So sánh phương pháp sinh học phân tử MTBDRplus với phương pháp kháng sinh đồ trong việc phát hiện mycobacterium tuberculosis kháng isoniazid và rifampicin

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 5 * 2018 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV. Chợ Rẫy 2018 155 SO SÁNH PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ MTBDRplus VỚI PHƯƠNG PHÁP KHÁNG SINH ĐỒ TRONG VIỆC PHÁT HIỆN MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS KHÁNG ISONIAZID VÀ RIFAMPICIN Trương Thiên Phú*, Trần Thị Thanh Nga*, Ngô Minh Quân*, Nguyễn Đào Ngọc Lan*, Phan Thanh Tùng*, Lê Thị Kiều*, Huỳnh Thị Mỹ Nga*, Phạm Thị Phương Mai*, Nguyễn Thị Xuân Hỷ*, Lê Thị Kim Cúc*, Nguyễn Thị Ngọc Thảo*, Lê Nguyễn Hoàng Vũ*, Nguyễn Phong Phú* TÓM TẮT Mục tiêu: Đánh giá tính chính xác của phương pháp sinh học phân tử MTBDRplus trong việc xác định tính kháng thuốc ở bệnh nhân nghi ngờ lao trong năm 2015 - 2016 trên cở sở phương pháp tham chiếu là kháng sinh đồ trên môi trường lỏng BACTEC MGIT 960 và khảo sát tần suất của các loại đột biến kháng thuốc Rifampicin và Isoniazid. Vật liệu và phương pháp: Tổng số 17.158 bệnh phẩm bao gồm: đàm, dịch dạ dày, dịch rửa phế quản được gửi đến phòng Xét nghiệm Lao, Khoa Vi sinh Lâm sàng, bệnh viện Chợ Rẫy trong năm 2015 và 2016 theo quy trình chẩn đoán thường qui. Quy trình xét nghiệm bao gồm soi AFB, cấy và định danh những cụm khuẩn mọc trên môi trường lỏng MGIT và môi trường đặc LJ bằng phương pháp sinh học phân tử assay. Mẫu cấy MTB dương tính được thực hiện kháng sinh đồ hàng 1 trên môi trường lỏng BACTEC MGIT 960. Kết quả xác định tính kháng thuốc của phương pháp sinh học phân tử được đối chiếu với phương pháp chuẩn kháng sinh đồ. Kết quả: Trong tổng số 17.158 bệnh phẩm có 1819 mẫu bệnh phẩm (10,6%) (gồm mẫu trực tiếp (n = 71) và mẫu cấy (n = 1748)) được thực hiện với phương pháp MTBDRplus. Có 681 mẫu cấy dương tính MTB được thực hiện kháng sinh đồ hàng 1. Độ tương đồng giữa kết quả của phương pháp MTBDRplus và phương pháp kháng sinh đồ trong việc phát hiện lao đa kháng thuốc (MDR-TB), kháng Rifampicin (RIF) và Isoniazid (INH) là 98,8%; 99,0% và 97,1%. Độ nhạy và độ đặc hiệu của MTBDRplus trong việc xác định tính kháng RIF là 96,6% và 99,1%, xác định tính kháng INH là 92,1% và 98,2%. Đột biến thường xuất hiện ở gene rpoB (kháng thuốc RIF) là S531L (58,8%); ở gene katG (kháng thuốc INH) là S315T1 (75,4%). Sự khác biệt giữa phương pháp kháng sinh đồ và phương pháp sinh học phân tử có thể giải thích bởi sự hiện diện của một số đột biến hiếm ở quần thể hỗn hợp vi khuẩn nhạy và kháng thuốc. Kết luận: Phương pháp sinh học phân tử Genotype MTBDRplus là phương pháp sàng lọc nhanh số lượng lớn bệnh phẩm với độ nhạy và độ đặc hiệu cao và thời gian thực hiện ngắn. Kết quả từ nghiên cứu này góp phần vào chính sách phát triển của Tổ chức y tế thế giới (TCYTTG - WHO) trong việc sử dụng phương pháp sinh học phân tử sàng lọc nhanh lao đa kháng thuốc (MDR-TB) cũng như góp phần vào dữ liệu dịch tễ học về tần suất gen kháng thuốc của vi khuẩn lao. Từ khóa: Genotype MTBDRplus, MDR-TB, isoniazid, rifampicin. *Khoa Vi sinh, Bệnh viện Chợ Rẫy Tác giả liên lạc: TS.BS. Trương Thiên Phú, ĐT: 0906355534, Email: truongthienphu78@yahoo.com. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 5 * 2018 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV. Chợ Rẫy 2018 156 ABSTRACT COMPARISION OF GENOTYPE MTBDRplus MOLECULAR ASSAY WITH CONVENTIONAL DRUG SUSCEPTIBILITY TESTING METHOD FOR ISONIAZID AND RIFAMPICIN RESISTANCE IN TUBERCULOSIS PATIENTS Truong Thien Phu, Tran Thi Thanh Nga, Ngo Minh Quan, Nguyen Đao Ngoc Lan, Phan Thanh Tung, Le Thi Kieu, Huynh Thi My Nga, Pham Thi Phuong Mai, Nguyen Thi Xuan Hy, Le Thi Kim Cuc, Nguyen Thi Ngoc Thao, Le Nguyen Hoang Vu, Nguyen Phong Phu * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 22 - No 5- 2018: 155 – 161 Objectives: To evaluate the Genotype MTBDRplus kit with the conventional standard drug susceptibility testing of isoniazid and rifampicin by BACTEC MGIT 960 method. Materials and methods: A total of 17,158 diagnosis clinical specimens (sputum samples, gastric aspirate, bronchoscopy aspirate) sent to Mycobacteriology Laboratory, Department of Clinical Microbiology of Cho Ray Hospital in 2015 and 2016 during the clinical routine. Laboratory algorithms included AFB smear, culture, and commercial Genotype MTBDRplus assay was implemented on MTB identification of positive growth on MGIT and Lowenstein-Jensen media. The performance of Genotype molecular assay was compared to phenotypic DST method and analyzed the genetic of drug resistance patterns. Results: Overall 1819 valid results were obtained for 17,158 clinical specimens (10.6%) with MTBDRplus. 681 MTB positive cultures have been made drug susceptibility testing row 1. The overall of concordance between the results of MTBDRplus assay and those of the drug susceptibility testing for the assessment of MDR-TB, RIF and INH resistance were 98.8%, 99.0% and 97.1%, respectively. For specimens positive for M. tuberculosis by MTBDRplus, this assay’s sensitivity and specificity for rifampin resistance were 96.6%, 99.1%. For isoniazid resistance, they were 92.1% and 98.2%. The frequency of rpoB mutations in RIF resistance strains were S531L (58.8%). Of INH resistant strains, the most prevalence resistance mutation was S315T1 (75.4%) in the katG gene. Disagreement between phenotypical and molecular test results could be explained by the presence of rare mutations in strains caused the presence of mixed bacterial populations. Conclusion: The Genotype MTBDRplus assay is a useful tool for screening large numbers of specimens rapidly with high sensitivity, specificity and short turnaround time. Data of this study contributed to the development of WHO policy on the utility of this molecular assay for MDR-TB screening and the important of mutant distribution in epidemiology data. Keywords: Genotype MTBDRplus, MDR-TB, isoniazid, rifampicin. ĐẶT VẤN ĐỀ Vi khuẩn lao (Mycobacterium tuberculosis - MTB) là một trong những nguyên nhân gây nên số tử vong cao nhất trong những bệnh truyền nhiễm trên toàn cầu. Việt Nam đứng thứ 12 trong 22 nước có tỉ lệ nhiễm lao cao trên thế giới, với hơn 100.000 ca mới được phát hiện hàng năm; và đứng thứ 14 trên tổng số 27 nước có tỉ lệ lao đa kháng thuốc (MDR-TB, kháng đồng thời 2 loại thuốc hàng 1 là Isoniazid (INH) và Rifampicin (RIF)). Theo báo cáo của TCYTTG năm 2015, tỉ lệ nhiễm lao ở Việt Nam là 137 trên 100.000 dân. Tỉ lệ lao đa kháng thuốc trong nhóm bệnh nhân mới là 4,1% và trong nhóm bệnh nhân lao đã điều trị là 25%(12). Thêm vào đó, bệnh lao càng trở nên nghiêm trọng hơn khi việc điều trị lao đa kháng thuốc và kháng thuốc phổ rộng (Extensively Drug Resistance –XDR) gặp nhiều khó khăn do việc điều trị tốn kém trong thời gian dài cùng với việc điều trị thất bại và tái nhiễm. Hiện nay, việc chẩn đoán lao và lao đa kháng thuốc dựa trên phương pháp xác định kiểu hình là nuôi cấy vi khuẩn và thực hiện Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 5 * 2018 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV. Chợ Rẫy 2018 157 kháng sinh đồ trong thời gian từ 4 – 8 tuần. Hơn nữa để đạt được qui trình tối ưu cho kỹ thuật nuôi cấy và kháng sinh đồ phòng xét nghiệm cần có đủ trang thiết bị và đào tạo nhân lực đạt chuẩn. Do đó, các nước có kinh tế kém và đang phát triển gặp nhiều khó khăn trong việc tầm soát bệnh lao. Vì vậy, việc chẩn đoán sớm lao đa kháng thuốc và kháng thuốc phổ rộng từ bệnh phẩm lâm sàng là việc có ý nghĩa lớn và cấp thiết cho việc rút ngắn thời gian chẩn đoán và điều trị lao sớm, đúng hướng, góp phần giảm tỉ lệ tử vong cũng như việc giảm tỉ lệ truyền nhiễm của vi khuẩn lao kháng thuốc. Trong những năm gần đây, một số phương pháp sinh học phân tử đã được phát triển và ứng dụng rộng rãi trong việc phát hiện vi khuẩn lao và xác định kiểu gene kháng thuốc bao gồm Line probe assays (Genotype MTBDRplus; Hain Lifescience GmbH, Germany, INNO LIPA Rif.TB, Belgium) và real-time PCR (Xpert; Cepheid, USA). Với phương pháp xác định kiểu gene, Genotype MTBDRplus được ứng dụng xác định gene kháng RIF và INH trong mẫu bệnh phẩm cấy và bệnh phẩm lâm sàng đã được đánh giá có độ tương đồng cao với phương pháp kháng sinh đồ(3,5,13). Một nghiên cứu hồi cứu về dữ liệu của các bài nghiên cứu cho thấy độ nhạy và độ đặc hiệu của Genotype MTBDRplus trong việc phát hiện gene kháng RIF là 99% (95% confidence interval (CI), 96% - 100%) và 99% (95% CI, 98% - 100%); đối với kháng INH là 96% (93 - 98%) và 100% (99 - 100%). Vì vậy, TCYTTG hướng đến việc sử dụng rộng rãi phương pháp sinh học phân tử trong việc tầm soát lao đa kháng thuốc từ tháng 6 năm 2008, và Genotype MTBDRplus assay đã được ứng dụng trong chẩn đoán thường qui ở nhiều nơi trên thế giới(2,6,9,10,13). Mục tiêu hướng đến của nghiên cứu này là đánh giá việc ứng dụng Genotype MTBDRplus assay trong việc chẩn đoán nhanh bệnh lao và các gene kháng thuốc trong bệnh phẩm lâm sàng và mẫu nuôi cấy. Kết quả của Genotype MTBDRplus assay sẽ được so sánh với kết quả từ phương pháp kháng sinh đồ để đánh giá độ tương đồng, độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị tiên đóan kháng và nhạy của hai phương pháp chẩn đoán. Đồng thời, tần suất xuất hiện của các đột biến được phân tích để phản ánh mối tương quan giữa kiểu gen và sự đa kháng thuốc thể hiện ở kiểu hình vi khuẩn trong kháng sinh đồ. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Quy trình xét nghiệm và bệnh phẩm lâm sàng Tất cả xét nghiệm chẩn đóan bệnh lao được thực hiện tại Phòng xét nghiệm lao, khoa Vi sinh Lâm sàng, bệnh viện Chợ Rẫy. Nghiên cứu được phân tích dựa trên dữ liệu xét nghiệm thực hiện từ tháng 1 năm 2015 đến tháng 12 năm 2016. Tổng số 17.158 bệnh phẩm bao gồm mẫu đàm, mẫu dịch dạ dày, dịch rửa phế quản đã được gửi đến phòng xét nghiệm thực hiện cấy và định danh trực tiếp. Bệnh phẩm lâm sàng được khử nhiễm và cô đặc bằng phương pháp sử dụng N-acetyl-L- cystein (NALC) và NaOH. Đối với bệnh phẩm có chỉ định cấy, cặn lắng sau khi li tâm được huyền phù trong 2 ml nước cất. 500 µL dịch huyền phù được cấy vào môi trường lỏng MGIT và cấy 4 - 5 giọt lên ống môi trường đặc LJ. Bệnh phẩm trực tiếp cũng được xử lý như trên và phần huyền phù 2 ml được chứa vào tube để trữ đông -20oC dùng cho việc tách DNA. Định danh vi khuẩn lao từ môi trường cấy và kháng sinh đồ Vi khuẩn nghi ngờ lao mọc trên môi trường cấy sẽ được định danh bằng Genotype MTBDRplus assay (Version 2.0). Kháng sinh đồ được thực hiện theo chỉ định trên chủng vi khuẩn MTB đã được định danh. Kháng sinh đồ hàng 1 được thực hiện trên môi trường lỏng bằng máy BACTEC MGIT 960 theo hướng dẫn của nhà sản xuất(7,8). Nồng độ thuốc INH và RIF được sử dụng lần lượt là 0,1 µg/ml và 1,0 µg/ml. Kết quả được trả là kháng thuốc khi có hơn 1% vi khuẩn mọc trong ống chứa thuốc so sánh với ống chuẩn. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 5 * 2018 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV. Chợ Rẫy 2018 158 Xét nghiệm Genotype MTBDRplus assay Xét nghiệm Genotype MTBDRplus assay được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất để định danh MTB và xác định các đột biến trên các gene rpoB, katG, và inhA tương ứng với kháng thuốc RIF và INH ở nồng độ cao và nồng độ thấp. Tóm tắt phương pháp là DNA được tách chiết bằng Genolyse kit (Hain Lifesciences, Germany) từ 1 ml bệnh phẩm trực tiếp đã xử lý hoặc 1 ml mẫu cấy. Phản ứng khuếch đại PCR được thực hiện trên 50 µL phản ứng bao gồm 45 µL master-mix do nhà sản xuất cung cấp cùng 5 µL DNA tách chiết. Sau đó, sản phẩm PCR được lai với DNA trên que lai và phân tích kết quả trực tiếp trên que lai ghi nhận vào file thống kê dữ liệu excel. KẾT QUẢ Nuôi cấy vi khuẩn và định danh MTB Tổng số 17.158 đã được gửi đến phòng xét nghiệm lao, trong đó có 17.087 mẫu bệnh phẩm được chỉ định thực hiện soi AFB, cấy, định danh và 71 mẫu trực tiếp làm xét nghiệm MTBDRplus (hình 1). Có 1748 mẫu cấy có cụm khuẩn soi dương tính dưới dạng cuộn thừng được định danh MTBDRplus, trong đó 906 mẫu dương tính với MTB nhưng chỉ có 681 mẫu được chỉ định làm kháng sinh đồ. Bảng 1: Các loại mẫu được chẩn đoán bằng kít Genotype MTBDRplus assay trong năm 2015 – 2016. Loại mẫu Mẫu nghi ngờ lao phổi (phức hợp MTB dương tính/ tổng số mẫu thực hiện) Mẫu nghi ngờ lao ngoài phổi (phức hợp MTB dương tính/ tổng số mẫu thực hiện) Mẫu bệnh phẩm lâm sàng trực tiếp Đàm (5/53) Mủ (0/1) Dịch rửa phế quản (1/4) Nước tiểu (0/3) Dịch màng phổi (1/3) Khác (1/7) Mẫu nuôi cấy từ bệnh phẩm lâm sàng Đàm (855/1,697) Mủ (0/0) Dịch rửa phế quản (41/41) Nước tiểu (2/2) Dịch màng phổi (1/1) Mô (4/4) Khác (3/3) Có 1.819 mẫu được định danh với kít Genotype MTBDRplus trong năm 2015 – 2016 được thể hiện trong Bảng 1 bao gồm mẫu bệnh phẩm trực tiếp (n = 71) và mẫu bệnh phẩm cấy (n = 1.748). Bên cạnh những mẫu phân lập được trên môi trường MGIT và LJ, có tổng 71 mẫu trực tiếp nghi ngờ lao phổi (84,5%) và lao ngoài phổi (15,5%) được gửi đến phòng xét nghiệm để xác định. Tỉ lệ phát hiện dương tính MTB là 11,3% đối với mẫu bệnh phẩm trực tiếp và 1 ca MDR-TB được phát hiện từ bệnh phẩm đàm. Trong tổng số 1,748 mẫu cấy cần định danh bằng kít Genotype MTBDRplus, kết quả dương tính MTB là 906 (51,8%), 842 mẫu không phát hiện phức hợp MTB sau khi định danh (48,2%). Trong số những kết quả này, có một số mẫu gặp khó khăn trong việc phân tích kết quả (1,5%) và xét nghiệm được lặp lại để đạt được kết quả phân tích cuối cùng. So sánh độ tương đồng của phương pháp kháng sinh đồ và Genotype MTBDRplus assay Trong tổng số 906 mẫu cấy dương tính MTB thì có 681 mẫu được thực hiện kháng sinh đồ hàng 1 bằng phương pháp phương pháp BACTEC MGIT 960, 225 mẫu còn lại không có chỉ định thực hiện. Kết quả kháng sinh đồ của tổng 681 mẫu có 29 ca MDR-TB (4,3%), 36 ca kháng một loại thuốc Isoniazid (5,3%) và không có chủng nào chỉ kháng một loại Rifampicin. Những chủng còn lại bao gồm nhạy với 5 loại thuốc và kháng nhiều loại thuốc. Dựa trên kết quả của phương pháp chuẩn là kháng sinh đồ, kết quả Genotype MTBDRplus cho thấy có độ tương đồng cao trong việc phát hiện MDR-TB là 28 trên 29 ca. Kết quả phân tích về độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị tiên đoán kháng và giá trị tiên đoán nhạy được trình bày trong Bảng 2. Kết quả cho thấy có sự khác biệt ở 1 ca là MTBDRplus thể hiện nhạy RIF do không phát hiện vạch đột biến nhưng kết quả kháng sinh đồ là kháng RIF. Vì thế, so sánh độ tương đồng chung giữa 2 phương pháp về sự kháng RIF và INH lần lượt là 99,0% và 97,1%. Kết quả độ nhạy của INH có sự khác biệt do có 10 mẫu thể hiện kháng INH ở MTBDRplus nhưng kháng sinh đồ thể hiện nhạy thuốc INH. Tỉ lệ được tính dựa trên phương pháp chuẩn Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 5 * 2018 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV. Chợ Rẫy 2018 159 kháng sinh đồ; PPV-Positive predictive value (Giá trị tiên đoán kháng), NPV- Negative predictive value (Giá trị tiên đoán nhạy). Bảng 2: Kết quả của Genotype MTBDRplus assay trong việc phát hiện MDR-TB, kháng và nhạy của RIF và INH Isoniazid Rifampicin MDR-TB Độ nhạy 92.1%(116/126) 96.6% (28/29) 96.7% (29/30) Độ đặc hiệu 98.2%(545/555) 99.1 (646/652) 98.9% (555/561) Độ tương đồng 97.1 (661/681) 99.0% (674/681) 98.8% (584/591) Giá trị tiên đoán kháng 92.1% (116/126) 82.4% (28/34) 82.9% (29/35) Giá trị tiên đoán nhạy 98.2% (545/555) 99.8% (646/647) 99.8% (555/556) Hình 1. Qui trình xét nghiệm nuôi cấy vi khuẩn và kết quả Tần suất xuất hiện các đột biến ở gene kháng INH và RIF Các đột biến kháng thuốc INH và RIF được phát hiện bằng kít MTBDRplus (tổng số mẫu kháng phân tính n = 126) được thể hiện trong Hình 2. Trong tổng số 34 chủng MTB kháng RIF, tần suất xuất hiện các đột biến trên gene rpoB là: 11 ca có 1 trong 8 vạch wild type biến mất (32,4%), 20 ca có xuất hiện đột biến S531L (58,8%), 2 ca có đột biến H526Y (5,9%), 1 ca có đột biến D516V (2,9%). Trong tổng số 126 chủng kháng INH, tần xuất xuất hiện đột biến S315T1 là 95 ca (75,4%) trên gene katG, 23 ca có đột biến C15T (18,3%) trên gene inhA. Kết quả MTBDRplus phân tích có 5 ca kháng RIF nhưng kết quả kháng sinh đồ là nhạy cho thấy ở những chủng này có vạch wild type biến Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 5 * 2018 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV. Chợ Rẫy 2018 160 mất nhưng không phát hiện được vạch đột biến trên que lai DNA. Hình 2. Tần suất xuất hiện đột biến ở chủng vi khuẩn kháng INH và RIF (N=126). BÀN LUẬN Kết quả của phương pháp sinh học phân tử Genotype MTBDRplus cho thấy độ nhạy (96,7%) và độ đặc hiệu (98,9%) cao, độ tương đồng với phương pháp chuẩn kháng sinh đồ là 98,8% trong việc phát hiện lao đa kháng thuốc MDR- TB. Kết quả của nghiên cứu này tương đồng với một số kết quả đạt được từ các nghiên cứu trước được thực hiện ở Việt Nam và một số nước khác(2,6,9,10). Thêm vào đó, thời gian thực hiện phương pháp sinh học phân tử ngắn hơn so với phương pháp cấy và kháng sinh đồ truyền thống (2,5 ngày thực hiện MTBDRplus so với 29 ngày cấy và 12 ngày làm kháng sinh đồ). Hơn thế nữa, MTBDRplus còn được sử dụng để phát hiện MTB ở những mẫu cấy bị tạp nhiễm hoặc không mọc bằng cách sử dụng cặn lắng trực tiếp từ mẫu bệnh phẩm; hoặc những mẫu có lẫn NTM. Từ những kết quả trên cho thấy phương pháp sinh học phân tử có ứng dụng cao trong việc phát hiện những ca lao mới và quản lý lao đa kháng thuốc (MDR-TB) ở những nước có tỉ lệ nhiễm lao cao. Nhìn chung, kết quả MTBDRplus cũng thể hiện độ chính xác cao trong việc tìm chủng kháng INH (độ nhạy 92,1%, độ đặc hiệu 98,2%); đối với chủng kháng RIF (độ nhạy 96,6%, độ đặc hiệu 99,1%). Tuy nhiên, độ đặc hiệu của kít trong việc phát hiện MDR-TB là 98,9%. Kết quả thực nghiệm cho thấy 6 ca có sự khác biệt giữa phương pháp xác định kiểu gene (genotype - MTBDRplus) và phương pháp xác định kiểu hình (phenotype – kháng sinh đồ). Qua đó, cho thấy phương pháp xác định kiểu gene đã phát hiện hơi quá mức sự kháng thuốc so với phương pháp chuẩn. Điều này có thể lí giải do sự hiện diện của quần thể hỗn hợp vi khuẩn nhạy và kháng thuốc (“heteroresistance”) trong mẫu bệnh phẩm lâm sàng. Khái niệm “heteroresistance” đã được báo cáo bởi Rinder và cộng sự(11) và được xem là yếu tố quan trọng có thể ảnh hưởng đến độ chính xác và tin cậy của phương pháp kháng sinh đồ. Sự khác biệt có thể được giải thích do hỗn hợp vi khuẩn nhạy và kháng thuốc cùng tồn tại trong mẫu bệnh phẩm lâm sàng; kiểu gene đột biến được phát hiện bởi MTBDRplus trong khi đó quần thể vi khuẩn nhạy thuốc có thể phát triển lấn át trong môi trường lỏng và thể hiện kiểu hình “nhạy” trong kháng sinh đồ. Phương pháp sinh học phân tử thực hiện nhanh và có độ chính xác cao có ý nghĩa lớn trong việc quản lý bệnh lao được thể hiện trong việc chọn phác đồ điệu trị đúng và sớm trong thời kỳ đầu. Việc phát hiện các đột biến cho thấy xuất hiện khả năng kháng thuốc ở bệnh nhân lao đối với các 2 thuốc trọng yếu là Isoniazid và Rifampicin. Sự phát hiện các tần suất đột biến S315T1 ở gene katG và C15T trên gene inhA giúp các bác sĩ lâm sàng lựa chọn phác đồ điều trị hợp lí hơn. Nếu đột biến xuất hiện ở gene inhA kháng INH nồng độ thấp, nồng độ INH cao có thể đạt hiệu quả trong quá trình điều trị. Mặt khác, nếu thể hiện đột biến ở gene katG kháng INH ở nồng độ cao, INH sẽ không bao gồm trong phác đồ điều trị. Ở các ca lao đa kháng thuốc, chỉ có đột biến S531L xuất hiện trên gene rpoB. Kết quả này tương đồng với kết quả từ những nghiên cứu trước ở quần thể người Việt Nam(9). Genotype MTBDRplus không phát hiện được 1 ca lao đa kháng thuốc so với phương pháp kháng sinh đồ do không phát hiện được Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 5 * 2018 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV. Chợ Rẫy 2018 161 vạch đột biến từ chủng MTB. Kết quả này có thể do một đột biến hiếm mà kít chẩn đoán không thể hiện được được hoặc do một đột biến khác xảy ra trên cùng gene rpoB. Nghiên cứu của chúng tôi phát hiện 8 ca dương tính với MTB trên tổng số 71 mẫu bệnh phẩm trực tiếp, trong đó có 1 trường hợp lao đa kháng thuốc trong mẫu đàm trực tiếp. Kết quả cho thấy kít MTBDRplus có thể ứng dụng để sàng lọc lao đa kháng từ mẫu bệnh phẩm trực tiếp để giúp chẩn đoán nhanh, điều trị sớm và hạn chế lây lan các trường hợp lao đa kháng thuốc. Bên cạnh những ứng dụng thuận lợi của kít MTBDRplus, chúng tôi nhận thấy còn một số hạn chế khi thực hiện và phân tích kết quả xét nghiệm từ bệnh phẩm lâm sàng trực tiếp. Một số que lai không thể phân tích kết quả và phải thực hiện lặp lại. Tuy nhiên, tỉ lệ những xét nghiệm cần lặp lại (1,5%) của chúng tôi thấp hơn so với một số nghiên cứu trước trên mẫu đàm trực tiếp (5 - 12%)(4). Kết quả này nhấn mạnh rằng xét nghiệm MTBDRplus đòi hỏi sự cẩn trọng từ người thực hiện khi phân tích kết quả trên mẫu xét nghiệm trực tiếp để tránh trường hợp âm tính giả hoặc nhiễm chéo DNA gây trường hợp dương tính giả. KẾT LUẬN Phương pháp sinh học phân tử MTBDRplus có độ tương đồng cao so với phương pháp kháng sinh đồ trên môi trường lỏng BACTEC MGIT 960 trong việc phát hiện lao kháng thuốc INH (97,1%), RIF (99%), MDR-TB (98,8%). Các đột biến kháng thuốc hay gặp của RIF là S531L (58,8%) trên gen rpoB, của INH là S315T1 (75,4%) trên gen katG và C15T (18,3%) trên gen inhA. Phương pháp này còn có thể áp dụng trên bệnh phẩm trực tiếp để giúp chân đoán nhanh, điều trị kịp thời và hạn chế lây lan các trường hợp lao đa kháng thuốc. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bwanga F, Hoffner S, Haile M, Joloba ML (2009): Direct susceptibility testing for multi-drug resistant tuberculosis: a meta-analysis. BMC Infect Dis, 9:67. 2. Cavusoglu C, Turhan A, Akinci P, Soyler I (2005). Evaluation of the Genotype MTBDR assay for rapid detection of rifampin and isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis isolates. J Clin Microbiol, 43(8):3699-3703. 3. Cavusoglu C, Gursel D, Aktoprak HB (2011). Evaluation of the genotype MTBDRplus assay for the diagnosis of tuberculosis and rapid detection of rifampin and isoniazid resistance in clinical specimens. Turk J Med Sci, 41(3):419-425. 4. Hillemann D, Rusch-Gerdes S, Richter E (2006). Appication of the Genptype MTBDRplus assay directly on sputum specimens. Int. J. Tuberc. Lung Dis, 10: 1057-1059. 5. Hillemann D, Rusch-Gerdes S, Richter E (2007). Evaluation of the Genotype MTBDRplus assay for rifampicin and isoniazid susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis strains and clinical specimens. J Clin Microbiol, 45(8):2635-2640. 6. Hillemann D, Weizenegger M, Kubica T, Richter E, Niemann S (2005). Use of the genotype MTBDRplus assay for rapid detection of rifampin and isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis complex isolates. J Clin Microbiol, 43(8): 3699-3703. 7. Kent PT, Kubica GP et al (1985): Public health mycobacteriology: a guide for the level III laboratory. Atlanta: US Department of Health and Human Services; 30329-4027. 8. Kruuner A, Yates MD, Drobniewski FA (2006). Evaluation of MGIT 960-based antimicrobial testing and determination of critical concentrations of first- and second-line antimicrobial drugs with drug-resistant clinical strains of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol, 44(3):811-818. 9. Mai NT Huyen, Edine W Tiemersma, Nguyen TN Lan et. al (2010). Validation of the Genotype MTBDRplus assay for diagnosis of multidrug resistant tuberculosis in South Vietnam. BMC Infectious Disease, 10:149. 10. Miotto P, Piana F, Penati V, Canducci F et. al (2006). Use of genotype MTBDRplus assay for molecular detection of rifampin and isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis clinical strains isolated in Italy. J Clin Microbiol, 44(7):2485-2491. 11. Rinder H, Mieskes KT, Loscher T (2001). Heteroresistance in Mycobacterium tuberculosis. Int J Tuberc Lung Dis, 5(4):339-345. 12. Tuberculosis profile. 2015. Tuberculosis report in Vietnam by WHO. www.who.int/tb/data. 13. Vladyslav Nikolayevskyy, Yanina Balabanova, Tatyana Simak et al (2009). Performance of the Genotype MTBDRplus assay in the diagnosis of tuberculosis and drug resistance in Samara, Russian Federation. BMC Clin Path, 9(2): 1472-6890. Ngày nhận bài báo: 26/02/2018 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 07/03/2018 Ngày bài báo được đăng: 25/09/2018