So sánh hiệu quả thu nhận DNA tự do từ huyết tương thai phụ

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 Nghiên cứu Y học 185 SO SÁNH HIỆU QUẢ THU NHẬN DNA TỰ DO TỪ HUYẾT TƯƠNG THAI PHỤ Lương Bắc An*,***, Quách Thị Hoàng Oanh**, Trịnh Nhựt Thư Hương**, Nguyễn khắc Hân Hoan**, Lê Quang Thanh**, Đỗ Thị Thanh Thủy*. TÓM TẮT Mở đầu: Phát hiện và định lượng DNA thai tự do (cffDNA) trong huyết tương thai phụ đang trở thành hướng đi mới trong sàng lọc tiền sản không xâm lấn (NIPS). Rất nhiều phòng thí nghiệm đã ứng dụng cffDNA như là một nguồn vật liệu di truyền quan trọng để xác định giới tính thai nhi, các bệnh lí di truyền và một số lệch bội nhiễm sắc thể. Trong NIPS, hạn chế lớn nhất khi phân tích cffDNA trong huyết tương thai phụ là hàm lượng cffDNA thấp (chỉ chiếm 3 - 13% trong tổng số cfDNA huyết tương thai phụ tùy theo tuổi thai) và độ tinh sạch của cfDNA sau tách chiết, cả hai yếu tố này đều tác động tới độ nhạy của xét nghiệm. Vì vậy, phương pháp tối ưu để tách chiết cfDNA từ huyết tương thai phụ đóng vai trò quan trọng trong xét nghiệm NIPS. Mục tiêu: So sánh hiệu quả của 3 bộ kít tách chiết cfDNA từ mẫu huyết tương thai phụ. Phương pháp: Nghiên cứu mô tả cắt ngang. Nghiên cứu so sánh hiệu quả 3 quy trình tách chiết gồm 1 phương pháp sử dụng công nghệ hạt từ (MagMAX circulating DNA (Applied Biosystems)) và 2 phương pháp sử dụng công nghệ cột lọc (QIAamp Curculating Nucleic Acid Kit (QIAGen) và Quick-cfDNATMSerum & Plasma (Zymo Research)) để thu nhận cfDNA từ 30 mẫu huyết tương thai phụ. Nồng độ cfDNA được đo bằng hệ thống Qubit flourometer và phân bố kích thước được xác định bằng hệ thống Labchip GX Touch. Kết quả: Hàm lượng cfDNA khác nhau khi tách chiết từ 3 bộ kít (p = 9e - 11). So sánh nồng độ thu được giữa các bộ kít, chúng tôi nhận thấy bộ kít MagMAX circulating DNA thu được nồng độ cfDNA cao hơn bộ kít QIAamp Circulating Nucleic acid (p = 0,00016) và Quick-cfDNATMSerum & Plasma (p = 3,7e - 11). Kết luận: Phương pháp ly trích cfDNA có thể ảnh hưởng chất lượng và kích thước sản phẩm cfDNA thu nhận. Chúng tôi nhận thấy bộ kít MagMAX circulating DNA thể hiện nhiều ưu điểm vượt trội so với QIAamp Curculating Nucleic Acid Kit (QIAGen) và Quick-cfDNATMSerum & Plasma (Zymo Research). Từ khóa: cfDNA, cffDNA, NIPS. ABTRACTS. COMPARING THE EFFICIENCY OF THREE METHODS IN EXTRACTION OF CELL-FREE DNA FROM MATERNAL BLOOD. Luong Bac An, Quach Thi Hoàng Oanh, Trinh Nhut Thu Huong, Nguyen Khac Han Hoan, Le Quang Thanh, Do Thi Thanh Thuy * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol. 22 - No 5- 2018: 185 – 191 Introduction: Detection and quantification of circulating free fetal (cffDNA) in maternal plasma has recently emerged as an alternative method for prenatal genetic diagnosis. Many laboratories have shown the utility of fetal circulating DNA as a unique source of genetic material for noninvasive prenatal evaluation of fetal gender, genetic disease and aneuploidy. Limitations in using cell-free fetal DNA in plasma for NIPS include the fetal fraction is low (about 3 - 13% in total cfDNA in maternal plasma with depending on gestational age) and failure to recover highly purified total cfDNA, both of which impact to assay sensitivity. Therefore, optimal methods to isolate cell-free fetal DNA from maternal plasma are critical in developing noninvasive fetal DNA *Đại học Y Dược TP. HCM, ** Bệnh viện Từ Dũ TP.HCM, *** Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP. HCM. Tác giả liên lạc: CN. Lương Bắc An ĐT: 0933.908.241 Email: luongbacan1991@gmail.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 186 testing strategies. Objective: We aimed to compare the efficiency of three methods in extraction of cell free DNA from maternal blood. Methods: A cross-sectional study. The present study compares the one magnetic-bead based (MagMAX circulating DNA (Applied Biosystems)) and two column-based (QIAamp circulating Nucleic acid (QIAgen) and Quick-cfDNATMSerum & Plasma (Zymo Research)) using 30 plasma samples from maternal blood. CfDNA concentration was measured using the Qubit flourometer. DNA fragments length was assessed using the Labchip GX Touch. Results: CfDNA concentration were different among the three methods tested (p = 9e - 11). Intermethod comparisons, we observed that MagMAX circulating DNA method significantly extracted more cfDNA than QIAamp circulating Nucleic acid (p = 0.00016) and Quick-cfDNATMSerum & Plasma (p = 3.7e - 11), respectively. Conclusion: Methods for isolation of cfDNA can affect DNA yield and molecular weight fractions recovery. We confirm that the MagMAX circulating DNA method provides the highest cfDNA yield than QIAamp circulating Nucleic acid (QIAgen) and Quick-cfDNATMSerum & Plasma (Zymo Research). Key words: circulating free DNA (cfDNA), NIPS, cffDNA. ĐẶT VẤN ĐỀ. Khám phá sự hiện diện của của DNA thai tự do (cffDNA) trong huyết tương thai phụ đang trở thành chủ đề được quan tâm hiện nay. CffDNA xuất hiện rất sớm trong giai đoạn đầu thai kì (tuần thứ 6 thai kì) và hàm lượng cffDNA tăng dần theo tuổi thai, sau đó biến mất hoàn toàn sau khi sinh(8). Trong sàng lọc tiền sản không xâm lấn (NIPS), cffDNA có ý nghĩa rất quan trọng trong việc phát hiện một số bệnh lí của thai nhi gồm một số lệch bội nhiễm sắc thể của T21, T18, T13 cũng như các rối loại di truyền đơn gen khác như các rối loạn liên quan đến nhiễm sắc thể giới tính, nhóm máu Rhesus (RhD), -thalasemia, tăng sản tuyến thượng thận bẩm sinh, Trở ngại lớn khi áp dụng cffDNA vào trong NIPS là do hàm lượng cffDNA rất thấp so cfDNA mẹ trong mẫu huyết tương (3 - 13% trong tổng số cfDNA huyết tương thai phụ tùy theo tuổi thai) và kích thước ngắn (50 - 150bp)(2,10). Chính vì vậy, phương pháp tách chiết phù hợp có thể thu nhận tối đa lượng cfDNA với độ tinh sạch cao là điểm mấu chốt trong xét nghiệm NIPS. CfDNA có chất lượng tốt giúp hạn chế kết quả âm tính giả do thất thoát DNA trong quá trình thao tác hoặc tồn tại các thành phần gây ức chế phản ứng phân tích. Hãng QIAgen phát triển các bộ kít thương mại chuyên biệt trong tách chiết cfDNA nhằm thu được hoàn toàn cfDNA với các đoạn có kích thước nhỏ (75bp). Trong đó có bộ kít QIAamp Circulating Nucleic Acid chuyên dụng để thu nhận cfDNA từ huyết tương. Nghiên cứu của Gabrila và cộng sự khi so sánh khả năng thu nhận cfDNA từ 3 bộ kít khác nhau của hãng QIAgen cho thấy khả năng tách chiết của QIAamp Circulating Nucleic acid tốt hơn so với QIAamp DSP Virus kit (p < 0.001) và QIAamp DNA Blood Mini kit (p < 0.0001)(9). Tuy nhiên, giá thành cho bộ kít QIAamp Circulating Nucleic acids thông thường rất cao. Do đặc điểm cfDNA khó thu hồi bằng các bộ kít li trích tay thông thường nên hầu hết các hãng thực hiện xét nghiệm NIPT đều thực hiện bước chuẩn bị mẫu bằng các bộ kít ly trích thực hiện trên hệ thống máy tách chiết tự động. Macherey & Nagel là một trong những hãng phát triển các bộ kít li trích cho máy li trích tự động, bên cạnh đó hãng cũng phát triển các bộ kít tách cfDNA bằng quy trình thường quy như bộ kít NucleoSpin Plasma XS (Macherey & Nagel (MN)), có đặc điểm nổi bật như thu hồi được Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 Nghiên cứu Y học 187 các đoạn cfDNA có kích thước 50 - 1000bp, sử dụng công nghệ cột lọc cải tiến cho phép lượng buffer dung giải dùng thu hồi cfDNA chỉ cần từ 5 - 30ul. Tuy nhiên, theo một số chuyên gia về xét nghiệm NIPS, công nghệ của cột lọc của hãng Macherey & Nagel không tốt bằng hãng QIAGen(5). Nghiên cứu của Clause và cộng sự so sánh giữa các phương pháp tách chiết bằng hạt từ (NucliSens Magnetic Extraction) và phương pháp cột lọc (QIAamp DSP Virus và QIAamp DNA Blood Mini) cho thấy hiệu quả tách chiết bằng công nghệ hạt từ cho kết quả tốt hơn và bộ kít QIAamp DSP Virus tách được nồng độ cfDNA cao hơn QIAamp DNA Blood Mini(4). Từ đó cho thấy, xác định được bộ kít phù hợp là điều vô cùng cần thiết khi tách chiết cfDNA từ mẫu huyết tương. Ngoài ra, một số yếu tố cũng liên quan tới hiệu quả tách chiết cfDNA như điều kiện xử lí mẫu ban đầu, điều kiện phòng thí nghiệm và kỹ thuật thao tác. Với mục tiêu so sánh hiệu quả quy trình tách chiết cfDNA từ huyết tương thai phụ, chúng tôi thực hiện so sánh quy trình tách chiết của 3 hãng sản xuất khác nhau gồm 2 quy trình sử dụng công nghệ cột lọc (QIAamp Curculating Nucleic Acid Kit (QIAGen) và Quick-cfDNATMSerum & Plasma (Zymo Research)) và 1 quy trình sử dụng công nghệ hạt từ (MagMAX circulating DNA (Applied Biosystems)) để thu nhận cfDNA từ huyết tương thai. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Thiết kế nghiên cứu Mô tả cắt ngang. Phương pháp nghiên cứu. Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là thai phụ tại Bệnh viện Từ Dũ trong thời gian từ tháng 10/2017 đến tháng 5/2018. Số lượng mẫu trong nghiên cứu là 30 mẫu. Nghiên cứu của chúng tôi sẽ sử dụng ống Streck BCT để thu nhận mẫu máu. Thai phụ được lấy 10ml máu chứa trong ống Streck BCT, lập tức đảo ống 180o khoảng 10 lần để máu trộn đều với các chất bảo quản bên trong ống. Nếu chưa xử lý kịp thời, có thể lưu mẫu ở nhiệt độ phòng (18oC - 25oC) trong vòng 14 ngày. Li tâm ống máu với tốc độ 1,600 rpm trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó nhẹ nhàng hút lớp huyết tương phía trên, chú ý không chạm phần buffy coat. Li tâm lần 2 huyết tương vừa thu được với tốc độ 13,000 rpm trong 10 phút ở 4oC. Dịch nổi được thu nhận vào 3 ống eppendorf, trong đó mỗi ống chứa 1 ml huyết tương. Mẫu huyết tương được trữ trong tủ -80oC. Nghiên cứu thực hiện tại Trung tâm Y Sinh học Phân tử - Đại học Y Dược TP.HCM. Tách chiết mẫu huyết tương 30 mẫu huyết tương được tách chiết lần lượt với 3 bộ kít của các hãng sản xuất khác nhau. Trong đó, 2 phương pháp cột lọc gồm kít QIAamp Circulating Nucleic acid (QIA) và kít Quick-cfDNATMSerum & Plasma (Zymo)) và 1 bộ kít sử dụng hạt từ (MagMAX circulating DNA (MagMAX)). Quy trình thực hiện theo hướng dẫn của từng nhà sản xuất. Tất cả các phương pháp đều sử dụng lượng mẫu đầu vào là 1 ml huyết tương. Thể tích dung dịch đệm sử dụng thu hồi cfDNA là 30ul cho tất cả các phương pháp. Đo nồng độ cfDNA sau khi tách chiết CfDNA sau tách chiết được xác định nồng độ bằng bộ kít Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) Assay kit (Thermo Fisher) trên hệ thông Qubit 3.0 Flourometer (Invitrogen, Lie Technologies, CA, USA). Các bước chuẩn bị gồm: chuẩn bị buffer đo bằng cách pha Qubit dsDNA HS Reagent và Qubit dsDNA HS buffer theo tỉ lệ 1:200. Mẫu đo được pha từ 2µL mẫu cfDNA với 198µL buffer đo (chuẩn bị riêng cho mỗi lần đo) và mẫu chuẩn được pha từ 10µl chất chuẩn (cung cấp theo bộ kít) với 190µL. Sử dụng ống Qubit để chứa mẫu đo. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 188 Vortex các ống mẫu và ống chuẩn. Ủ mẫu và ống chuẩn tại nhiệt độ phòng trong 2 phút (tránh sáng) rồi tiến hành đo. Phân tích kích thước của cfDNA Kích thước cfDNA được phân tích bằng hệ thống điện di mao quản LabChip GX Touch 24 (PerkinElmer), sử dụng bộ kít DNA High Sensitivity Reagent Kit (PerkinElmer) đi kèm thang chuẩn LapChip DNA Extended Range (50 - 7000bp) (PerkinElmer). Kết quả được phân tích bằng phần mềm Labchip®GX Reviewer. Xử lí số liệu Tất cả các số liệu được xử lí bằng phần mềm R (phiên bản 3.4.4). Sự khác biệt về nồng độ cfDNA thu được từ các phương pháp tách chiết khác nhau được kiểm định phương sai ANOVA-một chiều (với p < 0.05 được coi là có ý nghĩa thống kê). Kiểm định Tukey đánh giá sự khác biệt giữa các nhóm. KẾT QUẢ. So sánh nồng độ cfDNA giữa các bộ kít Sản phẩm cfDNA thu được sau khi tách chiết được xác định nồng độ bằng hệ thống Qubit®3.0 Fluorometer. Nồng độ cfDNA thu được từ các bộ kít khác nhau được tóm tắt trong bảng 1. Bảng 1: Nồng độ cfDNA thu được từ các bộ kít khác nhau. Bộ kít Nồng độ TBình (ng/µl) Nồng độ thấp nhất (ng/µl) Nồng độ cao nhất (ng/µl) Khoảng tin cậy 95% (CI) (ng/µl) Zymo 0,104 0,052 0,277 0,065-0,110 QIA 0,190 0,100 0,312 0,150-0,227 MagMAX 0,263 0,093 0,591 0,205-0,291 Kết quả nồng độ cfDNA thu được sau khi tách chiết 30 mẫu huyết tương cho thấy nồng độ cfDNA thu được từ các bộ kít có sự biến động lớn. Nồng độ cfDNA trung bình thu được từ bộ kít Zymo là 0,104ng/µl (95% CI: 0,065 - 0,110) với dao động từ 0,052 - 0,277ng/µl. Trong khi đó, bộ kít QIA cho thấy nồng độ cfDNA thu được cao hơn với nồng độ trung bình đạt gần 0,2 ng/µl (95% CI: 0,150 - 0,227), khoảng dao động từ 0,1 - 0,312ng/µl. Trong ba bộ kít thì kít MagMAX cho kết quả nồng độ cfDNA trung bình cao nhất với 0,263ng/µl (95% CI: 0,205 - 0,291), biên độ dao động từ 0,093 - 0,591ng/µl. Kiểm tra sự khác biệt về nồng độ cfDNA thu được từ 3 bộ kít cho thấy có sự khác biệt có ý nghĩa thông kê (p = 9e - 11)(kiểm định ANOVA). Nồng độ cfDNA trung bình thu được từ bộ kít MagMAX cao hơn 1,38 lần so với bộ kít QIA (p = 0.0019) và cao hơn 2,53 lần so với bộ kít Zymo (p = 3,7e - 11). Trong khi đó, nồng độ cfDNA trung bình thu được từ bộ kít QIA cao hơn 1,83 lần so với bộ kít Zymo (p = 0,00016). Sự khác biệt nồng độ có ý nghĩa thống kê (hậu kiểm định Tukey với p < 0.05). Vì vậy, trong 3 bộ kít thì bộ kít MagMAX cho phép thu được nồng độ cfDNA cao nhất, ngược lại bộ kít Zymo có nồng độ cfDNA thu được là thấp nhất (hình 1). Trong 30 mẫu huyết tương tách bằng bộ kít Zymo có 18 mẫu (60%) đạt nồng độ nhỏ hơn 0,1ng/µl. Trong khi đó, chỉ duy nhất 1 mẫu (3,3%) tách bằng bộ kít MagMAX đạt nồng độ thấp hơn 0,1ng/µl và không có mẫu nào tách bằng bộ kít QIA thấp hơn nồng độ này. Hình 1: Nồng độ cfDNA được tách chiết từ 3 bộ kít khác nhau. Phân bổ kích thước cfDNA giữa các bộ kít Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 Nghiên cứu Y học 189 Kích thước cfDNA dao động từ 150 - 300bp, phân tích nồng độ cfDNA tại vùng kích thước này cho thấy có sự khác nhau về nồng độ cfDNA được thu nhận từ các 3 bộ kit. Trong đó, hàm lượng cfDNA thu được với bộ kít Zymo (đường màu xanh) là thấp nhất, tiếp theo là hàm lượng cfDNA tách bằng bộ kít QIA (đường màu đỏ) và cao nhất là cfDNA được tách bằng kít MagMAX (đường màu đen) (hình 2). Hình 2: Sự phân bố kích thước cfDNA tách bằng các bộ kít khác nhau. Các kít sử dụng trong nghiên cứu đều được các nhà sản xuất thiết kế chuyên biệt cho li trích cfDNA nhằm mục đích thu được tối đa lượng cfDNA. Tuy nhiên, mỗi nhà sản xuất phát triển những công nghệ riêng cho bộ kít của mình. Bộ kít Zymo sử dụng công nghệ cột lọc màng silica để thu giữ cfDNA trong quá trình tách chiết, với công nghệ cột lọc cho phép dung giải cfDNA với thể tích nhỏ (25µl) nhằm tăng nồng độ cfDNA sau tách chiết. Tuy nhiên, nồng độ cfDNA và hàm lượng cfDNA có kích thước 100 - 300bp đều thấp hơn so với 2 bộ kít còn lại, có thể do các cfDNA có kích thước nhỏ bị thất thoát trong quá trình tách chiết. Ngoài khả năng dung giải cfDNA với thể tích nhỏ thì bộ kít QIA có bổ sung thêm RNA-carriers, giúp tăng khả năng thu nhận được nhiều nhất lượng cfDNA. Nồng độ cfDNA thu từ bộ kít QIA tại vùng 100 - 300bp, cao hơn bộ kít Zymo. Ngoài ra bộ kít QIA còn thu được cfDNA có kích thước > 300bp cao hơn 2 bộ kít còn lại (hình 2). Bộ kít MagMAX, sử dụng công nghệ hạt từ để thu nhận cfDNA, có hiệu quả thu nhận cfDNA cao nhất trong 3 bộ kít, và nồng độ cfDNA chủ yếu tập trung tại vùng 100 - 300bp, rất ít cfDNA có kích thước > 300bp được thu nhận. Do cffDNA có kích thước nhỏ hơn 150bp(2) nên các phân mảnh lớn 300bp hầu như không có ý nghĩa trong nghiên cứu các bất thường của cffDNA, ngược lại còn làm giảm đi hàm lượng cffDNA (fetal fraction). Do đó, bộ kít MagMAX có hiệu quả tách chiết tối ưu nhất trong 3 bộ kít được khảo sát trong nghiên cứu của chúng tôi. BÀN LUẬN Thu nhận được cfDNA chất lượng cao tác động rất lớn đến kết quả NIPS. Do nồng độ và kích thước cfDNA rất nhỏ, đồng thời trong huyết tương còn chứa nhiều thành phần khác như protein, vi lượng, dễ gây ức chế phản ứng phân tích là các yếu tố gây ra kết quả âm tính giả. Chính vì vậy, phương pháp tách chiết cần được tối ưu hoá với mục đích thu hồi được tối đa lượng cfDNA trong mẫu huyết tương với Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 190 độ tinh sạch cao. Trong nghiên cứu này, chúng tôi thực hiện đánh giá hiệu quả tách chiết của 3 bộ kít từ các hãng sản xuất khác nhau gồm: kít QIAamp Circulating Nucleic acid (QIAgen), kít Quick-cfDNATMSerum & Plasma (Zymo Research) và kít MagMAX circulating DNA (Applied Biosystems). Không giống các bộ kít phát triển để phân lập DNA bộ gen, các kít này được phát triển chuyên biệt cho ly trích cfDNA với kích thước nhỏ và nồng độ rất thấp. Chính vì vậy lượng mẫu đầu vào có thể thay đổi cũng như điều chỉnh được lượng buffer trong bước dung giải thu hồi nhằm tăng nồng độ cfDNA. Trong nghiên cứu này, tất cả các bộ kít đều sử dụng lượng mẫu đầu vào là 1 ml huyết tương được lấy từ cùng 1 thai phụ và lượng mẫu buffer sử dụng trong bước dung giải thu hồi cfDNA là 30µl. Do đó, chúng tôi có thể đánh giá được hiệu quả tách chiết của từ bộ kít thông qua nồng độ cfDNA thu được và sự phân bố kích thước cfDNA. Thực tế cho thấy, nồng độ cfDNA trong huyết tương rất biến động tuỳ vào từng mẫu. Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy nồng độ này dao động khác nhau tuỳ từng bộ kít sử dụng để tách chiết, thí dụ kít Zymo thu được nồng độ từ 0,052 đến 0,277ng/µl, kít QIA thu được từ 0,1đến 0,312 ng/µl và kít MagMAX thu được từ 0,093 đến 0,591ng/µl. Các yếu tố khách quan tác động nồng độ cfDNA tổng số thông thường do trạng thái sinh lí người mẹ và thai nhi(1). Ngoài ra một số các yếu tố chủ quan như quá trình xử lí mẫu ban đầu, phương pháp tách chiết hay do thao tác của người thực hiện cũng ảnh hưởng nhiều tới nồng độ cfDNA thu nhận, trong đó, phương pháp tách chiết được cho là ảnh hưởng nhiều nhất tới nồng độ cfDNA(5). Chiều dài của cfDNA tương đối nhỏ (150 - 300bp), đặc biệt chiều dài cffDNA thường nhỏ hơn 150bp và có tính phân mảnh cao(2). Theo hướng dẫn của bộ kít Zymo thì màng lọc chỉ giữ lại được các đoạn cfDNA có kích thước lớn hơn 100bp, do đó hiệu suất thu nhận cfDNA chưa thật tối ưu, đặc biệt là các đoạn cffDNA. Ngoài ra, trong 30 mẫu tách chiết bằng bộ kít Zymo cho thấy có 60% lượng mẫu có nồng độ < 0,1ng/µl, chưa đạt được lượng mẫu giới hạn cho phép trong bước chuẩn bị thư viện giải trình tự(3). Trong khi đó, bộ kít QIA có khả năng thu được các cfDNA có kích thước lớn hơn 75bp và có bổ sung RNA-carrier, do đó cfDNA giữ lại được nhiều hơn. Tuy nhiên, phân tích kích thước cfDNA cho thấy các đoạn có kích thước lớn 300bp được thu nhận khá nhiều, đây hầu hết là DNA genome của người mẹ, không có giá trị trong phân tích bất thường DNA thai. Sự tồn tại của cfDNA có kích thước lớn hơn 300bp sẽ làm cho hàm lượng cffDNA thấp bất thường, tác động lớn tới kết quả phân tích. Ngoài ra, RNA- Carrier được xem là một nhân tố ức chế hoạt tính một số enzym trong các phản ứng phân tích. Chất lượng cfDNA thu được bằng bộ kít MagMAX cho thấy có nhiều ưu điểm như nồng độ thu được cao hơn so với 2 bộ kít còn lại, ngoài ra nồng độ này đều tập trung chủ yếu tại vùng DNA có kích thước 100 - 300bp. Do đó, đây được xem là bộ kít tối ưu nhất trong 3 bộ kít sử dụng tách cfDNA từ mẫu huyết tương thai phụ. Có nhiều báo cáo kết quả so sánh từ nhiều phương pháp tách chiết khác nhau. Xue và cộng sự đã so sánh bộ kít QIAamp (Qiagen) với quy trình tách chiết mẫu huyết tương được xử lí nhiệt trong dung dịch triton X-100 và được tinh sạch với phenol/cloroform (THP). Kết quả cho thấy quy trình THP cho hàm lượng cfDNA thu được cao hơn so với phương pháp sử dụng cột lọc(11). Tuy nhiên quy trình THP tương đối độc hại và tốn nhiều thời gian thực hiện, không thích hợp để tích hợp vào các quy trình NIPS thường qui. Năm 2005, nhằm xây dựng được một phương pháp tiêu chuẩn cho phân lập cfDNA từ mẫu huyết tương thai phụ, một dự án với sự tham gia của 12 tổ chức tại châu Âu đã được thành lập và so sánh hàm lượng DNA thu được giữa các qui trình thường quy của mỗi phòng thí nghiệm, kết quả kít QIAamp DSP Virus có kết quả tốt nhất trong các bộ kít được khảo sát(7). Tuy nhiên, năm 2009 hãng QIAgen giới thiệu bộ kít Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 Nghiên cứu Y học 191 QIAamp Circulating Nucleic acid có hiệu quả tách chiết tốt hơn(9). Kết quả nghiên cứu của chúng tôi tương đồng với kết quả công bố của Jorgez và cộng sự đều cho thấy cfDNA được tách chiết bằng công nghệ hạt từ cho kết quả tốt hơn các phương pháp khác(6). Tiềm năng ứng dụng của cfDNA là vô cùng lớn, không chỉ trong NIPS mà còn đặc biệt hữu ích trong nghiên cứu về ung thư. Nồng độ cfDNA trong huyết tương rất có ý nghĩa trong chẩn đoán, tiên lượng và theo dõi liệu pháp điều trị ở bệnh nhân ung thư, đột quỵ, nhiễm trùng huyết, Chính vì vậy, nghiên cứu so sánh khả năng thu nhận cfDNA từ mẫu huyết tương có thể ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác như ung thư và bệnh truyền nhiễm. KẾT LUẬN Phương pháp ly trích cfDNA có thể ảnh hưởng nồng độ và sự phân bố kích thước sản phẩm cfDNA thu nhận. Chúng tôi nhận thấy bộ kít MagMAX Circulating DNA thể hiện nhiều ưu điểm như nhanh chóng, đơn giản, nhạy và đặc hiệu khi li trích cfDNA từ mẫu huyết tương. TÀI LIỆU THAM KHẢO. 1. Ashoor G, Poon L, Syngelaki A, et al (2012). Fetal fraction in maternal plasma cell-free DNA at 11–13 weeks’ gestation: effect of maternal and fetal factors. Fetal Diagn Ther, 31(4), 237–243. 2. Chan KA, Zhang J, Hui AB et al (2004). Size distributions of maternal and fetal DNA in maternal plasma. Clin Chem, 50(1), 88–92. 3. Chang BC, Chareonsirisuthigul T, Janchompoo P et al (2016). Setting Up of First NIPT Service Laboratory in a Thailand Hospital. J Gener Seq Appl, 3(3), 1–5. 4. Clausen FB, Krog GR, Rieneck K. et al (2007). Improvement in fetal DNA extraction from maternal plasma. Evaluation of the NucliSens Magnetic Extraction system and the QIAamp DSP Virus Kit in comparison with the QIAamp DNA Blood Mini Kit. Prenat Diagn, 27(1), 6–10. 5. Huang DJ, Mergenthaler-Gatfield S, Hahn S et al (2008). Isolation of cell-free DNA from maternal plasma using manual and automated systems. Prenatal Diagnosis. Springer, 203–208. 6. Jorgez CJ, Dang DD, Simpson JL et al (2006). Quantity versus quality: optimal methods for cell-free DNA isolation from plasma of pregnant women. Genet Med, 8(10), 615 7. Legler TJ, Liu Z., Mavrou A et al (2007). Workshop report on the extraction of foetal DNA from maternal plasma. Prenat Diagn, 27(9), 824–829. 8. Lo YD, Zhang J, Leung TN et al (1999). Rapid clearance of fetal DNA from maternal plasma. Am J Hum Genet, 64(1), 218–224. 9. Repiská G, Sedláčková T, Szemes T et al.(2013). Selection of the optimal manual method of cell free fetal DNA isolation from maternal plasma. Clin Chem Lab Med, 51(6), 1185–1189. 10. Straver R, Oudejans C, Sistermans EA et al (2016). Calculating the fetal fraction for noninvasive prenatal testing based on genome-wide nucleosome profiles. Prenat Diagn, 36(7), 614–621. 11. Xue X, Teare MD, Holen I et al (2009). Optimizing the yield and utility of circulating cell-free DNA from plasma and serum. Clin Chim Acta, 404(2), 100–104. Ngày nhận bài báo: 10/06/2018 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 20/06/2018 Ngày bài báo được đăng: 20/09/2018