Tác dụng hướng estrogen của viên nang cứng từ lá chùm ngây (moringa oleifera lam.) trên chuột nhắt trắng bị cắt buồng trứng

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 Nghiên cứu Y học 83 TÁC DỤNG HƯỚNG ESTROGEN CỦA VIÊN NANG CỨNG TỪ LÁ CHÙM NGÂY (MORINGA OLEIFERA LAM.) TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG BỊ CẮT BUỒNG TRỨNG Nguyễn Thị Thu Hương*, Mai Thành Chung* TÓM TẮT Mục tiêu nghiên cứu: Viên nang cứng từ lá Chùm ngây (trồng tại tỉnh An Giang) được nghiên cứu thực nghiệm tác dụng estrogen với mục đích cung cấp các dữ liệu khoa học cho ứng dụng lá Chùm ngây trong việc nâng cao chất lượng sống của phụ nữ ở giai đoạn tiền mãn kinh và mãn kinh. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Chuột nhắt trắng cái chủng Swiss albino được cắt bỏ 2 buồng trứng (gây giảm năng sinh dục) sau 15 ngày được chia ngẫu nhiên thành các lô chứng (uống nước cất), lô thử (uống viên nang Chùm ngây) và lô đối chiếu (uống estradiol valerat). Sau 15 ngày dùng thuốc, giải phẫu cân trọng lượng tử cung và định lượng nồng độ 17β-estradiol trong huyết tương. Tiến hành song song với các lô chuột bình thường. Kết quả: Viên nang Chùm ngây ở liều uống 1 và 2 viên/kg trọng lượng chuột (tương đương với liều được quy đổi trên người là 4 - 8 viên/ngày) không ảnh hưởng trên trọng lượng tử cung của chuột bình thường và chuột giảm năng sinh dục. Trên chuột bình thường, viên nang Chùm ngây không ảnh hưởng trên nồng độ 17β- estradiol trong huyết tương chuột. Trên chuột giảm năng sinh dục, viên nang Chùm ngây liều 2 viên/kg làm tăng nồng độ 17β-estradiol trong huyết tương (tăng 56,15%), đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng giảm năng sinh dục và phục hồi về giá trị sinh lý. Kết luận: Viên nang từ lá Chùm ngây ở liều uống 2 viên/kg trọng lượng chuột thể hiện tác dụng estrogen qua việc phục hồi nồng độ estradiol trong huyết tương chuột nhắt trắng cái bị giảm năng sinh dục do cắt 2 buồng trứng. Từ khóa: Lá Chùm ngây, chuột cắt bỏ buồng trứng, tác dụng estrogen. ABSTRACT THE ESTROGENIC EFFECTS OF HARD CAPSULE FROM MORINGA OLEIFERA LEAVES IN OVARIECTOMIZED MICE Nguyen Thi Thu Hương, Mai Thanh Chung * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol. 22 - No 5- 2018: 83 – 87 Objectives: Moringa capsules made from Moringa oleifera leaves harvested in An Giang province were subjected to study its estrogenic effects in order to provide scientific data for the application of Moringa oleifera leaves as nutraceutical in the life quality of premenopausal/menopause women. Methods: 15-day after ovariectomy, female Swiss albino mice were randomly divided into control groups (distilled water), test groups (Moringa capsules) or positive control groups (estradiol valerate). After 15-day administration, the uterus weights and plasma 17β-estradiol levels were determined. Results: Moringa capsules at the oral dose of 1 to 2 capsules/kg mouse body weight (equivalent to 4 to 8 capsules/day on human dosage based on conversion coefficient) did not effect on the uterus weights of naïve mice and ovariectomized mice. Moringa capsules did not change plasma 17β-estradiol levels in naïve mice. In ovariectomized mice, Moringa capsules at dose of 2 capsules/kg elevated plasma 17β-estradiol levels reached  Trung Tâm Sâm và Dược liệu TP. Hồ Chí Minh - Viện Dược liệu Tác giả liên lạc: PGS.TS. Nguyễn Thị Thu Hương ĐT: 02838274377 Email: huongsam@hotmail.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 84 56.15% significant increase as compared to ovariectomized controls and restored to the normal values. Conclusions: Moringa capsules at dose of 2 capsules/kg mouse body weight had estrogenic effect by the increase of plasma 17β-estradiol levels in ovariectomized mice. Keywords: Moringa oleifera leaves, ovariectomized mice, estrogenic effect. ĐẶT VẤN ĐỀ Thời kỳ tiền mãn kinh, mãn kinh là một sự chuyển tiếp tự nhiên mà tất cả phụ nữ phải trải qua trong cuộc đời, xảy ra do sự suy giảm chức năng buồng trứng dẫn đến việc sản xuất hormon sinh dục nữ (estrogen) bị giảm. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), độ tuổi mãn kinh trung bình của phụ nữ là 51 tuổi và khoảng tuổi phổ biến nhất mà phụ nữ trải qua thời kỳ mãn kinh là 48 - 55 tuổi. Trong giai đoạn này cơ thể người phụ nữ có nhiều thay đổi, rối loạn tâm sinh lý và tăng nguy cơ các bệnh lý khác. Liệu pháp hormon thay thế giúp cải thiện các rối loạn này và nâng cao chất lượng sống của người phụ nữ nhưng cũng dẫn đến nhiều tác dụng phụ có thể gây nguy hiểm(1). Do đó, việc tìm đến các phytoestrogen trong tự nhiên, có tính an toàn đang là xu hướng phổ biến hiện nay. Cây Chùm ngây (Moringa oleifera Lam.) là một trong số những thảo dược có giá trị trong chữa bệnh cũng như bổ sung dinh dưỡng cho cơ thể. Nhiều nghiên cứu thực nghiệm và lâm sàng cho thấy bột lá và các cao chiết từ lá Chùm ngây có tác dụng bảo vệ tế bào theo hướng chống tổn thương oxy hóa, tác dụng kháng viêm, giảm đau, chống loét dạ dày, tác dụng hạ huyết áp, tăng cường miễn dịch, tác dụng ổn định đường huyết và điều hòa rối loạn lipid máu(11). Ở Việt Nam, lá Chùm ngây được sử dụng như là một thức uống dinh dưỡng hơn là tạo những sản phẩm theo hướng hỗ trợ điều trị. Nghiên cứu trước đây của Trung tâm Sâm và Dược liệu TP.HCM cho thấy các cao chiết từ lá Chùm ngây (được thu hái tại Huyện Tri Tôn, Tỉnh An Giang) thể hiện tác dụng nội tiết tố sinh dục nữ (tác dụng kiểu estrogen)(2,7), tác dụng tăng lực, bảo vệ gan trước tổn thương gan thực nghiệm gây bởi paracetamol(5) và tác dụng điều hòa đường huyết trên chuột nhắt cái bị cắt buồng trứng và có bệnh cảnh tăng đường huyết(4). Nghiên cứu gần đây đã chứng minh tác dụng hạ đường huyết và điều hòa lipid máu của chế phẩm từ lá Chùm ngây (viên nang Chùm ngây)(3,6). Kế thừa các kết quả nghiên cứu về Chùm ngây, đề tài này được thực hiện nhằm khảo sát tác dụng estrogen của viên nang Chùm ngây trên chuột nhắt trắng cái. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Viên nang cứng Chùm ngây được bào chế ở quy mô pilot từ cao chiết cồn lá Chùm ngây (cao chiết đã được tiêu chuẩn hóa với hàm lượng isoquercitrin là 0,263%) và đạt tiêu chuẩn cơ sở của Trung tâm Sâm và Dược liệu Tp. Hồ Chí Minh. Chế phẩm từ lá Chùm ngây được khảo sát ở các liều tương đương với liều dự kiến sử dụng trên người tính theo hệ số quy đổi là 1 viên và 2 viên/kg trọng lượng chuột. Động vật nghiên cứu Chuột nhắt trắng cái, chủng Swiss albino, 5 - 6 tuần tuổi, được cung cấp bởi Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế – TP. Nha Trang. Chuột được nuôi bằng thực phẩm viên, nước uống đầy đủ và được để ổn định ít nhất một tuần trước khi thử nghiệm. Chuột được cho uống mẫu thử với thể tích là 10 ml/kg trọng lượng chuột. Gây mô hình chuột nhắt trắng giảm năng sinh dục Thiết kế nghiên cứu thực nghiệm, đo lường độc lập đánh giá sự thay đổi trọng lượng tử cung và nồng độ 17β-estradiol trong huyết tương của chuột bị cắt 2 buồng trứng (giảm năng sinh dục) so với chứng sinh lý (chuột bình thường). Tác dụng của cao chiết trên các thay đổi này được so sánh thống kê với lô chứng (không điều trị) và với lô thuốc đối chiếu (estrogen tổng hợp). Chuột nhắt cái được gây mê bằng ether, Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 Nghiên cứu Y học 85 dùng chỉ cột một phần ống dẫn trứng lại sau đó cắt bỏ 2 buồng trứng. Khâu vết mổ bằng chỉ vô trùng và sát trùng vết thương bằng dung dịch cồn iod (Povidine®). Chuột sau khi cắt buồng trứng được chăm sóc và để ổn định trong 2 tuần. Sau 2 tuần, khảo sát vết phết dịch nhờn âm đạo trong 5 ngày để xác định chuột đã bị cắt bỏ hoàn toàn buồng trứng. Loại bỏ các động vật có các vết phết động dục dương tính (giai đoạn estrus) trong 3 ngày cuối(8). Tác động kiểu estrogen của cao Chùm ngây được đánh giá qua sự thay đổi trọng lượng tử cung ở chuột bình thường và ở chuột bị cắt 2 buồng trứng. Chuột bình thường và chuột bị giảm năng sinh dục được chia lô (n = 8-10) và được cho uống nước cất (lô chứng), viên nang Chùm ngây (lô thử) hay Progynova® (chứa estradiol valerat 2 mg/viên, Bayer Co. Germany; lô đối chiếu) trong 15 ngày. 24 giờ sau lần dùng thuốc cuối cùng, giải phẫu và xác định trọng lượng tử cung [g %, (Trọng lượng tử cung/trọng lượng chuột) x 100]. Song song, lấy máu tĩnh mạch đuôi chuột đem định lượng nồng độ 17β- estradiol trong huyết tương theo protocol của bộ Kit ELISA của Genway Ltd. Co., USA. Định lượng 17β-estradiol trong huyết tương bằng kỹ thuật ELISA Bảng 1. Quy trình định lượng (theo hướng dẫn của Bộ kit E2-EASIA, Genway Ltd. Co., USA) Calibrator (µL) Mẫu huyết tương (µL) Chuẩn (calibrator) Mẫu Estradiol-HRP Anti-estradiol 50 - 50 50 - 50 50 50 Ủ trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng và lắc ngang liên tục ở 700 rpm. Hút bỏ toàn bộ thể tích trong mỗi giếng. Rửa 5 lần với 0,4 ml dung dịch rửa (Wash Buffer) Dung dịch cơ chất TMB (Tetramethylbenzidine) 200 µL 200 µL Ủ trong 30 phút ở nhiệt độ phòng và lắc ngang liên tục ở 700 rpm H2SO4 1,8 N 50 µL 50 µL Đọc độ hấp thu ở bước sóng 450 nm trong vòng 1 giờ sau khi thêm dung dịch dừng phản ứng. Nồng độ 17β-estradiol trong huyết tương chuột được nội suy từ phương trình logarithm: y = 89,16e-0,00x với R² = 0,986. Đánh giá kết quả Các số liệu được biểu thị bằng trị số trung bình: M ± SEM (Standard error of the mean – sai số chuẩn của giá trị trung bình) và xử lý thống kê dựa vào phép kiểm One–Way ANOVA và Student-Newman-Keuls test (phần mềm SigmaStat 3.5, Systat Software, Inc., USA.). Kết quả thử nghiệm đạt ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95% khi p < 0,05 so với lô chứng. KẾT QUẢ-BÀN LUẬN Kết quả ở Bảng 2 cho thấy trọng lượng tử cung của lô chứng giảm năng sinh dục giảm 42,95%, đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng bình thường. Estradiol valerat làm tăng trọng lượng tử cung của chuột bình thường và chuột bị gây giảm năng sinh dục (p < 0,001). Viên nang Chùm ngây không ảnh hưởng trên trọng lượng tử cung của chuột bình thường và chuột giảm năng sinh dục, cho thấy chế phẩm chưa thể hiện tác dụng kiểu estrogen trên sự phát triển của tử cung chuột. Bảng 2. Trọng lượng tử cung của chuột bình thường và chuột bị gây giảm năng sinh dục sau dùng thuốc 15 ngày Lô (n=10) Trọng lượng tử cung (g%) Chuột bình thường Chuột giảm năng sinh dục Chứng 0,156 ± 0,008 0,089 ± 0,011 ### Viên nang Chùm ngây (1 viên/kg) 0,141 ± 0,006 0,107 ± 0,013 ## Viên nang Chùm ngây (2 viên/kg) 0,148 ± 0,005 0,064 ± 0,004 ### Estradiol valerat 0,5 mg/kg 0,608 ± 0,057 ### 0,219 ± 0,013 *** (##) p < 0,01, (###) p < 0,001 so với lô chứng bình thường. (***) p< 0,001 so với lô chứng giảm năng sinh dục. Kết quả Bảng 3 cho thấy lô chứng giảm năng sinh dục có nồng độ 17β-estradiol trong huyết tương giảm 45,91%, đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng bình thường. Estradiol valerat làm tăng nồng độ 17β-estradiol trong huyết tương của chuột bình thường và chuột giảm năng sinh dục (p < 0,001). Trên chuột bình thường, viên nang Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 86 Chùm ngây không ảnh hưởng trên nồng độ 17β- estradiol trong huyết tương chuột. Lô chuột giảm năng sinh dục và được cho uống viên nang Chùm ngây liều 1 viên/kg có nồng độ 17β-estradiol trong huyết tương không khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng giảm năng sinh dục và khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng bình thường, cho thấy viên nang Chùm ngây ở liều này chưa thể hiện tác dụng trên sự suy giảm nồng độ 17β-estradiol trong huyết tương chuột bị cắt 2 buồng trứng. Nồng độ 17β-estradiol trong huyết tương của lô chuột giảm năng sinh dục và được cho uống viên nang Chùm ngây liều 2 viên/kg tăng 56,15%, đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng giảm năng sinh dục và phục hồi về giá trị sinh lý, cho thấy viên nang Chùm ngây ở liều này thể hiện tác dụng điển hình hơn liều 1 viên/kg trên sự suy giảm nồng độ 17β-estradiol trong huyết tương chuột bị cắt 2 buồng trứng (Bảng 3). Bảng 3. Nồng độ 17β-estradiol của các lô chuột bình thường và chuột bị gây giảm năng sinh dục sau dùng thuốc 15 ngày Lô (n=10) Nồng độ 17β-estradiol (pg/ml) Chuột bình thường Chuột giảm năng sinh dục Chứng 27,36 ± 3,29 14,80 ± 0,083 ### Viên nang Chùm ngây (1 viên/kg) 24,86 ± 1,91 19,79 ± 2,40 # Viên nang Chùm ngây (2 viên/kg) 24,61 ± 2,89 23,31 ± 2,22 ** (56,15%) Estradiol valerat 0,5 mg/kg 57,58 ± 2,04 ### (110,45%) 61,57 ± 5,22 *** (316,0%) (##) p < 0,01, (###) p < 0,001 so với lô chứng bình thường. (*) p< 0,05, (***) p< 0,001 so với lô chứng giảm năng sinh dục. (...): Tỷ lệ % tăng so với lô chứng tương ứng. BÀN LUẬN Các nghiên cứu in vivo để khảo sát tác dụng kiểu estrogen của những phytoestrogen thường lựa chọn các khảo sát trên loài gặm nhấm và trên các đối tượng như: động vật chưa trưởng thành (hoạt động của nội tiết tố sinh dục chưa hoàn chỉnh), động vật bị hủy tuyến yên (cơ quan trung ương điều hành hoạt động của các cơ quan sinh dục) hay động vật bị gây giảm năng sinh dục (động vật bị cắt hai buồng trứng để loại ảnh hưởng của các estrogen nội sinh). Kết quả khảo sát trước đây cho thấy cao Chùm ngây có tính an toàn và có thể hiện tác dụng kiểu estrogen điển hình trên mô học nội mạc tử cung chuột cống trắng bị cắt hai buồng trứng với 70% số chuột có sự xuất hiện ưu thế của tế bào biểu mô vảy, tương tự như tác dụng của estrogen tổng hợp estradiol valerat (100% số chuột có sự xuất hiện ưu thế của tế bào biểu mô vảy). Kết quả mô học nội mạc tử cung của lô chuột cống non uống cao Chùm ngây có sự tăng sinh tế bào biểu mô vảy nhanh hơn so với lô chứng uống nước cất (7). Kết quả nghiên cứu của đề tài cũng tương đồng với các nghiên cứu trước(9,10), cho thấy viên nang Chùm ngây liều 2 viên/kg, uống trong 15 ngày phục hồi sự suy giảm nồng độ 17β-estradiol trong huyết tương chuột bị cắt 2 buồng trứng và không gây ảnh hưởng trên nồng độ 17β- estradiol trong huyết tương chuột bình thường. Kết quả này cho thấy ưu điểm của viên nang Chùm ngây so với estradiol valerat, một estrogen tổng hợp thể hiện tác dụng estrogen trên cả chuột bình thường và chuột giảm năng sinh dục. Kết quả này hướng tới triển vọng ứng dụng lâm sàng viên nang Chùm ngây để cải thiện chất lượng sống của phụ nữ trong thời kỳ tiền mãn kinh và mãn kinh, giúp hạn chế được những tác dụng phụ không mong muốn của liệu pháp hormon thay thế. Kết quả của đề tài còn cho thấy viên nang Chùm ngây liều 2 viên/kg sau 15 ngày uống không ảnh hưởng trên trọng lượng tử cung chuột bình thường và chuột giảm năng sinh dục. Tuy nhiên dựa vào kết quả khảo sát độc tính bán trường diễn cho thấy viên nang Chùm ngây liều 2 viên/kg sau 2 tháng uống làm tăng trọng lượng buồng trứng-tử cung trên chuột bình thường, có thể đặt ra giả thuyết là tác dụng của viên nang Chùm ngây trên sự phát triển tử cung chuột nhắt trắng chỉ xuất hiện sau thời gian sử dụng dài. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 Nghiên cứu Y học 87 KẾT LUẬN Viên nang từ lá Chùm ngây ở liều uống 2 viên/kg trọng lượng chuột thể hiện tác dụng estrogen qua việc phục hồi nồng độ estradiol trong huyết tương chuột nhắt trắng cái bị giảm năng sinh dục do cắt 2 buồng trứng. LỜI CÁM ƠN: Bài báo này là một phần kết quả của đề tài Nghiên cứu khoa học mã số 373.2015.9 thuộc Sở Khoa học và Công nghệ Tỉnh An Giang, được cấp kinh phí từ Ủy Ban Nhân dân tỉnh An Giang theo Quyết định số 2572/QĐ ngày 13/11/2015. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Cobin RH, Goodman NF; AACE Reproductive Endocrinology Scientific Committee (2017). “American Association of Clinical Endocrinologists (AACE)/American College of Endocrinology (ACE) Position Statement on menopause-2017 update”. Endocr Pract; 23(7):869-880. 2. Đỗ Minh Anh, Nguyễn Văn Nghi, Nguyễn Thị Thu Hương (2012). “Tác dụng kiểu nội tiết tố sinh dục nữ của cao chiết từ lá Chùm ngây“. Tạp chí Dược liệu; 17(2): 73-77. 3. Nguyễn Thị Thu Hương, Chung Thị Mỹ Duyên, Nguyễn Thị Ngọc Đan (2017). “Tác dụng điều hòa lipid máu của chế phẩm từ lá Chùm ngây (Moringa oleifera Lam.) trên chuột nhắt trắng bị gây tăng lipid máu bằng tyloxapol”. Y học TP. Hồ Chí Minh; 21(6): 49-54. 4. Nguyen Thi Thu Huong, Huynh Nha Van, Le Quang Binh (2013). “Hypoglycemic effects of Moringa oleifera leaves extract on ovariectomized mice”. Proceedings of The Eighth Indochina Conference; 676-680. 5. Nguyễn Thị Thu Hương, Nguyễn Hoàng Minh, Nguyễn Lĩnh Nhân, Lý Hải Triều, Nguyễn Thị Ngọc Đan (2016). “Khảo sát tác dụng tăng lực và bảo vệ gan của lá Chùm ngây (Moringa oleifera Lam.) trên thực nghiệm”. Y học TP. Hồ Chí Minh; 20(6): 222-227. 6. Nguyễn Thị Thu Hương, Nguyễn Hoàng Minh, Nguyễn Thị Ngọc Đan (2017). “Nghiên cứu thực nghiệm tác dụng bảo vệ gan của chế phẩm từ lá Chùm ngây (Moringa oleifera Lam.) trên tổn thương gan mạn do ethanol”. Y học TP. Hồ Chí Minh; 21(6): 125-130. 7. Nguyễn Thị Thu Hương, Phạm Thị Nguyệt Hằng, Đỗ Thị Phương (2014). “Tác dụng của cao chiết cồn từ lá Chùm ngây trên nội mạc tử cung chuột cống trắng giảm năng sinh dục”. Tạp chí Dược liệu; 19(2): 67-73. 8. OECD (2007). Uterotrophic bioassay in rodents: A short-term screening test for oestrogenic properties. OECD guideline for the testing of chemicals No.440. 9. Shukla S, Mathur R, Prakash AO (1988). “Biochemical and physiological alterations in female reproductive organs of cyclic rats treated with aqueous extract of Moringa oleifera Lam”. Acta Eur. Fertil.; 19: 225–232. 10. Shukla S, Mathur R, Prakash AO (1989). “Histoarchitecture of the genital tract of ovariectomized rats treated with an aqueous extract of Moringa oleifera roots”. J. Ethnopharmacol.; 25(3): 249- 261. 11. Stohs SJ, Hartman MJ (2015). “Review of the Safety and Efficacy of Moringa oleifera”. Phytotherapy Res.; 29(6): 796-804. Ngày nhận bài báo: 25/04/2018 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 20/06/2018 Ngày bài báo được đăng: 20/09/2018