Sự tăng trưởng và tích lũy hợp chất thứ cấp của cây diệp hạ châu đắng nuôi cấy quang tự dưỡng trong điều kiện môi trường giàu CO2 - Phạm Minh Duy

TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 249-256 249 SỰ TĂNG TRƯỞNG VÀ TÍCH LŨY HỢP CHẤT THỨ CẤP CỦA CÂY DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG NUÔI CẤY QUANG TỰ DƯỠNG TRONG ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG GIÀU CO2 Phạm Minh Duy1, Nguyễn Như Hiến1, Hoàng Ngọc Nhung1 Nguyễn Du Sanh2, Nguyễn Thị Quỳnh1* (1)Viện Sinh học Nhiệt đới, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, (*)qtnguyen_vn@yahoo.com (2)Trường đại học Khoa học tự nhiên tp Hồ Chí Minh TÓM TẮT: Nghiên cứu vai trò của khí CO2 lên sự tăng trưởng và tích lũy hợp chất thứ cấp của cây diệp hạ châu đắng in vitro không chỉ có lợi cho việc sản xuất cây in vitro, mà còn cho việc sản xuất hợp chất thứ cấp từ cây in vitro. Đốt thân mang 1 lá của cây diệp hạ châu đắng được nuôi cấy in vitro quang tự dưỡng với mật độ 4 đốt/hộp Magenta GA-7 (V = 370 ml). Nắp hộp có hai lỗ (Φ = 1 cm) và được dán màng Millipore (Φ = 0,45 µm). Môi trường nuôi cấy gồm khoáng đa lượng MS bằng 1/2, vi lượng MS, không bổ sung đường và vitamin. Đốt thân được nuôi 45 ngày trong buồng nuôi cây Percival ở một trong hai nồng độ CO2 (400 µmol mol-1 hoặc 1200 µmol mol-1), dưới cường độ ánh sáng 160 µmol m-2 s-1, thời gian chiếu sáng 16 h d-1, nhiệt độ trong giai đoạn chiếu sáng/tối là 27/22oC và ẩm độ tương đối là 50%. Cây in vitro ngày thứ 45 được đem ra vườn ươm trồng trong 32 ngày. Cây diệp hạ châu đắng tăng trưởng tốt hơn ở nồng độ CO2 cao trong cả giai đoạn in vitro lẫn ex vitro, gia tăng trọng lượng tươi và khô cũng như đường kính thân và chiều dài rễ đều lớn hơn ở công thức có 1200 µmol mol-1 CO2. Các hợp chất lignan của cây diệp hạ châu đắng in vitro, bao gồm phyllanthin, hypophyllanthin và niranthin, có hàm lượng (tương ứng 1,27, 0,51 và 2,01 mg g-1 khô) đều cao hơn so với cây ở nồng độ CO2 thấp (tương ứng 0,57, 0,45 và 1,05 mg g-1 khô) ở ngày thứ 45. Từ khóa: Phyllanthus amarus, dioxit cacbon, hợp chất thứ cấp, hiệu suất quang hợp thuần, ex vitro, in vitro, quang tự dưỡng. MỞ ĐẦU Xu hướng phát triển hiện nay của nền y học trên thế giới là quay về nghiên cứu và sử dụng những loại thuốc bào chế từ các loài cây dược liệu trong thiên nhiên. Cây diệp hạ châu đắng [Phyllanthus amarus (Shumm. et Thonn.)] thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae), là một trong những loài cây dược liệu đang rất được chú ý vì những dược tính quan trọng như chống virus và bảo vệ gan. Loài cây này sống phổ biến ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới của châu Phi, châu Mỹ và châu Á, trong đó có Việt Nam. Diệp hạ châu đắng có chứa rất nhiều hợp chất thứ cấp có dược tính, trong đó, quan trọng nhất là các lignan chỉ có ở chi Phyllanthus như phyllanthin, hypophyllanthin và niranthin. Nhiều nghiên cứu đã khẳng định, những loại lignan này có khả năng ức chế kháng nguyên bề mặt HBsAg của virus HBV [4], giảm đau [5], tăng loại thải uric acid [9] và bảo vệ tế bào gan [7, 2]. Để phục vụ cho việc nghiên cứu và sản xuất dược liệu ở Việt Nam, cây diệp hạ châu đắng đã bắt đầu được đưa vào trồng với số lượng lớn trên đồng ruộng ở một số tỉnh như Phú Yên và Lâm Đồng. Mặc dù vậy, phương pháp canh tác bằng gieo hạt có hiệu quả chưa cao vì tỷ lệ nảy mầm thấp, chất lượng cây giống không đồng đều, hạt bị nhiễm bệnh... Phương pháp nuôi cấy mô có tiềm năng ứng dụng nhằm cung cấp một lượng lớn cây giống đồng đều, sạch bệnh, nhưng vẫn còn một số nhược điểm như cây con chịu sáng kém, thoát hơi nước nhanh, dễ chết khi ra vườn ươm khiến cho việc ứng dụng phương pháp này trong sản xuất vẫn còn hạn chế. Nhiều nghiên cứu đã xác định rằng, những nhược điểm trên bắt nguồn từ việc cây được nuôi cấy trên môi trường có đường, trong bình kín, khiến cho cây quang hợp kém, có nhiều bất thường về sinh lý [6]. Phương pháp nuôi cấy mô quang tự dưỡng là một phương pháp mới, ra đời vào những năm 80 của thế kỷ XX. Phương pháp này cho phép cây in vitro tự quang hợp và sinh trưởng trong điều kiện gần tương tự như ex vitro, giúp giảm những bất thường về hình thái và sinh lý của cây mà phương pháp truyền thống thường gây Pham Minh Duy et al. 250 ra. Nuôi cấy mô quang tự dưỡng có tiềm năng ứng dụng trong việc cung cấp nguồn giống cho canh tác đối với cây diệp hạ châu đắng nói riêng và cây dược liệu nói chung và xa hơn nữa là trong việc sản xuất hợp chất thứ cấp in vitro từ loài cây này. Tuy nhiên, để tối ưu hóa quy trình sản xuất, cần phải có những nghiên cứu chi tiết về ảnh hưởng của các yếu tố môi trường vật lý in vitro, trong đó, có nồng độ CO2 không khí lên sự tăng trưởng và tích lũy hợp chất thứ cấp ở cây diệp hạ châu đắng trong điều kiện nuôi cấy mô quang tự dưỡng. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thí nghiệm gồm hai giai đoạn: (1) nuôi cấy in vitro quang tự dưỡng trong 45 ngày và (2) giai đoạn vườn ươm 32 ngày. Vật liệu nuôi cấy là đốt thân của cây diệp hạ châu đắng in vitro mang một lá mở (khối lượng tươi trung bình 44 mg/đốt, khối lượng khô trung bình 6,25 mg/đốt). Các đốt thân được nuôi cấy trong hộp Magenta GA-7 (Sigma, Hoa Kỳ) với mật độ 4 đốt/hộp. Nắp hộp đục 2 lỗ (ф = 1 cm) giúp sự trao đổi khí, mỗi lỗ được dán một màng Millipore (Nihon Millipore Ltd., Nhật Bản) với đường kính lỗ màng 0,45 µm. Môi trường nuôi cấy bao gồm khoáng đa lượng MS giảm 1/2, vi lượng MS, bổ sung thêm 200 mg/l KNO3 và 200 mg/l KH2PO4. Thể tích môi trường ban đầu là 55 ml/hộp và bổ sung thêm 15 ml/hộp vào ngày thứ 27. Giá thể sử dụng là perlite (Công ty Cell Green, Thuận An, Bình Dương) với khối lượng 29,5 mg/hộp. pH trước khi khử trùng là 5,8. Thí nghiệm gồm hai công thức về nồng độ CO2 (thấp 400 µmol mol-1 hoặc cao 1200 µmol mol-1), mỗi công thức gồm 3 hộp với 3 lần lặp lại. Các hộp được đặt trong tủ khí hậu Percival (model PGC-9/2, Percival Scientific, Inc., Mỹ) dưới cường độ ánh sáng 160 µmol m-2 s-1, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày, nhiệt độ ngày/đêm là 27oC/22oC và ẩm độ tương đối trung bình là 50%. Vào ngày thứ 45, các chỉ tiêu sinh trưởng trong giai đoạn in vitro được thu và hàm lượng một số hợp chất lignan (phyllanthin, hypophyllanthin, niranthin) được xác định bằng phương pháp HPLC với cột RP-18, pha động: MeOH-H2O, detector UV 220 nm và so sánh với các lignan chuẩn ở thời gian lưu 31, 35 và 48 phút. Cây diệp hạ châu đắng in vitro được đưa ra điều kiện vườn ươm trong 32 ngày. Mỗi công thức gồm 10 cây với 3 lần lặp lại. Cây được trồng vào bầu đất chứa giá thể là đất sạch Lavamix (công ty TNHH TM & DV Hữu Thuận) trộn với perlite theo tỉ lệ 3:2 và đặt dưới điều kiện CO2 không khí, ánh sáng (60 µmol m-2 s-1 lúc 8 giờ, 127 µmol m-2 s-1 lúc 12 giờ, 33 µmol m-2 s-1 lúc 16 giờ), nhiệt độ trung bình trong ngày 32,5oC, độ ẩm tương đối trung bình 54%. Cây được phun sương giảm dần từ 5 lần/ngày, mỗi lần 15 phút cho đến khi ngưng phun sương từ ngày 15 trở đi và được thay thế bằng tưới đẫm gốc 2 lần/ngày vào lúc 8 giờ sáng và 16 giờ chiều. Phân N-P-K (20-20-20) được bổ sung thêm với lượng 0,2 g/l vào các ngày thứ 22, 25 và 28, dưới hình thức phun qua lá. Các chỉ tiêu sinh trưởng được đo vào ngày thứ 32. Các số liệu về chỉ tiêu tăng trưởng được xử lý thống kê bằng phần mềm MSTATC (Đại học bang Michigan, Hoa Kỳ). KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Sự tăng cường CO2 trong quá trình nuôi cấy đã cho thấy tác động tích cực rõ rệt lên cây diệp hạ châu đắng nuôi cấy in vitro bằng phương pháp quang tự dưỡng. Gia tăng khối lượng tươi và khô vào ngày thứ 45 của cây diệp hạ châu đắng nuôi cấy trong điều kiện nồng độ CO2 cao đạt tương ứng là 880 mg/cây và 89,4 mg/cây, trong khi, cây nuôi cấy trong điều kiện CO2 thấp chỉ đạt 550 mg/cây và 68,8 mg/cây (bảng 1). Cây nuôi cấy ở nồng độ CO2 cao đạt tốc độ tăng trưởng tương đối đến 0,06 ngày-1, trong khi cây nuôi cấy ở điều kiện bình thường chỉ đạt 0,055 ngày-1. Đường kính thân, chiều dài rễ, chiều cao cây và hàm lượng chlorophyll ở cây dưới điều kiện nồng độ CO2 cao đều lớn hơn so với cây ở nồng độ CO2 thấp (bảng 2). Tuy sự khác biệt nồng độ CO2 không tạo được sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê về số lá mở, kích thước lá ở cây diệp hạ châu đắng lớn hơn một cách rõ rệt khi cây tăng trưởng ở điều kiện nồng độ CO2 cao so với cây ở nồng độ CO2 thấp (hình 1). Ở điều kiện nồng độ CO2 1200 µmol mol-1, hình thái của cây diệp hạ châu đắng nuôi cấy in vitro không cho thấy có sự bất thường nào so với cây nuôi cấy quang tự dưỡng ở nồng độ CO2 thấp. Những kết quả trên cũng tương tự như kết TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 249-256 251 quả của một số tác giả Nguyễn Trí Minh và nnk. (2008) [8] trên cây dâu tây (Fragaria annanassa Duch.), Burikam Chaiyasirisuwan (1991) [1] trên cây đu đủ, Solárová & Pospíšilová (1997) [11] trên cây thuốc lá và cây cẩm chướng, Yoon et al. (2008) [14] trên cây lan hồ điệp. Bảng 1. Gia tăng khối lượng tươi (GTKLT) và khô (GTKLK), % chất khô (CK) và tốc độ tăng trưởng tương đối (RGR) của cây diệp hạ châu đắng nuôi cấy in vitro ở các nồng độ CO2 khác nhau Công thức GTKLT (mg) GTKLK (mg) % CK Số lá mở/cây RGR (ngày-1) CO2 thấp 550 68,8 12,8 11,7 0,055 CO2 cao 880 89,4 10,4 10,7 0,060 ANOVAx ** ** * NS ** CV (%) 2,95 6,18 5,97 10,65 1,87 x NS, *, **: không khác biệt, khác biệt có ý nghĩa ở mức P ≤ 0,05 và 0,01. Bảng 2. Số lá mở/cây, đường kính (ĐK) thân, chiều dài (CD) rễ, chiều cao (CC) cây, hàm lượng chlorophyll (Chl) a + b và tỉ lệ chlorophyll a/b của cây diệp hạ châu đắng nuôi cấy in vitro ở các nồng độ CO2 khác nhau Công thức ĐK thân (mm/cây) CD rễ (mm/cây) CC cây (mm/cây) Chl a + b (mg/g lá khô) Chl a/b CO2 thấp 117 48 83 21,8 2,47 CO2 cao 153 63 117 27,4 2,38 ANOVAx ** ** * ** NS CV (%) 1,91 5,46 9,68 0,23 2,68 x NS, *, **: không khác biệt, khác biệt có ý nghĩa ở mức P ≤ 0,05 và 0,01. Hình 1. Cây diệp hạ châu đắng nuôi cấy ở hai nồng độ CO2 khác nhau ngày thứ 45 CO2 thấp CO2 cao Pham Minh Duy et al. 252 Sự tăng trưởng vượt trội của cây diệp hạ châu đắng ở điều kiện nồng độ CO2 cao có thể do khả năng tự dưỡng của cây gia tăng dẫn đến việc sử dụng CO2 hiệu quả hơn. Theo Kozai & Kubota (2005) [6], nồng độ CO2 trong bình nuôi cấy giảm rất thấp trong giai đoạn chiếu sáng, và điều này làm ức chế khả năng quang hợp của cây, ngay cả khi hộp nuôi cây có màng trao đổi khí. Với phòng nuôi cây có nồng độ CO2 cao, sự thiếu hụt CO2 sẽ được bù đắp và giúp cho sự cố định CO2 từ không khí của cây trong điều kiện nuôi cấy quang tự dưỡng gia tăng, thể hiện bằng sự gia tăng hiệu suất quang hợp thuần (Pn) của cây theo thời gian nuôi cấy (hình 2). Vào ngày thứ 42, hiệu suất quang hợp thuần của cây được nuôi cấy ở nồng độ CO2 cao là 14,51 µmol mol-1 h-1, gấp gần hai lần so với cây được nuôi cấy ở nồng độ CO2 thấp (7,55 µmol mol-1 h-1). Kết quả này tương tự như kết quả của Nguyen et al. (1999) [10] trên cây cà phê (Coffea arabusta) nuôi cấy in vitro quang tự dưỡng, đã chứng minh rằng nồng độ CO2 cao (1400 - 1500 µmol mol-1) làm tăng hiệu suất quang hợp thuần của cây cà phê in vitro. Ngoài ra, nồng độ CO2 cao còn góp phần ức chế quang hô hấp [13], giúp cây tăng hiệu suất sử dụng ánh sáng và giảm lãng phí năng lượng. Bên cạnh đó, George & Davies (2008) [3] cũng ghi nhận rằng, nồng độ CO2 cao (1-10%) có thể ức chế hoàn toàn ảnh hưởng của ethylen lên thực vật. Như vậy, sự tăng trưởng của cây diệp hạ châu đắng ở nồng độ CO2 cao có thể được thúc đẩy do khả năng ức chế của ethylen không còn hiệu lực. 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 15 20 25 30 35 40 45 Ngày Pn (µ m ol m o l-1 h -1 /c ây ) CO2 thấp CO2 cao . Hình 2. Hiệu suất quang hợp thuần (Pn) của cây diệp hạ châu đắng theo thời gian nuôi cấy ở hai nồng độ CO2 khác nhau Khi xác định hàm lượng một số hợp chất lignan trong cây diệp hạ châu đắng nuôi cấy ở hai điều kiện nồng độ CO2, chúng tôi nhận thấy có sự gia tăng rõ rệt trong hàm lượng phyllanthin (hơn hai lần từ 0,57 mg g-1 khô lên 1,27 mg g-1 khô) và niranthin (tăng hai lần từ 1,05 mg g-1 khô lên 2,01 mg g-1 khô), trong khi đó, hàm lượng hypophyllanthin tăng không đáng kể, từ 0,45 mg g-1 khô lên 0,51 mg g-1 khô (hình 3). Sự gia tăng tích lũy các hợp chất lignan có thể là do ở nồng độ CO2 cao, cây tăng cường quang hợp, tạo được nhiều vật chất ở dạng sơ cấp và một phần vật chất này ngay lập tức đã được chuyển hóa thành các hợp chất thứ cấp của cây diệp hạ châu đắng, đó là các lignan. Stuhlfauth et al. (2001) [12] cũng đạt được kết quả tương tự với cây Digitalis lanata, khi nuôi cấy dưới điều kiện tăng cường CO2, cây Digitalis lanata cho sinh khối và lượng cardenolide cao gấp 160% so với bình thường. TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 249-256 253 1.27 0.45 0.51 1.05 0.57 2.01 0 0.5 1 1.5 2 2.5 CO2 thấp CO2 cao Nghiệm thức H àm lư ợ ng li gn an (m g g -1 k hô ) Phyllanthin Hypophyllanthin Niranthin Hình 3. Hàm lượng các hợp chất lignan của cây diệp hạ châu đắng ở hai nồng độ CO2 khác nhau vào ngày thứ 45 Bảng 3. Tỷ lệ sống, gia tăng khối lượng tươi (GTKLT) và khô (GTKLK) và tốc độ tăng trưởng tương đối (RGR) của cây diệp hạ châu đắng nuôi cấy in vitro ở các nồng độ CO2 khác nhau trong giai đoạn ex vitro Công thức Tỉ lệ sống (%) GTKLT (mg) GTKLK (mg) RGR (ngày-1) CO2 thấp 0,67 544 103,7 0,022 CO2 cao 0,92 948 201,7 0,035 ANOVAx ** ** ** ** CV (%) 5,15 2,69 7,51 8,43 x **: khác biệt có ý nghĩa ở mức P ≤ 0,01. Bảng 4. Đường kính (ĐK) thân, gia tăng chiều dài rễ (CDR), gia tăng số lá mở/cây (SLM/C) và số chồi của cây diệp hạ châu đắng nuôi cấy in vitro ở các nồng độ CO2 khác nhau trong giai đoạn ex vitro Công thức ĐK thân (mm/cây) Gia tăng CDR (mm/cây) Gia tăng SLM/C Số chồi (chồi/cây) CO2 thấp 1,14 68 11,5 1,1 CO2 cao 1,68 157 30,2 4,5 ANOVAx ** ** ** ** CV (%) 3,78 5,45 17,50 22,59 x **: khác biệt có ý nghĩa ở mức P ≤ 0,01. Tương tự như giai đoạn in vitro, cây diệp hạ châu đắng ở công thức nồng độ CO2 cao vẫn tăng trưởng tốt hơn so với cây ở công thức còn lại sau 32 ngày đưa ra vườn ươm (hình 4). Cây ở công thức nồng độ CO2 cao có tỉ lệ sống rất cao, đạt 92%, đồng thời tốc độ tăng trưởng tương đối cũng đạt đến 0,035 ngày-1, trong khi cây ở công thức nồng độ CO2 thấp chỉ đạt tỷ lệ sống 67% và tốc độ tăng trưởng tương đối cũng thấp hơn (0,022 ngày-1) (bảng 3). Sự gia tăng Công thức Pham Minh Duy et al. 254 khối lượng tươi và khô, chiều dài rễ, số lá mở/cây, đường kính thân và số chồi của cây ở công thức nồng độ CO2 cao trong giai đoạn in vitro đều lớn hơn một cách có ý nghĩa về mặt thống kê khi đưa ra vườn ươm (bảng 3 & 4). Ngoài ra, cây diệp hạ châu đắng nuôi cấy in vitro trong điều kiện nồng độ CO2 cao phân nhánh rất nhiều khi đưa ra điều kiện ex vitro (bảng 4, hình 4), đạt đến 4,5 chồi/cây vào ngày thứ 32, trong khi cây ở công thức CO2 thấp gần như không phân nhánh (số chồi trung bình là 1,1 chồi/cây). Việc nuôi cấy in vitro trong điều kiện nồng độ CO2 cao đã giúp cây diệp hạ châu đắng tích lũy một nền tảng vật chất tốt, bộ rễ và thân lá phát triển mạnh khiến cây có thể thích nghi tốt hơn với điều kiện ex vitro. Các kết quả này cũng tương tự như kết quả của Nguyễn Trí Minh và nnk. (2008) [8] khi đưa cây dâu tây đã nuôi cấy in vitro ở các nồng độ CO2 400 µmol mol-1 và 1000 µmol mol-1 ra vườn ươm. Solárová Pospíšilová (1997) [11] cũng thu được kết quả tương tự với cây thuốc lá và cây hoa cẩm chướng, và các tác giả này cũng nhận định rằng, chính nhờ sự phát triển lớn hơn và nền tảng vật chất tích lũy tốt hơn vào lúc đưa ra ex vitro mà các cây được tăng cường CO2 in vitro đã phát triển mạnh hơn trong môi trường ex vitro. Hình 4. Cây diệp hạ châu đắng ở giai đoạn ex vitro ngày thứ 32 KẾT LUẬN Cây diệp hạ châu đắng nuôi cấy in vitro trong môi trường giàu CO2 (1200 µmol mol-1) tăng trưởng tốt hơn và tạo được nhiều hợp chất phyllanthin, hypophyllanthin và niranthin hơn so với cây nuôi cấy ở điều kiện CO2 không khí thấp (400 µmol mol-1). Khi đưa ra vườn ươm, cây được nuôi cấy in vitro ở nồng độ CO2 cao tiếp tục duy trì sự tăng trưởng tốt hơn so với cây nuôi cấy in vitro ở nồng độ CO2 thấp. Kết quả của thí nghiệm có thể ứng dụng vào sản xuất hợp chất thứ cấp in vitro ở cây diệp hạ châu đắng. Lời cảm ơn: Đề tài được hỗ trợ kinh phí từ Sở Khoa học và Công nghệ tp. Hồ Chí Minh CO2 thấp CO2 cao TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 249-256 255 (2010-2012), cùng với sự hỗ trợ về trang thiết bị từ phòng Thí nghiệm Trọng điểm phía Nam về Công nghệ tế bào thực vật, Viện Sinh học nhiệt đới, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Burikam S. and Chaiyasirisuwan C., 1991. Effect of CO2 enrichment and sucrose concentrations on growth of papaya shoots cultured in vitro. Nat. Sci. Suppl., 25: 5-8. 2. Chirdchupunseree H. and Pramyothin P., 2010. Protective activity of phyllanthin in ethanol-treated primary culture of rat hepatocytes. J. Ethnopharmacol., 218(1), 172-176 3. George E.F. and Davies W., 2008. Effects of the Physical Environment. In: George E. F., Hall M. A. and Klerk G. J. De (eds.) Plant Propagation by Tissue Culture, 3rd Edition. The Background, Springer, Dordrecht, Netherlands, 1: 424-455. 4. Huang R. L., Huang Y. L., Ou J. C., Chen C. C., Hsu F. L.and Chang C., 2003. Screening of 25 compounds isolated from Phyllanthus species for anti-human hepatitis B virus in vitro, Phytother. Res., 17(5), 449-453. 5. Kassuya C. A., Silvestre A., Menezes-de- Lima O. Jr., Marotta D. M., Rehder V. L. and Calixto J. B., 2006. Antiinflammatory and antiallodynic actions of the lignan niranthin isolated from Phyllanthus amarus: Evidence for interaction with platelet activating factor receptor, Eur. J. Pharmacol. 546(1-3), 182-188. 6. Kozai T. and Kubota C., 2005. In vitro aerial environments and their effects on growth and development of plants. In: Kozai T., Afreen F. and Zobayed S. M. A. (eds.) Photoautotrophic (Sugar-free medium) Micropropagation as a New Micropropagation and Transplant Pproduction System, Springer, Netherlands, pp: 31-51. 7. Krithika R., Mohankumar R., Verma R. J., Shrivastav P. S., Mohamad I. L., Gunasekaran P. and Narasimhan S., 2009. Isolation, characterization and antioxidative effect of phyllanthin against CCl4-induced toxicity in HepG2 cell line. Chem. Biol. Interact., 181(3), 351-358. 8. Nguyễn Trí Minh, Nguyễn Thị Quỳnh, Nguyễn Văn Uyển, 2008. Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng và hàm lượng CO2 lên khả năng sinh trưởng in vitro và ex vitro cây dâu tây (Fragaria ananassa Duch.). Tạp chí Công nghệ sinh học, 6(1): 233-239. 9. Murugaiyaha V. and Chan K. L., 2009. Mechanisms of antihyperuricemic effect of Phyllanthus niruri and its lignan constituents. J. Ethnopharmacol., 124(2), 233-239. 10. Nguyen T. Q., Kozai T., Niu G. and Nguyen V. U., 1999. Photosynthetic characteristics of coffee (Coffea arabusta) plantlets in vitro in response to different CO2 concentrations and light intensities, Plant Cell Tiss. Org. Cult., 55: 133-139. 11. Solárová J. and Pospíšilová J., 1997. Effect of carbon dioxide enrichment during in vitro cultivation and acclimation to ex vitro conditions, Biol. Plant., 39(1), 23-30. 12. Stuhlfauth T., Klug K. and Fock H. P., 1987. The production of secondary metabolites by Digitalis lanata during CO2 enrichment and water stress, Phytochem., 26(10), 2735-2739. 13. Taiz L. and Zeiger E., 2002. Photosynthesis: Carbon Reactions. In: Plant Physiolog, 3rd edition, Sinauer Associates, Sunderland, England, pp: 152-155. 14. Yoon Y. J., Mobin M., Hahn E. J. and Paek K. Y., 2008. Impact of in vitro CO2 enrichment and sugar deprivation on acclimatory responses of Phalaenopsis plantlets to ex vitro conditions, Environ. Exp. Bot., 65(2-3), 183-188. Pham Minh Duy et al. 256 GROWTH PROMOTION AND SECONDARY METABOLITE ACCUMULATION OF Phyllanthus amarus CULTURED PHOTOAUTOTROPHICALLY UNDER CARBON DIOXIDE ENRICHED CONDITION Pham Minh Duy1, Nguyen Nhu Hien1, Hoang Ngoc Nhung1, Nguyen Du Sanh2, Nguyen Thi Quynh1* (1)Institute of Tropibal Biology, VAST (2)University of Science, Ho Chi Minh city SUMMARY Studying the effect of carbon dioxide on growth and secondary metabolite accumulation of Phyllanthus amarus has brought benefits not only to in vitro plant production, but also to secondary metabolite production from in vitro plants. Leafy nodal cuttings of P. amarus plants were cultured photoautotrophically with a density of 4 explants/vessel. The 370 ml Magenta GA-7 vessel had 2 holes (Φ = 1 cm) on the cap attached by 2 Millipore filters with a pore size of 0.45 µm. The culture medium, without sugar and vitamin, was composed of macro-elements 1/2 MS and micro-elements MS. Explants were cultured for 45 days in the Percival growth chamber under CO2 concentration of 400 or 1200 µmol mol-1, PPF of 160 µmol m-2 s-1, photoperiod of 16 h d-1, day/night temperature of 27/22oC and relative humidity of 50%. On day 45, the in vitro plants were transferred to the ex vitro stage for 32 days. The growth of P. amarus plants under high CO2 concentration was greater in both in vitro and ex vitro stages compared with those under low CO2 concentration. Increased fresh and dry weights, shoot diameter and root length of plants treated with 1200 µmol mol-1 CO2 were larger. Lignan compounds accumulated inside in vitro plants including phyllanthin, hypophyllanthin and niranthin (1.27, 0.51 and 2.01 mg g-1 dry weight, respectively) were all higher in high CO2 treatment comparing with those of low CO2 treatment (0.57, 0.45 and 1.05 mg g-1 dry weight, respectively) on day 45. Keywords: Phyllanthus amarus, carbon dioxide, net photosynthetic rate, photoautotrophy, secondary metabolites. Ngày nhận bài: 21-6-2012