần được rửa sạch bằng nước cất vô trùng.
- Sử dụng ethidium bromide loãng hơn ½ nồng độ thường dùng (15 µl ethidium
bromide + 300 ml TAE 0,5), phải đựng hộp riêng, phải thay mới khi nhuộm mẫu.
Thời gian nhuộm mẫu ngắn.
- Thời gian mẫu tiếp xúc dưới tia UV trong quá trình cắt ngắn (< 40 giây).
3.3.2.7 Thực hiện đánh dấu sản phẩm PCR của cặp primer B2BF, BRR4
Chúng tôi sử dụng sản phẩm PCR đã được tinh sạch có trình tự là 629 bp để tạo
probe, trình tự này là sản phẩm khuếch đại của cặp primer trong B2BF và BRR4.
Trước khi thực hiện phản ứng đánh dấu cần phải pha loãng dung dịch cross - linker
thành dung dịch có nồng độ sử dụng, dung dịch này có thể bảo quản lạnh 2 – 8oC trong
một tuần. Bên cạnh đó, DNA cũng cần phải được pha loãng với nước tới nồng độ
10 ng / µl dùng để đánh dấu (nồng độ muối trong mẫu DNA nên được giữ ở mức thấp
nhất, không quá 50 mM). Thực hiện phản ứng đánh dấu theo kit của Amersham gồm
các bước như sau:
1. Cho 10 µl DNA đã pha loãng vào eppendorf 200 µl và làm biến tính hoàn toàn
bởi nhiệt độ bằng cách đun 5 – 7 phút trong nước đang sôi mạnh.
52
2. Làm lạnh nhanh trên đá trong 5 phút, đem ly tâm nhanh ở tốc độ 4000 vòng/30
giây để dồn dung dịch xuống đáy ống.
3. Thêm 10 µl dung dịch đệm phản ứng reaction buffer (có sẵn trong bộ kit) vào
DNA đã được làm lạnh. Đảo trộn nhẹ cho đều, phản ứng nên giữ trên đá.
4. Thêm 2 µl chất đánh dấu labelling reagent (có sẵn trong bộ kit), trộn nhẹ, đều.
5. Thêm 10 µl dung dịch phản ứng cross - linker. Trộn đều, ly tâm nhanh 4000
vòng / 30 giây để dồn hỗn hợp xuống đáy.
6. Ủ 30 phút ở 37oC cho phản ứng xảy ra.
7. Probe có thể được dùng ngay hoặc giữ trên đá đến 2 giờ. Trong trường hợp
muốn bảo quản lâu hơn, probe đã đánh dấu được giữ trong 50 % glycerol ở - 15oC
đến - 30oC trong 6 tháng (không cần xử lý gì thêm dung dịch probe này sau khi bảo
quản).
3.3.2.8 Tạo mẫu lai
* Điện di sản phẩm cắt DNA bằng enzyme giới hạn
Chúng tôi thực hiện điện di trên gel agarose 0,8 % trong đệm TAE 0,5X, với kích
thước gel 6 cm x 6 cm, gel được gắn lược 6 giếng, thực hiện bố trí như sau:
Giếng 1: Hút 4 µl 100 bp PCR Molecular Ruler (Bio - Rad) + 2 µl loading buffer,
trộn đều trước khi bơm vào giếng.
Giếng 2: Hút 4 µl sản phẩm PCR dùng tạo probe sử dụng như một đối chứng
dương + 2 µl loading buffer, trộn đều trước khi bơm vào giếng.
Giếng 3, 4, 5, 6: Hút 18 µl mẫu (sản phẩm của enzyme cắt) + 2 µl loading buffer,
trộn đều trước khi bơm vào giếng.
Tiến hành điện di ở hiệu điện thế là 50 V, trong 90 phút. Sau đó, gel được đem
nhuộm ngắn trong ethidium bromide trong 1 - 2 phút, rửa sạch và chụp gel lấy lại
hình ảnh để biện luận kết quả. Miếng gel đó sẽ được làm biến tính trước khi chuyển
lên màng (chú ý miếng gel trước khi chuyển lên màng không nên để lâu trong không
khí vì như thế sẽ làm cho bề mặt miếng gel bị khô và ảnh hưởng không tốt đến quá
trình chuyển lên màng. Thời gian giữ gel là 15 - 30 phút khi nó được ngâm trong dung
dịch đệm)
* Chuyển DNA từ gel lên màng bằng hiện tượng mao dẫn hướng lên
Làm biến tính gel trước khi chuyển lên màng
53
Sau khi hoàn thành giai đoạn điện di, gel được giữ trong dung dịch đệm TAE 0,5X.
Chúng tôi thực hiện biến tính gel như sau:
1. Đổ bỏ đệm TAE 0,5X, rửa lại miếng gel bằng nước cất và đổ bỏ phần nước rửa.
2. Đổ vào khoảng 150 ml dung dịch đệm biến tính (NaOH 0,5 M; NaCl 0,15 M),
phải xem kỹ đảm bảo rằng miếng gel đã được phủ hoàn toàn bởi dung dịch, đem
lắc nhẹ 15 phút ở nhiệt độ phòng, đổ
bỏ phần dung dịch đó đi.
3. Lặp lại bước trên.
4. Rửa lại gel bằng nước cất vô trùng,
đổ bỏ phần nước rửa.
5. Đổ vào khoảng 150 ml dung dịch
đệm trung tính (Tris – HCl 0,5 M;
NaCl 0,15 M; pH 7,0), miếng gel
cũng phải được ngấm hoàn toàn trong
dung dịch, đem lắc nhẹ 15 phút ở
nhiệt độ phòng, đổ bỏ phần dung dịch
đó đi.
6. Lặp lại bước trên.
Trong thời gian này chuẩn bị màng, dung
dịch chuyển, giấy thấm, hệ thống mao
dẫn và các dụng cụ cần thiết khác.
Thực hiện chuyển lên màng bằng
phương pháp mao dẫn (thiết bị chuyển
lên màng đã được cải tiến)
Khi đã hoàn thành giai đoạn biến tính,
tiến hành chuyển lên màng theo các bước
sau:
1. Dùng hộp nhựa hình chủ nhật (20 cm x 10 cm) có chứa 250 ml đệm SSC 6X,
phía trên có đặt một tấm mica (12 cm x 11,5 cm) làm bệ của hệ thống mao dẫn.
2. Cắt một tấm giấy lọc có kích thước phù hợp (17 cm x 8 cm) được làm ướt bằng
dung dịch SSC 2X, phủ đều trên tấm mica (tránh có bọt khí, nếu có bọt khí dùng
Hình 3.3 Hệ thống mao dẫn chuyển DNA
lên màng Hybond N chưa hoàn chỉnh
Hình 3.4 Hệ thống chuyển DNA lên
màng Hybond N hoàn chỉnh
54
que thủy tinh gạt theo một chiều) và hai đầu giấy ngấm vào trong dung dịch đệm
để làm cầu mao dẫn.
3. Úp ngược miếng gel và đặt lên trên giấy
lọc, giữa miếng gel và giấy lọc tránh có bọt
khí.
4. Đặt màng Hybond N có kích thước (6 cm
x 6 cm) được làm ướt bằng SSC 2X lên trên
miếng gel tránh để bọt khí.
5. Đặt hai tấm giấy lọc có kích thước 6 cm x
6 cm được làm ướt bằng dung dịch SSC 2X
lên trên màng.
6. Đặt một chồng giấy thấm có kích thước 6
cm x 6 cm với độ cao vừa phải lên trên giấy
lọc, màng và gel.
7. Trên cùng được đặt vài miếng mica để giữ
hệ thống và tạo lực mao dẫn.
8. Khoảng trống xung quanh hộp nhựa được
phủ bằng saran wrap, giảm sự tác động của
môi trường xung quanh. Hệ thống được giữ
qua đêm (16 giờ).
Làm khô màng
Sau 16 giờ , chúng ta tiến hành làm khô
màng theo cách sau:
1. Loại bỏ các thành phần ở trên cho đến khi
tới màng thì dừng lại.
2. Dùng kẹp giữ một góc màng và làm dấu
bề mặt chứa DNA của màng (Hình 3.3).
3. Đặt màng vào trong tủ sấy, màng được ủ ở
65
oC trong khoảng 1 giờ cho đến khi các
góc màng co lại là được (Hình 3.5).
Cố định DNA trên màng
Hình 3.5 Đánh dấu bề mặt chứa
DNA của màng Hybond - N
Hình 3.7 Để màng Hybond N vào
máy GS Gene Linker TM UV chuẩn
bị xử lý UV
Hình 3.6 Làm khô màng
Hybond N bằng tủ sấy ở 65 oC
55
Màng sau khi được làm khô, được đem xử lý dưới UV trong tủ GS GENE
LINKER
TM
UV CHAMBER (Bio - Rad) trong 50 giây (chú ý bề mặt DNA của màng
hướng lên). Sau đó màng được đem ra để chuẩn bị lai (hoặc cũng có thể giữ lại trong
hộp kín cho đến khi tiến hành lai).
3.3.2.9 Lai Southern
* Thực hiện phản ứng lai
Trước khi thực hiện phản ứng lai, xác lập nhiệt độ của buồng lai là 55oC, đồng thời
làm nóng dung dịch đệm lai ở 55oC. Song song đó, chúng tôi tính toán các thông số
sau:
Diện tích màng: 6 x 6 x 2 = 72 (cm2 )
Thể tích đệm lai: 0.25 x 72 = 18 (ml)
Nồng độ probe cần: 10 x 18 = 180 (ng)
Thể tích probe: 180 / 10 =18 (µl)
* Qui trình thực hiện phản ứng lai
Bước 1: Tiền lai
Khi nhiệt độ của buồng lai đạt ổn định ở
55
oC và dung dịch đệm lai cũng đã được
làm nóng đến 55oC, tiến hành rửa ống lai
bằng nước cất vô trùng, sau đó bơm vào ống
lai 10 ml dung dịch đệm lai. Dùng kẹp đặt màng vào ống lai sao cho bề không có DNA
tiếp xúc với thành ống lai. Bên cạnh đó, dùng một ống lai khác cũng bơm vào đó 10
ml nước. Đặt hai ống lai vào buồng lai theo cách đối song, đậy cửa buồng lai lại và
điều chỉnh số vòng quay ở mức trung bình. Thời gian cho bước này là 15 phút.
Bước 2: Lai
Trộn 8 ml dung dịch đệm lai với 18 µl probe, bơm hỗn hợp vào giữa ống lai (tránh
nhỏ trực tiếp lên màng). Để phản ứng qua đêm (12 giờ).
* Rửa màng sau khi lai
Trước khi rửa màng cần làm nóng dung dịch rửa 1 (primary wash buffer) đến 55oC.
Thực hiện rửa màng theo các bước sau:
1. Loại bỏ dung dịch đệm lai, thêm vào ống lai khoảng 20 ml dung dịch rửa 1.
Nhiệt độ và số vòng quay của buồng lai giống như khi lai, thời gian rửa là 10 phút.
2. Lặp lại bước trên cũng trong 10 phút.
Hình 3.8 Phản ứng lai trong buồng lai
HB – 1000 Hybridizer ở 55 oC .
56
3. Loại bỏ dung dịch rửa 1, dùng kẹp gấp màng ra và cho vào hộp nhựa sạch với bề
có DNA nằm trên. Cho vào đó dung dịch rửa 2 (secondary wash buffer) khoảng 50
ml, lắc nhẹ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút.
4. Lặp lại bước trên trong 10 phút. Lúc này màng có thể được giữ trong dung dịch
rửa 2 trong 30 phút để chuẩn bị cho bước phát hiện.
* Phát hiện kết quả trên phim X - ray
Chuẩn bị màng với chất phát hiện CDP - Star
Màng sau khi được rửa lần 2, sẽ được phủ lên trên một lớp dịch của chất phát hiện,
chất này làm cho các phân tử probe phát sáng. Các bước thực hiện như sau:
1. Dùng saran wrap trải trên một mặt phẳng nằm ngang, phẳng, có phủ một lớp
khăn giấy.
2. Lấy màng từ trong dung dịch rửa 2 ra, phải ráo và đặt lên trên miếng saran wrap
với bề có DNA hướng lên trên.
3. Hút 1 µl chất phát hiện CDP- Star nhỏ lên trên màng.
4. Dùng một tấm saran wrap khác phủ bề mặt màng, trải đều chất phát hiện bằng
que thủy tinh, tránh để lại bọt khí.
5. Sau đó màng lai được lấy ra, và đặt ở giữa hai miếng saran wrap mới với kích
thước phù hợp (chú ý trong quá trình thao tác với màng không để màng bị khô).
Ủ màng với phim trong cassette
Màng được đặt giữa Cassette 30 x 40 Konica, sau đó đặt một tấm phim Konica 30
x 40 cm lên trên màng tránh sự dịch chuyển của màng. Đậy cassette lại và tính thời
gian ủ 30 phút hoặc 1 giờ (thường phản ứng sẽ có tín hiệu sáng tốt nhất sau 1 giờ từ
khi cho chất phát hiện vào). Tùy theo tính chất probe mà thời gian ủ phản ứng phát
hiện khác nhau. Các thao tác trên được thực hiện trong buồng tối.
Rửa phim và làm khô
Khi đã hoàn thành giai đoạn ủ phim với màng, phim sẽ được đem ra khỏi cassette
và ngâm trong dung dịch developer trong 5 phút. Sau đó, lấy phim ra và ngâm trong
dung dịch fixer khoảng 3 phút. Cuối cùng đem phim ra rửa dưới vòi nước sạch và
dùng kẹp treo lên giá làm khô ở nhiệt độ phòng. Chú ý các thao tác trên đều được thực
hiện trong buồng tối, khi phim đã ngâm xong trong dung dịch fixer có thể đem phim ra
ngoài sáng để rửa dưới vòi nước.
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- phan2.pdf