Sử dụng phương pháp cắt đốt và trồng trực tiếp ra vườn ươm cây lan hài hồng (paphiopedilum delenatii) - Vũ Quốc Luận

TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 272-276 272 SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP CẮT ĐỐT VÀ TRỒNG TRỰC TIẾP RA VƯỜN ƯƠM CÂY LAN HÀI HỒNG (Paphiopedilum delenatii) Vũ Quốc Luận1, Nguyễn Phúc Huy1, Đỗ Khắc Thịnh2, Dương Tấn Nhựt1* 1Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam, *duongtannhut@gmail.com 2Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Miền Nam, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam TÓM TẮT: Lan hài hồng (Paphiopedilum delenatii) là một trong những loài hoa lan rất khó thực hiện nhân giống vô tính, việc tìm ra một phương pháp mới, đơn giản để tạo ra một số lượng lớn cây giống trong thời gian ngắn hết sức cần thiết. Trong nghiên cứu này, các chồi non lan hài hồng có 4 lá được cấy vào môi trường SH có bổ sung 0,5 mg/l BA, 0,5 mg/l NAA, 30 g/l đường sucrose, 9,0 g/l agar, 1 g/l than hoạt tính và được nuôi trong điều kiện che tối hoàn toàn trong 4 tháng nhằm kéo dài các đốt thân; sau đó được đưa ra điều kiện chiếu sáng thêm 2 tháng để lá tổng hợp diệp lục tố và các năng lượng cần thiết cho cây. Kết quả cho thấy, các chồi non được kéo dài trung bình 10,50 cm, với số lá mới hình thành trung bình 5 lá/chồi, tương ứng với 5 đốt/chồi thu được sau 120 ngày nuôi trong điều kiện tối. Sau đó, các chồi được đưa sang điều kiện chiếu sáng 60 ngày, các chồi non tiếp tục hình thành lá mới, tuy nhiên, không nhận thấy có sự phân đốt. Sau 180 ngày nuôi cấy, các chồi được cắt thành 5 đốt riêng biệt với 1 lá và 1 rễ, riêng phần đỉnh chồi được giữ nguyên với 3 lá và 2 rễ. Cuối cùng, các đốt thân được trồng trên giá thể dớn Đài Loan thu được kết quả cao nhất ở vị trí đốt thân số 1 với tỷ lệ sống sót (100%) sau 12 tháng. Từ khóa: Paphiopedilum delenatii, nhân giống vô tính, phương pháp cắt đốt. MỞ ĐẦU Lan hài hồng (Paphiopedilum delenatii) là một trong những loài lan đặc hữu của Việt Nam. Lan hài hồng không chỉ cho hoa đẹp, quí, có hương thơm khi nở nên được nhiều người ưa chuộng [8]. Hiện nay, lan hài hồng đã được xếp vào một trong những loài lan bị đe dọa có nguy cơ tuyệt chủng [1]. Cho tới nay, đã có một số báo cáo về nghiên cứu nhân giống vô tính lan hài hồng: phương pháp gây viết thương [6], phương pháp kéo dài đốt thân in vitro cây con lan hài hồng có nguồn gốc từ hạt để gia tăng hệ số nhân chồi [5]. Luan et al. (2012) [2] đã chiếu xạ các PLB có nguồn gốc từ hạt và tạo giống đột biến trên đối tượng lan hài hồng. Luan et al. (2012) [4] đã sử dụng chồi non 2 tháng tuổi ex vitro phục vụ cho quá trình tạo mẫu ban đầu và sử dụng phương pháp hủy đỉnh để nhân nhanh cây con và tạo cây hoàn chỉnh in vitro. Để khắc phục những khó khăn trong quá trình tạo mẫu và tăng số mẫu cấy ban đầu, Luan et al. (2012) [3] đã sử dụng ánh sáng đơn sắc để kéo dài chồi lan hài hồng ex vitro nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình thu mẫu và khử trùng mẫu phục vụ cho quá trình tạo mẫu ban đầu. Sau đó, sử dụng phương pháp gây vết thương các chồi non để kích thích tạo chồi bên và tạo cây hoàn chỉnh. Để giảm chi phí trong quá trình nhân nhanh chồi và tạo cây hoàn chỉnh. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã kéo dài chồi in vitro trong điều kiện tối trong 4 tháng và được đưa ra điều kiện chiếu sáng thêm 2 tháng. Sau đó, sử dụng phương pháp cắt đốt và trồng trực tiếp ra ngoài vườn ươm. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu nghiên cứu là những chồi non in vitro lan hài hồng có chiều dài lá khoảng 3 cm và có số lá trung bình 4 lá/chồi được nuôi cấy tại Phòng Sinh học phân tử và Chọn tạo giống cây trồng thuộc Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên. Những chồi này được đưa vào điều kiện tối trong 4 tháng nhằm kéo dài chồi và tạo thành các đốt riêng biệt. Sau đó, chúng được đưa ra điều kiện chiếu sáng thêm 2 tháng để lá tổng hợp chất diệp lục và năng lượng cần thiết. Cuối cùng, chúng được cắt thành từng đốt riêng biệt và trồng ra điều kiện vườn ươm. Kéo dài chồi in vitro lan hài hồng trong điều kiện che tối hoàn toàn Các chồi non có 4 lá được cấy vào môi trường SH (Schenk & Hildebrandt, 1972) [7] có Vu Quoc Luan et al. 273 bổ sung 0,5 mg/l BA, 0,5 mg/l NAA, 30 g/l đường sucrose, 9,0 g/l agar, 1 g/l than hoạt tính và được đưa vào điều kiện che tối hoàn toàn trong 4 tháng nhằm khảo sát ảnh hưởng của điều kiện che tối hoàn toàn lên khả năng kéo dài chồi in vitro. Khảo sát khả năng sống sót của các đốt thân ngoài vườn ươm Các chồi in vitro được đặt trong điều kiện che tối 4 tháng, sau đó, được đưa ra điều kiện chiếu sáng đèn huỳnh quang với cường độ chiếu sáng 2.500-3.000 lux và thời gian chiếu sáng 16/8 giờ (sáng/tối) trong 2 tháng tiếp theo ở nhiệt độ phòng 25±3ºC. Cuối cùng các chồi được cắt thành từng đốt riêng biệt và trồng ra vườn ươm với giá thể dớn Đài Loan sau 12 tháng. Xử lý số liệu Đối với công thức kéo dài chồi in vitro trong điều kiện che tối hoàn toàn, mỗi lần xử lý với 5 bình, mỗi bình có 5 chồi non và trong thí nghiệm cắt đốt và trồng ra vườn ươm mỗi lần xử lý 25 đốt với 5 đốt thân/chậu. Thí nghiệm được lặp lại 4 lần, các số liệu được xử lý bằng cách sử dụng phần mềm phân tích thống kê SPSS 16.0 theo phương pháp Ducan test với α=0,05. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Khảo sát sự kéo dài chồi in vitro lan hài hồng trong điều kiện che tối hoàn toàn Bảng 1. Ảnh hưởng của điều kiện che tối lên sự kéo dài chồi in vitro lan hài hồng Thời gian che tối (ngày) Chiều cao chồi (cm) Số lá mới /chồi Chiều dài lá mới (cm) Chiều rộng lá mới (cm) Số rễ hình thành/ đốt Màu sắc lá Đối chứng 120 ngày sáng 4,25d 3,00c 4,95a 3,37a 0,00c Chồi xanh đậm 30 4,37d 1,00e 3,80b 1,65b 0,00c Lá non hình thành có màu xanh nhạt 60 5,65c 2,42d 3,00c 1,45bc 0,00c Lá gốc màu vàng, lá non có màu xanh trắng 90 7,12b 3,75b 2,22d 1,15c 1,82b Lá gốc màu vàng, lá non có màu xanh trắng 120 10,50a 5,00a 2,00d 1,12c 3,37a Lá gốc màu nâu, lá non có màu xanh trắng Ảnh hưởng của điều kiện che tối hoàn toàn lên khả năng kéo dài đốt thân sau 120 ngày được chỉ ra ở bảng 1. Các chồi non được đặt trong điều kiện che tối hoàn toàn cho thấy sự khác biệt rõ rệt về chiều cao sau 30, 60, 90 và 120 ngày nuôi cấy (hình 1a-e). Trong nghiên cứu này, sau 30 ngày nuôi cấy, phần đốt đầu tiên đã bắt đầu kéo dài, lá non có màu xanh nhạt, phần gốc lá có màu trắng do thiếu ánh sáng để tổng hợp diệp lục tố. Sau 60 ngày nuôi cấy, chiều cao chồi đã tăng rõ rệt, đốt lóng thứ 2 đã vượt ra khỏi phần tầng lá cũ, chiều dài lá ngắn lại và không nhận thấy có sự xuất hiện rễ trên các mắt đốt. Kết quả thu nhận sau 90 ngày nuôi cấy cho thấy, chiều dài chồi đã đạt 7,12 cm và sự kéo dài của đốt lóng thân có thể đạt từ 1- 1,5 cm, chiều dài lá ngắn và chiều rộng tiếp tục được thu hẹp còn 1,15 cm (bảng 1), lá non có màu gần như trắng, lá gần gốc nhất bắt dầu ngả sang màu vàng. Trong khi đó, rễ bắt đầu xuất hiện tại các mắt thân với 1 rễ/mắt (hình 1c). Sau 120 ngày nuôi cấy, chiều cao chồi đã đạt 10,50 cm với 5 lá mới được hình thành, chiều dài và chiều rộng lá thu hẹp, lá có màu gần như trắng TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 272-276 274 hoàn toàn do thiếu diệp lục tố và phần đỉnh chồi đã cao tới miệng của bình nuôi cấy (hình 1e), lá gốc chuyển sang giai đoạn hóa nâu và hoại tử. Các rễ non tiếp tục dài ra và hình thành thêm các rễ mới, trung bình 3,37 rễ/chồi ở các mắt thân non. Kết quả nghiên cứu khác về kéo dài chồi in vitro dưới hệ thống chiếu sáng đơn sắc LED phục vụ cho quá trình nhân giống trên đối tượng lan hài hồng và kết quả thu được cây con có chiều cao trung bình 10 cm trong điều kiện 100% LED đỏ và dưới ánh sáng đèn huỳnh quang cường độ thấp [6]. Luan et al. (2012) [3] kéo dài chồi ex vitro trên đối tượng lan hài hồng dưới điều kiện chiếu sáng đèn LED và trong điều kiện tối và thu được chiều cao chồi trung bình 11 cm trong điều kiện chiếu sáng 100% LED xanh với 5,75 lá/chồi. Trong điều kiện tối với chiều cao trung bình đạt 8,87 cm và 5 lá/chồi, chiều rộng lá trung bình trong điều kiện LED xanh và trong tối giảm dần chỉ đạt 1,35-1,60 cm, chiều dài lá trung bình cũng chỉ đạt 5,75-6,12 cm. Trong nghiên cứu này của chúng tôi, sự kéo dài chồi trong điều kiện tối hoàn toàn sau 120 ngày nuôi cấy đạt chiều cao 10,50 cm với số lá mới hình thành trung bình 5 lá/chồi. Hình 1. a. Đối chứng 120 ngày nuôi cấy ở điều kiện chiếu sáng; b. Nuôi cấy 30 ngày trong tối; c. Nuôi cấy 60 ngày trong tối; d. Nuôi cấy 90 ngày trong tối; e. Nuôi cấy 120 ngày trong tối; f. Nuôi cấy 180 ngày; g. Cắt thành từng đốt riêng biệt; h. Trồng từng đốt riêng biệt trên giá thể dớn Đài Loan; i, j. Cây con ở vị trí đốt thân số 1 sinh trưởng ngoài vườn ươm sau 12 tháng; k. Cây con hình thành ở từng vị trí đốt thân sau 12 tháng ngoài vườn ươm. Vu Quoc Luan et al. 275 Khảo sát khả năng sống sót của các vị trí đốt thân ngoài vườn ươm sau 12 tháng Các chồi in vitro được kéo dài đốt thân trong điều kiện tối và chuyển sang điều kiện chiếu sáng sau 180 ngày được cắt thành từng đốt riêng biệt và trồng trực tiếp ra vườn ươm trên giá thể dớn Đài Loan (hình 1h). Kết quả thu nhận sau 12 tháng cho thấy, khả năng sống sót cũng như quá trình sinh trưởng và phát triển có sự khác biệt ở các vị trí đốt thân. Ở vị trí số 1 (tương ứng với chồi đỉnh) cho tỷ lệ sống sót 100% và các chồi đỉnh tiếp tục có sự gia tăng về tất cả các chỉ tiêu theo dõi (bảng 2) (hình 1ij). Tỷ lệ sống sót cao cũng có thể được giải thích là do vị trí đỉnh chồi khi trồng ra vườn ươm đã có trung bình 3 lá và 2 rễ, điều này gia tăng khả năng quang hợp và hút nước cho cây là rất tốt (hình 1g1). Trong khi đó, ở vị trí đốt thân số 2, khả năng sống sót thấp (23,75%) cũng như số mẫu chết cao và không có sự hình thành chồi bên có thể là do mắt đốt thân còn non nên khi trồng ra vườn ươm chúng đã bị thối hoàn toàn. Ở ví trí đốt thân số 3 và 4 cũng cho tỷ lệ sống sót thấp lần lượt là 33,75 và 32,50% là do khi cắt các đốt thân, đã tạo ra các vết thương và khi trồng trên giá thể có độ ẩm cao đã tạo điều kiện cho vi sinh vật tấn công vào vết thương làm cho mẫu bị thối, do đó, tỷ lệ sống sót giảm. Tuy nhiên, các mẫu sống sót ở vị trí số 3 và 4 đã có sự hình thành chồi bên trung bình tương ứng 0,75-0,72 chồi/mẫu (bảng 2) và phát triển thành cây hoàn chỉnh với số lá mới hình thành trung bình 2,50-3,12 lá/chồi (hình 1k-3,4). Ở vị trí số 5 (tương ứng với đốt gốc), kết quả cho thấy khả năng sống sót (56,25%) và hình thành chồi mới tương đối thấp (0,53 chồi/mẫu) (bảng 2). Kết quả này có thể giải thích là do phần gốc đã bị già hóa, khi trồng ra vườn ươm, lá trên các mắt đốt bắt đầu chuyển sang giai đoạn lão suy và mất khả năng quang hợp, do đó, khả năng kích thích hình thành chồi bên đã bị giảm. Phương pháp cắt đốt và tạo cây hoàn chỉnh in vitro trên đối tượng lan hài hồng đã được mô tả bởi Nhut et al. (2007) [5] với kết quả đạt được 75% tạo cây hoàn chỉnh. Trong khi đó, Luan et al. (2012) [3] cũng sử dụng phương pháp cắt đốt các chồi ex vitro lan Hài hồng phục vụ cho quá trình tái sinh in vitro với tỷ lệ đạt 33,50%. Ngoài ra, phương pháp cắt hom và kết hợp xử lý phân bón lá để kích thích tạo chồi bên trên đối tượng lan Mokara đã được báo cáo bởi Dương Hoa Xô (2007) [9] với kết quả thu được 4,5-5 chồi/cây. Trong nghiên cứu này, chồi đỉnh cho tỷ lệ sống sót 100%, từ 1 chồi non ban đầu sau khi được kéo dài đốt thân đã tạo được (1+0,75+0,72+0,53 chồi/mẫu) 3 cây hoàn chỉnh từ 5 đốt thân. Bảng 2. Ảnh hưởng của vị trí đốt thân lên khả năng sống sót và phát triển ngoài vườn ươm sau 12 tháng Vị trí đốt thân Tỷ lệ mẫu sống (%) Tỷ lệ mẫu chết (%) Số chồi mới hình thành/mẫu Số lá mới hình thành Chiều rộng lá (cm) Hình thái chồi 1 100,00a 0,00d 1,00a 3,87a 3,07a Chồi to, khỏe 2 23,75d 76,25a 0,00d 0,00d 0,00d Không tạo chồi 3 33,75c 66,25b 0,75b 2,50c 1,42c Chồi yếu, xanh nhạt 4 32,50c 67,50b 0,72b 3,12b 1,45c Chồi yếu, xanh nhạt 5 56,25b 43,75c 0,53c 4,12a 2,12b Chồi to, xanh đậm KẾT LUẬN Chồi sinh trưởng kéo dài trong điều kiện tối sau 120 ngày nuôi cấy cho chiều cao tương ứng 10,50 cm và tạo ra số đốt trung bình cao nhất 5 đốt/chồi. Chồi tiếp tục được nuôi cấy dưới điều kiện chiếu sáng đèn huỳnh quang sau 60 ngày với cường độ chiếu sáng 2.500-3.000 lux và thời gian chiếu sáng 16/8 giờ (sáng/tối). Khả năng sống sót và sinh trưởng tốt nhất ở giai đoạn vườn ươm với tỷ lệ 100% trên giá thể dớn Đài Loan thu được ở vị trí đốt số 1 với số lá mới hình thành trung bình 3,87 lá/chồi với chiều rộng của lá 3,07 cm. Như vậy, từ 1 chồi in vitro ban đầu sau khi kéo dài đốt thân sau 180 ngày, cắt đốt trồng trên giá thể dớn Đài Loan đã tạo được 3 cây hoàn chỉnh (1+0,75+0,73+0,53 chồi/mẫu ) ngoài vườn ươm sau 12 tháng. TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 272-276 276 Lời cảm ơn: Các tác giả xin chân thành cảm ơn Quỹ Nafosted, mã số 106.16-2012.32 và Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên đã tạo điều kiện cho chúng tôi hoàn thành nghiên cứu này. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora Appendices. I, II and III. Geneva, Switzerland, 2008. Available at: 110512_SG_CIC.php. 2. Luan Q. L., Uyen N. H. P., Ha V. T. T., 2012. In vitro mutation breeding of Paphiopedilum by ionization radiation. Sci Hort., 144: 1-9. 3. Luan Q. V., Huy N. P., Tra L. T. T., Thinh D. K., Nhut D. T., 2012. Light-emitting diodes (LEDS) for ex vitro shoot elongation an shoot regeneration of paphiopedilum delenatii. J. Biotechnol., 10(4A): 961-968. 4. Luan V. Q., Huy N. P., Thinh D. K., Nhut D. T., 2014. Utilizing the technique of wounding the shoot apex in micropropagation of Paphiopedilum delenatii. J. Scitechnol. (Accepted). 5. Nhut D. T., Thuy D. T. T., Don N. T., Luan V. Q., Hai N. T., Tran Thanh Van K., Chinnappa C. C., 2007. Stem elongation of Paphiopedilum delenatii Guillaumin and shoot regeneration via stem node culture. Prop Orn Plant., 7(1): 29-36. 6. Nhut D. T., Trang P. T. T., Vu N. H., Thuy D. T. T., Khiem D. V., Tran Thanh Van K., 2005. A wounding method and liquid culture in Paphiopedilum delenatii propagation. Prop Orn Plant., 5(3): 158-163. 7. Schenk R. U., Hildebrandt A. C., 1972. Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous and dicotyle- donous plant cell cultures. Canadian Bot., 50: 199-204. 8. Nguyễn Thiện Tịch, 2001. Lan Việt Nam, Nxb. Nông nghiệp, tp. Hồ Chí Minh. 9. Dương Hoa Xô, 2007. Ứng dụng một số tiến bộ kỹ thuật mới trong việc nhân giống và cải thiện chất lượng cành hoa nhóm hoa lan cắt cành Mokara. Hội nghị khoa học Công nghệ sinh học thực vật trong công tác nhân giống và chọn tạo giống hoa. Nxb. Nông nghiệp, 341-347. USING IN VITRO STEM NODE CUTTING METHOD IN PROPAGATION OF Paphiopedilum delenatii Vu Quoc Luan1, Nguyen Phuc Huy1, Do Khac Thinh2, Duong Tan Nhut1 1Tay Nguyen Institute for Scientific Research, VAST 2Institute of Agricultural Science for Southern Vietnam, VAGS SUMMARY Paphiopedilum delenatii is recalcitrant to micropropagation. Lack of high efficient method for massive production of seedlings has existed for many years. In this paper, young shoots with 4 leaves were cultured on SH medium containing 0.5 mg/l BA, 0.5 mg/l NAA, 30 g/l sucrose, 9 g/l agar and 1 g/l activated charcoal and maintained under total darkness for 4 months before transferred into fluorescent light at a PPFD of 45 µmol m−2s-1 for 2 months. After 4 months cultured under darkness, the shoots were extended for an average of 10.5 cm, with 5 leaves/ shoot, equivalent to 5 nodes/ shoot. After the next 2 months under fluorescent light, leaf formation was obtained but no stem node induction was observed. Shoots were then excised into 5 single nodes with 1 leaf and 1 root per node, and the apical shoots developed with 3 leaves and 2 roots each. Finally, nodes with well-developed root and leaf systems were grown in sphagnum moss (Taiwan) and gave the survival rate of 100% after 12 months. Keywords: Paphiopedilum delenatii, cutting method, stem node, propagation. Ngày nhận bài: 15-7-2013