Sulforaphane ức chế pma hoạt hóa sự biểu hiện của phân tử kết dính liên bào (ICAM-1) trên tế bào nội mô ECV304 thông qua con đường tín hiệu ROS, NF-ΚB và AP-1

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ bản Tập 21 * Số 3 * 2017 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2017 168 SULFORAPHANE ỨC CHẾ PMA HOẠT HÓA SỰ BIỂU HIỆN CỦA PHÂN TỬ KẾT DÍNH LIÊN BÀO (ICAM-1) TRÊN TẾ BÀO NỘI MÔ ECV304 THÔNG QUA CON ĐƯỜNG TÍN HIỆU ROS, NF-ΚB VÀ AP-1 Phạm Ngọc Khôi* TÓM TẮT Đặt vấn đề: Bệnh lý xơ vữa động mạch là một bệnh do quá trình viêm lâu dài xảy ra trên thành động mạch. Sự hoạt động của tế bào nội mô thành động mạch trong bệnh lý xơ vữa đã được chứng minh trong nhiều năm có liên quan trực tiếp đến sự biểu hiện của phân tử kết dính liên bào (intercellular adhesion molecule-1, ICAM- 1), được xem như là nguyên nhân gây tăng sự kết dính nội bào làm tổn thương lòng động mạch trong bệnh lý trên. Vì vậy, việc ức chế chức năng của phân tử ICAM-1 được xem là một mục tiêu quan trọng trong điều trị bệnh lý viêm của xơ vữa động mạch. Mục tiêu: Trong nghiên cứu này, chúng tôi khảo sát sự ảnh hưởng của sulforaphane, một hợp chất isothiocyanate được tìm thấy trên rau cải xanh, lên sự biểu hiện của ICAM-1 trong nuôi cấy tế bào nội mô mạch máu ở người. Phương pháp nghiên cứu: Kỹ thuật nuôi cấy tế bào nội mô, khảo sát sự biểu hiện gen và protein ICAM-1 cũng như thí nghiệm kiểm tra sự bám dính tế bào đã được sử dụng trong nghiên cứu này khi thử nghiệm với sulforaphane và đối chứng âm. Kết quả: Chích thử nghiệm sulforaphane (0 - 50 μM) trong 1 giờ lên trên tế bào nội mô mạch máu cho thấy giảm sự biểu hiện rõ rệt của phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) lên sự bám dính của tế bào bạch cầu mono THP-1 lên trên tế bào nội mô thông qua cơ chế giảm biểu hiện của gen và protein ICAM-1. Bên cạnh đó, sulforaphane còn ức chế PMA tạo ra reactive oxygen species (ROS) nội bào, ức chế sự hoạt hóa của con đường tín hiệu nội bào NF-κB và AP-1. Kết luận: Nghiên cứu này đã chứng minh sulforaphane có khả năng ức chế sự bám dính tế bào lên trên tế bào nội mô ECV304 và giảm sự biểu hiện của PMA tạo ra tín hiệu ICAM-1 thông qua việc kìm hãm sự sản xuất ROS nội bào, con đường tín hiệu NF-κB và AP-1. Vì thế, sulforaphane có thể có hiệu quả tốt trong việc giảm viêm trong bệnh lý xơ vữa động mạch. Từ khóa: Sulforaphane, ICAM-1, ROS, NF-κB, AP-1, tế bào nội mô. ABSTRACT SULFORAPHANE INHIBITS PMA INDUCED INTERCELLULAR ADHESION MOLECULE-1 (ICAM-1) EXPRESSION IN HUMAN ECV304 ENDOTHELIAL CELLS: EFFECTS ON ROS, NF-κB AND AP-1 ACTIVATION PATHWAYS Pham Ngoc Khoi * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement Vol. 21 - No 3 - 2017: 168 - 174 Background: Atherosclerosis is a long-term inflammatory disease of the arterial wall. Endothelial activation, identified by intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) expression, is present in atherosclerotic, and is considered to increase neointima or atherosclerotic lesion formation. Therefore, the functional inhibition of adhesion molecules could be a critical therapeutic target of inflammatory disease. *Bộ môn Mô Phôi - Di truyền, Đại học Y khoa Phạm Ngọc Thạch, TP.HCM Tác giả liên lạc: TS. Phạm Ngọc Khôi ĐT: 0909 097 802 Email: pnkhoi@pnt.edu.vn Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ bản Tập 21 * Số 3 * 2017 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2017 169 Objectives: In the present study, we investigate the effect of sulforaphane, an isothiocyanate found in cruciferous vegetables, on the expression of ICAM-1 induced by phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) in cultured human endothelial cell line. Methods: Human ECV304 endothelial cells culture, ICAM-1 gene and protein expression, inhesion assay are used for this study. Results: Pretreatment of human ECV304 endothelial cell for 1 h with sulforaphane (0 - 50 μM) dose- dependently inhibited PMA-induced adhesion of THP-1 monocytic cells, gene and protein expression of ICAM-1. Furthermore, sulforaphane also suppressed PMA-induced production of intracellular ROS, NF- κB and AP-1 activation. Conclusions: This study suggested that sulforaphane inhibited the adhesive capacity of ECV304 and down regulates the PMA-mediated induction of ICAM-1 in ECV304 by inhibiting intracellular ROS production, NF- κB and AP-1 signaling pathways. Thus, sulforaphane may have beneficial effects to suppress inflammation within the atherosclerotic lesion. Keywords: Sulforaphane, ICAM-1, ROS, NF-κB, AP-1, endothelial cell. MỞ ĐẦU Xơ vữa động mạch là tình trạng động mạch bị xơ cứng và lòng mạch bị tắc hẹp bởi những mảng xơ vữa làm hạn chế lưu lượng máu dẫn đến thiếu máu nuôi các cơ quan trong cơ thể. Đây là một bệnh lý diễn tiến chậm, âm ỉ qua nhiều năm, nguyên nhân chủ yếu là do chất mỡ thặng dư đọng vào thành mạch, qua nhiều cơ chế phức tạp, lâu dần đọng thêm calci tạo thành những mảng xơ vữa ổn định hoặc không ổn định(2,9). Cơ chế tạo mảng xơ vữa cũng đã giải thích là do các tế bào nội mô mạch máu điều hòa sự di chuyển của bạch cầu vào tổ chức thông qua các phân tử kết dính. Các phân tử này điều chỉnh sự kết dính bạch cầu với nội mô mạch máu bằng cách gắn các kích thích (ligand) đặc hiệu lên bạch cầu. Lúc này, tế bào nội mô mạch máu sẽ tiết ra E-selectin, P-selectin, phân tử kết dính liên bào loại 1 (intercellular adhesion molecule-1, ICAM- 1) và phân tử kết dính tế bào mạch máu loại 1 (vascular cell adhesion molecule, VCAM-1) để kết dính bạch cầu với nội mô mạch máu tạo nên mảng xơ vữa(3,2,5). Vì thế, ICAM-1 được xem như một dấu hiệu tiên lượng xấu cho bệnh lý xơ vữa động mạch. Trong những năm gần đây, các nhà khoa học đã quan tâm nghiên cứu và nhận thấy rằng những hoạt chất sinh học chiết xuất từ thảo dược tự nhiên như trà xanh(7), olive(6), có thể phối hợp tác động toàn diện, giãn mạch, cải thiện tuần hoàn mạch vành, giảm cholesterol máu, chống viêm và thậm chí là ức chế stress nhờ tạo ra mạng lưới chống oxy hóa mạnh mẽ, giúp hỗ trợ điều trị bệnh mạch vành, giảm đau thắt ngực và phòng ngừa nguy cơ nhồi máu cơ tim hiệu quả. Bên cạnh đó, trong những nghiên cứu dịch tễ học gần đây đã cho thấy các loại trái cây tươi và rau quả cũng có vai trò bảo vệ hệ tim mạch rất tốt ví dụ như hợp chất isothiocyanate được tìm thấy trong các loại họ rau cải như bông cải xanh, cải Brussels, súp lơ, bắp cải. Sulforaphane là thành phần isothiocyanate chính được tìm thấy trong số các loại rau họ cải đó và đặc biệt có hàm lượng rất cao trong bông cải xanh và súp lơ xanh đã được chứng minh trong những nghiên cứu gần đây có thể làm giảm nguy cơ của nhiều loại ung thư(1), giúp điều trị bệnh béo phì và tiểu đường(10), chống oxy hóa, giảm tăng huyết áp và viêm trong tuần hoàn mạch máu(11). Mục tiêu nghiên cứu Nghiên cứu này nhằm khảo sát vai trò của hợp chất sulforaphane, một hợp chất isothiocyanate quan trọng được tìm thấy trong rau cải, bông cải xanh ảnh hưởng lên sự biểu hiện của phân tử kết dính liên bào ICAM-1 trong nuôi cấy tế bào nội mô ở người. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ bản Tập 21 * Số 3 * 2017 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2017 170 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Hóa chất Sulforaphane (1-isothiocyanato – 4 - [methylsulfinyl] - butane) và các hóa chất cần thiết sử dụng trong nghiên cứu này được cung cấp từ hãng Sigma-Aldrich (Missouri, Hoa Kỳ). Kháng thể dùng trong thử nghiệm sự biểu hiện protein ICAM-1 được cung cấp từ hãng Cell Signaling Technology (Beverly, MA, Hoa Kỳ). Nuôi cấy tế bào nội mô mạch máu Dòng tế bào nội mô mạch máu ECV304 được cung cấp từ American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA, Hoa Kỳ) được nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) có bổ sung thêm 10% huyết thanh thai bò (fetal bovine serum, FBS) và 1% penicillin - streptomycin ở nhiệt độ 37 oC trong tủ cấy với 5% CO2. Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) Các cặp primer được đưa vào lựa chọn trong nghiên cứu này đều dựa trên trình tự các cặp mồi đã được công bố trên ngân hàng gen NCBI (Hoa Kỳ). Trình tự mẫu dò dùng trong nghiên cứu này bao gồm: ICAM-1 sense, 5’- CGA CTG GAC GAG AGG GAT TG -3’, ICAM-1 antisense, 5’- TTA TGA CTG CGG CTG CTA CC -3’ (289 bp); GAPDH sense, 5’-TTG TTG CCA TCA ATG ACC CC-3’; GAPDH antisense, 5’-TGA CAA AGT GGT CGT TGA GG-3’ (836 bp) (GAPDH được sử dụng như chứng nội tại của các phản ứng PCR trong nghiên cứu này). Western blot Kháng thể ICAM-1, β-actin (chứng nội tại) (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) được sử dụng trong nghiên cứu này với tỷ lệ pha loãng 1:1000 và được phát hiện dựa vào bộ kit ECL (Amersham, Franklin Lakes, NJ, Hoa Kỳ). Đo sự bám dính tế bào bằng tín hiệu huỳnh quang Thí nghiệm đo sự bám dính của tế bào bạch cầu mono THP-1 lên trên tế bào nội mô ECV304 được thực hiện bằng bộ kit 10 ng/mL calcein-AM (Molecular Probes, The Netherlands) theo nghiên cứu trước đó (Park và cộng sự, 2009)(8). Đo sự sản xuất reactive oxygen species (ROS) Sự sản xuất ROS trong tế bào được quan sát bằng kính hiển vi đồng tiêu (confocal microscopy) sử dụng probe 5- và 6-carboxyl-2’, 7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFDA, Molecular Probes, Eugene, OR, Hoa Kỳ) theo nghiên cứu trước đó của cùng tác giả (Khoi và cộng sự., 2013)(4). Đo sự hoạt động của gen báo cáo NF-κB và AP-1 Tế bào nội mô ECV304 lần lượt được chuyển vector mang 1 μg gen báo cáo pGL3-NF-κB và pGL3-AP-1 bằng phương pháp sử dụng Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Các promoter này được sử dụng nhằm đo lường sự hoạt động của NF-κB và AP-1 luciferase khi tế bào được xử lý với sulforaphane. Xử lý thống kê Số liệu được hiển thị thống kê dưới dạng trung bình ±SD và thí nghiệm được lặp lại ít nhất ba lần riêng biệt cho mỗi thí nghiệm. Sự khác biệt của tập hợp dữ liệu được xác định bởi kiểm định Student's t-test. Sự khác biệt này được mô tả với P < 0.05. KẾT QUẢ Ảnh hưởng của sulforaphane lên sự biểu hiện của ICAM-1 trên tế bào nội mô ECV304 Dòng tế bào nội mô ECV304 được xử lý với hoạt chất sulforaphane (30 μM) (hình 1A) trong 0 - 12 giờ, tế bào nội mô được thu hoạch sau thời gian xử lý để kiểm tra sự biểu hiện của gen và protein ICAM-1 bằng phản ứng RT-PCR và Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ bản Tập 21 * Số 3 * 2017 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2017 171 western blot. Kết quả cho thấy, sulforaphane ức chế sự biểu hiện gen và protein ICAM-1 tỷ lệ thuận với thời gian xử lý mẫu (hình 1B và 1C). A B C D E Hình 1: Ảnh hưởng của sulforaphane lên sự biểu hiện của ICAM-1 trên tế bào nội mô ECV304 A B Hình 2: Sulforaphane ngăn chặn sự lên sự bám dính của tế bào bạch cầu mono THP-1 lên trên tế bào nội mô ECV304 thông qua cơ chế giảm biểu hiện của phân tử bám dính ICAM-1. Tương tự như cách làm trên, tế bào nội mô ECV304 được xử lý trước với hoạt chất sulforaphane (0 - 50 μM) trong vòng 1 giờ rồi sau đó được xử lý với PMA trong vòng 4 giờ ở nồng độ 100 nM. PMA được xem như là một chất gây viêm cho tế bào nội mô trong bệnh lý xơ vữa động mạch; sau khi ủ, phản ứng RT-PCR và western blot cũng được tiến hành nhằm kiểm tra sự biểu hiện của gen và protein ICAM-1 trong trường hợp này. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ bản Tập 21 * Số 3 * 2017 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2017 172 A. B. C Hình 3: Sulforaphane ngăn chặn sự biểu hiện của ICAM-1 thông qua con đường hoạt hóa tín hiệu của sự sản xuất ROS nội bào, kích hoạt yếu tố phiên mã NF-κB và AP-1 trên tế bào nội mô ECV304 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ bản Tập 21 * Số 3 * 2017 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2017 173 Kết quả cũng cho thấy sulforaphane ức chế PMA tạo ra tín hiệu ICAM-1 trên tế bào nội mô theo liều lượng sử dụng từ 0 - 50 μM (hình 1D và 1E). Sulforaphane ngăn chặn sự lên sự bám dính của tế bào bạch cầu mono THP-1 lên trên tế bào nội mô ECV304 thông qua cơ chế giảm biểu hiện của phân tử bám dính ICAM-1. Nuôi cấy tế bào nội mô ECV304 trong điều kiện có xử lý trước với sulforaphane (0 - 50 μM) và PMA (100 nM), rồi tiến hành bổ sung vào môi trường nuôi cấy tế bào nội mô dòng bạch cầu mono THP-1 để chứng minh sự bám dính của bạch cầu mono trên tế bào nội mô. Kết quả cho thấy sulforaphane làm giảm rõ rệt sự bám dính của bạch cầu mono trên tế bào nội mô khi chụp dưới kính hiển vi đồng tiêu (hình 2A) và được xử lý số liệu thông qua máy đọc kết quả phát huỳnh quang (hình 2B). Thí nghiệm được lặp lại 3 lần với ±SD. Sự khác biệt của tập hợp dữ liệu được xác định bởi kiểm định Student's t-test. Sự khác biệt này được mô tả với P < 0.05 có ý nghĩa về mặt thống kê. Sulforaphane ngăn chặn sự biểu hiện của ICAM-1 thông qua con đường hoạt hóa tín hiệu của sự sản xuất ROS, kích hoạt yếu tố phiên mã NF-κB và AP-1 trên tế bào nội mô ECV304. Để kiểm tra con đường tín hiệu ROS nội bào, chúng tôi sử dụng nồng độ thay đổi của hoạt chất sulforaphane (0 - 50 μM) trong nuôi cấy tế bào nội mô ECV304 và tiến hành đo tín hiệu ROS nội bào được tạo ra trong đĩa nuôi cấy thông qua định lượng bằng máy đọc kết quả phát huỳnh quang, kết quả cho thấy sulforaphane có khả năng ức chế sự biểu hiện của ICAM-1 thông qua con đường tín hiệu tạo ROS nội bào (hình 3A). Bên cạnh đó, để kiểm tra sulforaphane có ức chế ICAM-1 theo con đường NF-κB và/hay AP-1 hay không, tế bào nội mô ECV304 được tiếp tục thử thuốc với nồng độ sulforaphane (0 - 50 μM) và lần này là kiểm tra độ hoạt động của NF-κB và AP-1 luciferase tương đối (hình 3B và 3C) đã chứng minh rằng yếu tố phiên mã NF-κB và AP- 1 có liên quan mật thiết đến sự ức chế biểu hiện ICAM-1 của sulforaphane trong chuỗi truyền tín hiệu trong nội bào. Như vậy, con đường ức chế sự hoạt hóa biểu hiện của ICAM-1 bằng sulforaphane có thể sẽ theo con đường tín hiệu nội bào ROS, yếu tố phiên mã NF-κB và AP- 1.Thí nghiệm được lặp lại 3 lần với ±SD. Sự khác biệt của tập hợp dữ liệu được xác định bởi kiểm định Student's t-test. Sự khác biệt này được mô tả với P < 0.05 có ý nghĩa về mặt thống kê. KẾT LUẬN Trong nghiên cứu này, lần đầu tiên, vai trò của hoạt chất sulforaphane đã được chứng minh trong việc ức chế sự biểu hiện của phân tử kết dính liên bào ICAM-1 mà hiệu quả có được là hoạt chất này có ý nghĩa trong việc bảo vệ thành mạch trong những bệnh lý xơ vữa động mạch khi thực hiện trên dòng tế bào nội mô mạch máu ECV304 ở người. Nghiên cứu của chúng tôi còn kết luận rằng con đường truyền tín hiệu nội bào của sulforaphane ức chế sự biểu hiện của ICAM-1 nhằm chống xơ vữa động mạch sẽ là: ROS, NF-κB và AP-1. Do đó, khẩu phần ăn bông cải xanh có chứa nhiều hàm lượng hoạt chất sulforaphane được khuyến cáo hứa hẹn sẽ đem đến những tiềm năng mới trong phòng ngừa và điều trị bệnh lý xơ vữa động mạch trong tương lai gần. Lời cảm ơn: Chúng tôi rất biết ơn GS.TS. Young Do Jung (Bộ môn Hóa Sinh, Khoa Y, Đại học Quốc gia Chonnam, Gwangju, Hàn Quốc) đã cố vấn khoa học, giúp đỡ về trang thiết bị thực hiện nghiên cứu này. Nghiên cứu này được tài trợ từ Quỹ Nghiên cứu (0720570) của Trung tâm ung thư Quốc gia (Hàn Quốc), từ Chương trình nghiên cứu khoa học cơ bản của Bộ Giáo dục, Khoa học và Công nghệ Hàn Quốc (2010-0009910) và từ Trung tâm Nghiên cứu Y học (2011- 0030731) của Tổ chức Khoa học và Công nghệ Hàn Quốc. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Clarke JD, Dashwood RH, Ho E. (2008). Multi-targeted prevention of cancer by sulforaphane. Cancer Lett., 269, 291 - 304. 2. Jakab L. (2003). The pathogenesis of atherosclerosis. Orv. Hetil., 144, 1121 - 1128. 3. Jensen HA, Mehta JL. (2016). Endothelial cell dysfunction as a novel therapeutic target in atherosclerosis. Expert Rev. Cardiovasc. Ther., 14, 1021 - 1033. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ bản Tập 21 * Số 3 * 2017 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2017 174 4. Khoi PN, Park JS, Kim NH, Jung YD. (2012). Nicotine stimulates urokinase-type plasminogen activator receptor expression and cell invasiveness through mitogen-activated protein kinase and reactive oxygen species signaling in ECV304 endothelial cells. Toxicol. Appl. Pharmacol., 259, 248 - 256. 5. Kim JY, Park HJ, Um SH, Sohn EH, Kim BO, Moon EY, Rhee DK, Pyo S. (2012). Sulforaphane suppresses vascular adhesion molecule-1 expression in TNF-α-stimulated mouse vascular smooth muscle cells: involvement of the MAPK, NF-κB and AP-1 signaling pathways, Vascul. Pharmacol., 56, 131 - 141. 6. Loffredo L, Perri L, Nocella C, Violi F. (2017). Antioxidant and antiplatelet activity by polyphenol-rich nutrients: focus on extra virgin olive oil and cocoa. Br. J. Clin. Pharmacol., 83, 96 - 102. 7. Myasoedova VA, Kirichenko TV, Melnichenko AA, Orekhova VA, Ravani A, Poggio P, Sobenin IA, Bobryshev YV, Orekhov AN. (2016). Anti-atherosclerotic effects of a phytoestrogen-rich herbal preparation in postmenopausal women. Int. J. Mol. Sci., 17, E1318. 8. Park JS, Kim KM, Kim MH, Chang HJ, Baek MK, Kim SM, Jung YD (2009). Resveratrol inhibits tumor cell adhesion to endothelial cells by blocking ICAM-1 expression. Anticancer Res., 29, 355 - 362. 9. Reiner Z, Tedeschi-Reiner E. (2001). New information on the pathophysiology of atherosclerosis. Lijec Vjesn., 123, 26 - 31. 10. Souza CG, Riboldi BP, Hansen F, Moreira JD, Souza DG., de Assis AM., Brum LM., Perry ML, Souza DO (2013). Chronic sulforaphane oral treatment accentuates blood glucose impairment and may affect GLUT3 expression in the cerebral cortex and hypothalamus of rats fed with a highly palatable diet. Food Funct., 4, 1271 - 1276. 11. Wu L, Noyan Ashraf MH, Facci M, Wang R, Paterson PG, Ferrie A, Juurlink BH. (2004). Dietary approach to attenuate oxidative stress, hypertension, and inflammation in the cardiovascular system. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 101, 7094 - 7099. Ngày nhận bài báo: 02/01/2017 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 17/01/2017 Ngày bài báo được đăng: 20/04/2017