So sánh hai phương pháp tổng hợp gen caf1 mã hóa kháng nguyên vỏ f1 của vi khuẩn yersina pestis

Hóa học & Kỹ thuật môi trường N. P. Minh, , N. N. Hưng, “So sánh hai phương pháp tổng hợp gen Yersina pestis.” 90 SO SÁNH HAI PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP GEN caf1 MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN VỎ F1 CỦA VI KHUẨN Yersina pestis Nguyễn Phượng Minh1*, Lê Trọng Tài1, Ngô Ngọc Trung1, Nguyễn Ngọc Hưng 2 Tóm tắt: Với sự phát triển của ngành sinh học phân tử, việc tổng hợp một trình tự DNA có trình tự mong muốn đang ngày càng tăng lên và dễ dàng hơn. Tuy nhiên một số trình tự gen độc, có tính nguy hiểm có thể không được tổng hợp do liên quan đến vấn đề an toàn. Vì vậy việc chủ động tổng hợp được các trình tự gen mong muốn sẽ có ý nghĩa lớn trong nghiên cứu, chủ động được thời gian và công việc. Trong nghiên cứu này, hai phương pháp tổng hợpgen caf1, mã hóa kháng nguyên F1,nhằm biểu hiệu trong tế bào E. coli được trình bày. Sau khi tối ưu trình tựmã bộ ba cho sự biểu hiện trong tế bào vật chủ E. coli, các đoạn oligos ngắn được thiết kế và tổng hợp, gen caf1được tổng hợp nhân tạo bằng hai phương pháp: “gapless” PCR và TBIO. Tiếp đó, trình tự gen đã tổng hợp được đưa vào vector tách dòng pJET1.2/blunt để kiểm tra khả năng tổng hợp và so sánh giữa hai phương pháp.Trình tự gen đúng được biểu hiện trong tế bàoE. coli. Kết quả giải trình tự cho thấy phương pháp này cho phép tổng hợp được trình tự gen mục tiêu với độ chính xác là 2/6 dòng plasmid. Trình tự gen này đã được đưa vào vector pET-22b(+) và biểu hiện trong tế bào E. coli BL21 (DE3) ở dạng dung hợp với đuôi ái lực (His)10. Các kết quả điện di protein SDS-PAGE, tinh sạch protein bằng sắc ký ái lực Nikelvà Western blot cho thấy kháng nguyên tái tổ hợp F1 đã được tạo ra thành công ở dạng tan trong tế bào E. coli. Từ khóa: Kháng nguyên F1; Tổng hợp gen; Gen caf1. 1. MỞ ĐẦU Dịch hạch là một bệnh truyền nhiễm tiến triển cấp tính, cực nguy hiểm do vi khuẩn Yersinia pestis gây ra. Bệnh lưu hành trong quần thể một số loài động vật gặm nhấm (chủ yếu là chuột) và bọ chét ký sinh trên chúng rồi từ đó lây truyền sang người qua trung gian bọ chét nhiễm khuẩn. Trong lịch sử loài người được ghi nhận cho đến nay, dịch hạch là loại bệnh truyền nhiễm với số ca tử vong cao nhất (khoảng 200 triệu ca) (Perry, Fetherston, 1997). Hiện nay, bệnh dịch hạch vẫn đang lưu hành rải rác tại một số quốc gia trên thế giới. Trong những năm gần đây, tại Việt Nam không ghi nhận trường hợp nào mắc bệnh dịch hạch. Tuy nhiên, nguy cơ lây lan bệnh dịch hạch từ nước ngoài vào Việt Nam là rất lớn (Bộ Y tế, 2014). Mặt khác, Y. pestis còn có thể được sử dụng như vũ khí sinh học với tính hủy diệt rất lớn, gây lo ngại cho cộng đồng quốc tế đặc biệt trong thời điểm hiện nay khi các vụ khủng bố liên tiếp diễn ra trên thế giới (CDC, 2017). Về tác nhân gây bệnh, Y. pestis là trực khuẩn, Gram âm, không di động, không hình thành bào tử thuộc họ Enterobacteriaceae. Sau khi nhiễm vào cơ thể, Y. pestis tiết ra một protein nang được gọi là kháng nguyên F1, chỉ có ở Y. pestis. Do vậy, kháng nguyên này thường được sử dụng trong chẩn đoán bệnh dịch hạch hay phát hiện Y. pestis trong môi trường. Ở Y. pestis, quá trình tổng hợp và tiết kháng nguyên F1 được mã hóa bởi operon F1 bao gồm 4 gen caf1, caf1M, caf1A và caf1R nằm trên plasmid pMT1, trong đó caf1 mã hóa kháng nguyên F1, caf1M và caf1A đóng vai trò trong việc tạo cấu trúc và tiết protein ra bên ngoài tế bào, caf1R đóng vai trò trong điều hòa quá trình phiên mã các gen trên operon (Zhou et al., 2006). Về mặt cấu trúc, kháng nguyên F1 là một chuỗi polypeptide bao gồm 170 axít amin, khối lượng phân tử từ 17-17,6 kDa, điểm đẳng điện 4,1 - 4,4 (Andrews et al., 1996; Galyov et al., 1990). Kháng nguyên F1 là một protein có tính kị nước với cấu trúc bậc hai gấp nếp β (Andrews et al., 1996; Galyov et al., 1990). Nghiên cứu khoa học công nghệ Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số 58, 12 - 2018 91 Kĩ thuật tổng hợp oligonucleotides được thực hiện đầu tiên vào những năm 1960 và đầu những năm 1970 khi thực hiện thành công với gen của enzyme tRNA (Wittig B and Wittig S, 1978). Ngày nay, bằng kĩ thuật PCR có rất nhiều các phương pháp tổng hợp gen được ứng dụng (Ai-Sheng Xiong et al., 2008).Các phương pháp tổng hợp gen đã được miêu tả như sự gắn của hai đôi của các đoạn oligos dựa vào liên kết phosphoryl (Scarpullaet al., 1982; Gupta et al., 1968), phương pháp Fok I (Mandecki and Bolling, 1988) và sửa cấu trúc của chuỗi phản ứng nối cho tổng hợp gen. Nhằm tạo kháng nguyên F1 làm nguyên liệu để chẩn đoán bệnh dịch hạch, nhiều nghiên cứu đã biểu hiện protein kháng nguyên này trong tế bào E. coli (Andrews et al., 1996; Erova et al., 2013; Tsui et al., 2015). Cách tiếp cận được sử dụng phổ biến là biểu hiện toàn bộ operon trong E. coli để tạo kháng nguyên F1 ở dạng ngoại bào tương tự như ở Y. pestis (Andrews et al., 1996; Tsui et al., 2015). Bên cạnh đó, Erova và đồng tác giả (2013) đã biểu hiện trực tiếp gen caf1 trong nội bào của E. colivới việc sử dụng vector biểu hiện pET-20b(+) (Erova et al., 2013). Khi được biểu hiện ở dạng dung hợp với đuôi ái lực (His)6 ở đầu cacboxyl, kháng nguyên F1 có thể được tạo ra ở trạng thái hòa tan (Erova et al., 2013). Trong nghiên cứu này, để tránh các vấn đề liên quan đến an toàn sinh học, chúng tôi đã tiến hành tổng hợp nhân tạo gen caf1và đưa gen này vào vector pET- 22b(+) để biểu hiện kháng nguyên F1 ở dạng dung hợp với trình tự MBP (malto binding protein) và đuôi ái lực (His)10 ở đầu amin. 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Chủng vi sinh vật Chủng E. coli TOP10 [F- mcrA Δ( mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80lacZΔM15 Δ lacX74 recA1 araD139 Δ(araleu)7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG] (Thermosciencetific) được sử dụng để nhân dòng gen. Chủng E. coli BL21 (DE3) [F- ompT hsdSB (rBmB-) gal dcm (DE3)] (Thermosciencetific) được sử dụng để biểu hiện. 2.2. Hóa chất và nguyên vật liệu Hóa chất Enzyme hạn chế NotI, NdeI (NEB), DNA marker (Norgen Biotek), protein chuẩn (Gangnam). Hóa chất cho phản ứng PCR (Thermosciencetific). Skimmedmilked (Difco), 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB, Promega). Kháng thể kháng F1 (HyTest) được sử dụng cho phản ứng lai western blot. Tất cả các hóa chất khác được mua từ hãng Merck. DNA và hệ vector Các đoạn oligos được tổng hợp bởi Công ty Sinh hóa Phù Sa. Bảng 1. Trình tự DNA các đoạn oligo. Hóa học & Kỹ thuật môi trường N. P. Minh, , N. N. Hưng, “So sánh hai phương pháp tổng hợp gen Yersina pestis.” 92 Vector pJET 1.2 (Thermosciencetific) được sử dụng để nhân dòng gen. Hệ vector pET22b(+) (Merck) được sử dụng cho mục đích biểu hiện gen. Trình tự gen mã hóa cho Caf1 được lấy trên GenBank (mã số KM880026) và tối ưu hóa mã bộ ba (chỉ số CAI trước và sau tối ưu lần lượt là 0,67 và 0,79). 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Thiết kế gen caf1 Dựa trên trình tự gen caf1 trên GenBank, chúng tôi sử dụng công cụ tìm kiếm chuỗi bắt cặp (BLAST) và công cụ phân tích mã bộ ba hiếm (GenScrip) để tối ưu bộ ba mã hóa cho chuỗi amino acid. 2.3.2. Tổng hợp gen bằng phương pháp gapless PCR (Lei and Qihan, 2004) Với trình tự DNA đã tối ưu, 22 oligos được thiết kế (Bảng 1), độ dài các đoạn dao động từ 30 đến 50 mer. Các oligo liền kề có các trình tự DNA được gối lên nhau. Quá trình tổng hợp gen gồm 2 giai đoạn: Giai đoạn 1 (tạo đoạn gen): với 22 đoạn oligos được thiết kế gối lên nhau, đoạn oligonucleotide được tổng hợp bằng phản ứng PCR tự mồi, hỗn hợp mồi 0,3 µM, sử dụng Nghiên cứu khoa học công nghệ Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số 58, 12 - 2018 93 enzyme Pfu polymerase. Chu trình nhiệt: 94 oC - 30 giây, 53 oC - 15 giây, 72 oC - 15 giây. (Nhiệt độ bắt cặp được khảo sát tại 4 giá trị nhiệt độ là 49oC, 51oC, 53oC và 550C để chọn nhiệt độ tối ứu cho phản ứng PCR tạo đoạn gen). Giai đoạn 2: nhân gen bằng kỹ thuật PCR bình thường với khuôn là sản phẩm PCR của giai đoạn 1, mồi là 2 oligonucleotide ở 2 đầu đoạn gen của phương pháp 1, enzyme Pfu polymerase. Chu trình nhiệt: 94 oC - 2 phút, 58 oC - 30 giây, 72 oC - 15 giây. 2.3.3. Tổng hợp gen bằng phương pháp TBIO (Xinxin et al., 2003) Từ trình tự DNA tối ưu, 20 oligos được thiết kế (Bảng1). Oligo ở giữa có các trình tự gối lên các oligo liền kề ở bên. Phương pháp TBIO để tổng hợp gen caf1 gồm 3 giai đoạn: Giai đoạn 1 (tạo đoạn gen bên trong): gắn 10 oligos ở chính giữa gen. Olilo ở giữa sẽ gắn kết với hai oligo liền kề, gen được tổng hợp bằng cách kéo dài về hai đầu. Hỗn hợp mồi có nồng độ tăng dần từ trong ra ngoài từ 40, 60, 80, 100, 200 (µM). Sử dụng enzyme pfu polymerase. Chu trình nhiệt: 94 oC - 30 giây, 58 oC - 30 giây, 72 oC - 5 giây. Giai đoạn 2: gắn tiếp 10 oligo bên ngoài vào sản phẩm AND của phản ứng PCR giai đoạn 1. Các oligo cũng có nồng độ tăng dần từ trong ra ngoài 60, 80, 100, 120, 200 (µM). Sử dụng enzyme pfu polymerase. Chu trình nhiệt: 94 oC - 30 giây, 58 oC - 30 giây, 72 oC - 5 giây. Giai đoạn 3: Tạo gen caf1 hoàn chỉnh, khuôn là sản phẩm phản ứng PCR 2, cặp mồi sử dụng là hai oligo ngoài cùng. Sử dụng enzyme pfu polymerase và khảo sát chu trình nhiệt tại 3 nhiệt độ bắt cặp là 64oC, 66oC, 68oC. 2.3.4. Xây dựng hệ vector biểu hiện gen caf1 (pET22b(+)-caf1) Sản phẩm tổng hợp gen caf1 được gắn thêm trình tự MBP (malto binding protein) vào đầu 5’ và đưa vào vecror tách dòng pJET1.2, biến nạp vào tế bào E. coli TOP10. Các dòng tế bào đã chọn lọc được PCR kiểm tra bằng cặp mồi đặc hiệu và giải trình tự để xác định trình tự DNA. Gen caf1 gắn với trình tự MBP (malto binding protein) trong vector tách dòng được cắt và gắn vào vector biểu hiện pET22b(+) bằng vị trí cắt của 2 enzyme HindIII và XhoI. Sản phẩm nối được biến nạp vào tế bào E. coli BL21 (DE3). 2.3.5. Biểu hiện gen Vector biểu hiện mang gen caf1 được biến nạp vào tế bào biểu hiện E. coli BL21 để kiểm tra khả năng biểu hiện của protein tái tổ hợp. Sau khi nuôi cấy qua đêm trong môi trường LB lỏng có chứa ampicilin 100 µg/ml (LBA), dòng tế bào mang gen được chuyển sang môi trường LBA lỏng mới với tỉ lệ 1/100. Nuôi cấy tế bào biểu hiện ở nhiệt độ 37 oC cho đến khi OD 600 của môi trường nuôi cấy đạt giá trị 0,6 - 0,8. Ngay sau đó, chất cảm ứng IPTG được thêm vào tới nồng độ cuối là 0,5 mM. Kết quả của sản phẩm protein tái tổ hợp được kiểm tra trên gel polyacryamide 12% (Hoefer, 1994). 2.3.6. Kiểm tra protein tái tổ hợp bằng Western blot Dịch protein sau khi tinh sạch bằng cột sắc ký ái lực với Nikelđược điện di kiểm tra trên gel acryamide 12% và chuyển lên màng PVDF nhờ hệ thống chuyển màng Trans blot semi dry (Bio-Rad). Màng chứa kháng nguyên được phủ bằng dung dịch khóa màng (Blocking) (5% sữa tách bơ trong dung dịch đệm TBST (0,1% Tween 20 trong đệm Tris-saline)) trong 1 giờ. Sau khi rửa màng 3 lần bằng đệm TBST, màng được ủ với kháng thể 1 (kháng thể kháng Caf1 - HyTest), độ pha loãng 5000 lần. Sau 1 giờ, màng được rửa lại bằng TBST 3 lần để loại bỏ hoàn toàn liên kết không đặc hiệu. Tiếp tục ủ màng với kháng thể 2 (kháng thể cộng hợp enzyme peroxidase kháng chuột - HyTest), độ pha loãng 10000 lần. Sau 2 giờ, màng được rửa lại 3 lần với đệm TBST và phát hiện bằng dung dịch chứa cơ chất cho peroxidase (Promega). Màng trong dung dịch cơ chất được ủ ở nhiệt độ phòng 5 - 10 phút, sau đó được dừng phản ứng bằng H2O. Kết quả được xác định trên ánh sáng thường. Hóa học & Kỹ thuật môi trường N. P. Minh, , N. N. Hưng, “So sánh hai phương pháp tổng hợp gen Yersina pestis.” 94 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Dựa trên trình tự DNA trên GenBank, mã bộ bađược cải biến cho phù hợp với vật chủ biểu hiện (kết quả không được trình bày). Sau đó thiết kế các đoạn oligo để tổng hợp gen mà không cần trình tự khuôn của gen này. Để tổng hợp gen caf1 biểu hiện trong E. coli, hai phương pháp tổng hợp gen đã được sử dụng: phương pháp cổ điển gapless PCR và phương pháp mới TBIO (Thermodynamically balanced inside-out (TBIO) PCR-based gene synthesis). 3.1. Tổng hợp gen caf1 bằng phương pháp gapless PCR Phương pháp tổng hợp gen Gapless PCR có quy trình thực hiện đơn giản, gồm hai bước PCR: (1) “overlap” PCR với khuôn là các oligonucleotide được thiết kế có độ dài từ 30-60 mer phủ kín toàn bộ chiều dài của đoạn gen cần tổng hợp theo cả chiều xuôi lẫn chiều ngược và giữa các oligonucleotide theo chiều xuôi và chiều ngược có các vùng chồng lấp có độ dài từ 15-30 mer; (2) “full length PCR” với khuôn là sản phẩm của “overlap” PCR và mồi là 2 oligonucleotide ở 2 đầu đoạn gen. Dựa trên nguyên tắc này, tổng cộng 22 oligo đã được thiết kế và sử dụng trong phản ứng “overlap” PCR với nhiệt độ bắt cặp mồi được khảo sát là 49oC, 51oC, 53oC và 55oC. Tiếp đó, toàn bộ trình tự gen caf1 được khuếch đại trong phản ứng “full length” PCR với nhiệt độ bắt mồi là 58oC. Kết quả điện di trên gel agarose (Hình 1) cho thấy khi thực hiện phản ứng “overlap” PCR ở các nhiệt độ đã khảo sát đều cho phổ sản phẩm tương tự nhau là một băng chính,rõ nét có kích thước khoảng 500 bp hoàn toàn phù hợp với kích thước của đoạn gen cần tổng hợp là 513bp. Tiếp theo, sản phẩm của phản ứng “full length” PCR được sử dụng để gắn vào vectơ tách dòng pJET1.2 và được biến nạp vào tế bào khả biếnE. coliTOP10. Trong số 15 khuẩn lạc được lựa chọn ngẫu nhiên để đem đi sàng lọc bằng PCR với cặp mồi giải trình tự của vectơ pJET1.2 có 12 khuẩn lạc cho sản phẩm có kích thước phù hợp với tính toán lý thuyết là khoảng 650 bp (kết quả không được thể hiện). Hình 1. Kết quả điện di sản phẩm phản ứng “full length” PCR tổng hợp gen caf1 bằng phương pháp gapless PCR. M: Thang chuẩn DNA, 1-4: khảo sát nhiệt độ bắt cặp mồi trong phản ứng “overlap” PCR tại nhiệt độ 49oC, 51oC, 53oC, 55oC Sau đó, lựa chọn ngẫu nhiên 6 dòng khuẩn lạc đi nuôi cấy trong môi trường LB có bổ sung ampicillin để tách chiết plasmid. Các dòng plasmid này được gửi đi xác định trình tự. Kết quả giải trình tự cho thấy có 2/6 dòng plasmid cho trình tự hoàn toàn chính xác. Các dòng plasmid còn lại có từ 1 - 2 đột biến thay thế hoặc đột biến thừa 1 nucleotide. 3.2. Tổng hợp gen caf1 bằng phương phápTBIO Nghiên cứu khoa học công nghệ Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số 58, 12 - 2018 95 Để tổng hợp gen caf1 bằng phương pháp TBIO, 20 đoạn oligonucleotide đã được thiết kế để sử dụng trong quy trình tổng hợp bao gồm các bước chính sau: (1) PCR-1: Tạo đoạn gen khởi đầu nằm giữa gen caf1 bằng việc sử dụng 10 oligonucleotide từ số 6 đến 15. Sản phẩm PCR được tinh sạch trên gel để sử dụng làm khuôn trong phản ứng PCR-2; (2) PCR- 2: Tạo đoạn gen hoàn chỉnh bằng việc sử dụng sản phẩm PCR-1 với các đoạn oligonucleotide từ số 1-5 và từ 16-20; (3) “full length” PCR: khuếch đại trình tự gen hoàn chỉnh với khuôn là sản phẩm PCR-2 và cặp mồi là 2 oligonucleotide ở 2 đầu đoạn gen. Kết quả điện di trên gel agarose (Hình 2) cho thấysản phẩm của PCR-2 là một dải sản phẩm có kích thước từ 300 đến 500 bp, trong đó đoạn gen caf1 hoàn chỉnh có độ dài theo tính toán lý thuyết là 513 bp. Hình 2. Kết quả điện di sản phẩm phản ứng PCR-2 tổng hợp gen caf1 bằng phương pháp TBIO. Để thu nhận trình tự gen hoàn chỉnh này, sản phẩm PCR-2 đã được sử dụng làm khuôn trong phản ứng “full length” PCR với cặp mồi là 2 oligonucleotide ở 2 đầu đoạn gen. Phản ứng “full length” PCR đã được thực hiện ở 3 nhiệt độ bắt cắp mồi khác nhau là 64oC, 66oC và 68oC.Kết quả điện di sản phẩm “full length” PCR (Hình 3) cho thấy ở 3 nhiệt độ thử nghiệm đều cho kết quả tương tự nhau là một băng có kích thước khoảng 500 bp, phù hợp với kích thước của gen caf1 là 513 bp. Hình 3. Kết quả điện di sản phẩm phản ứng “full length” PCR tổng hợp gen caf1 bằng phương pháp TBIO. 1-3: khảo sát hiệu quả khuếch đại ở 3 nhiệt độ bắt cặp khác nhau là 64oC, 66oC và 68oC; 4: thang chuẩn DNA. Cũng tương tự như trên, sản phẩm full length PCR đã được tinh sạch, nối vào vectơ tách dòng pJET1.2 và biến nạp vào tế bào khả biến E. coliTOP10. Sau quá trình sàng lọc bằng PCR khuẩn lạc, 6 dòng khuẩn lạc được nuôi cấy và tách chiết plasmid (kết quả không được thể hiện). Kết quả giải trình tự các dòng plasmid này cho thấy có 3/6 dòng plasmid cho kết quả chính xác. Ba dòng khuẩn lạc có từ 1-3 đột biến thừa và/hoặc thiếu nucleotide. 3.3. So sánh hai phương pháp tổng hợp gen Hóa học & Kỹ thuật môi trường N. P. Minh, , N. N. Hưng, “So sánh hai phương pháp tổng hợp gen Yersina pestis.” 96 Bảng 2. Thống kê kết quả giải trình tự gen caf1 tổng hợp bằng phương pháp gapless PCR và phương pháp TBIO. Khi so sánh kết quả giải trình tự các dòng plasmid giữa 2 phương pháp tổng hợp gen đã sử dụng (Bảng 2), có thể nhận thấy phương pháp TBIO cho kết quả chính xác hơn so với phương pháp gapless PCR (3/6 dòng plasmid cho kết quả chính xác ở phương pháp TBIO so với 2/6 ở phương pháp gapless PCR). Ở phương pháp gapless PCR, các đột biến xuất hiện chủ yếu là đột biến thay thế nucleotide (chiếm 5 trên tổng số 6 đột biến), chỉ có 1 đột biến thừa nucleotide. Trong khi đó, ở phương pháp TBIO, không xuất hiện đột biến thay thế nào, chủ yếu là đột biến thiếu nu (4/6) và đột biến thừa nu (2/6). Khi so sánh về tính tiện dụng của phương pháp tổng hợp gen, phương pháp gapless PCR có tính đơn giản hơn do chỉ cần thực hiện 2 phản ứng PCR; trong khi đó, ở phương pháp TBIO cần đến 3 phản ứng PCR và sản phẩm PCR-1 và PCR-2 cần được tinh sạch trên gel. Gen caf1 mã hóa protein kháng nguyên nang F1 đã được tối ưu và tổng hợp nhân tạo thành công bằng cả hai phương pháp gapless PCR và TBIO. 3.4. Biểu hiện gen caf1 trong tế bào E. coli BL21 Gen caf1 từ dòng tế bào đã chọn đươc gắn mới trình tự MBP và gắn vào vector biểu hiện pET22b(+) thông qua điểm cắt của 2 enzyme HindIII và XhoI. Sản phẩm nối ghép được biến nạp vào tế bào E. coli BL21 để sàng lọc và biểu hiện. Kết quả phân tích protein Hình 4cho thấy,các phân đoạn rửa giải của quá trình tinh sạch protein MBP-F1 có 2 băng đậm trong đó một băng có kích 63 kDa (đây là băng protein cần mong muốn MBP –F1) và một băng có kích thước 48 kDa (sở dĩ có băng này là do MBP –F1 vẫn chứa đoạn peptide dẫn đường của F1 tự nhiên có thể đã bị phân cắt bởi enzym nội bào của E. coli tạo thành một tiểu phần Protein bao gồm (His)10 –MBP- SP có kích thước khoảng 48 kDa). Có thể khẳng định bước đầu gen caf1 đã được biểu hiện thành công. Hình 4. Kết quả biểu hiện và tinh sạch protein dung hợp pelB-(His)10 - MBP-F1. Nghiên cứu khoa học công nghệ Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số 58, 12 - 2018 97 1:Dịch protein tổng số trước cảm ứng; 2: Dịch protein tổng số trước sau cảm ứng; 3: Dịch protein sau qua cộtsắc ký ái lực Nikel; 4. Dịch rửa; 5: Dịch protein tinh sạch qua cộtsắc ký ái lực Nikelở điều kiện biến tính; 6-9: Dịch protein tinh sạch qua cộtsắc ký ái lực Nikel ở điều kiện tự nhiên; M: Protein chuẩn (Gangnam) Kiểm tra Caf1 tái tổ hợp bằng Western blot Trong quá trình biểu hiện protein tái tổ hợp, một điểm thiết yếu cần phải xác định là protein biểu hiện phải chính xác là protein mong muốn. Một trong những kỹ thuật đấy là Western blot. Phản ứng Western blot được tiến hành với 2 kháng thể đơn dòng kháng F1 là G20 và 3YG8. Kết quả trên hình 5 cho thấy, xuất hiện băng ở kích thước 63 kDa khi tiến hành phản ứng lai Western blot với kháng thể đơn dòng G20 kháng F1. Điều này chứng tỏ, protein đã được biểu hiện trong E. coli (DE3) ở dạng dung hợp pelB -(His)10- MBP-F1 và có hoạt tính kháng nguyên.Điều này có thể khẳng định, protein Caf1 đã được biểu hiện thành công trong hệ vector pET22b(+) ở dạng tan và có hoạt tính kháng nguyên. Hình 5. Kết quả phân tích Western blot protein tinh sạch pelB -(His)10-MBP-F1 với kháng thể đơn dòng G20 kháng F1. M: thang chuẩn protein GangNam-STAIN; 1: Protein trong điều kiện không cảm ứng; 3: Protein tổng số dạng tan; 4: Protein sau khi tinh sạch bằng sắc ký ái lực Ni trong điều kiện tự nhiên. 4. KẾT LUẬN Với mục tiêu tạo ra sản phẩm DNA mong muốn mà không cần trình tự DNA mạch khuôn, gen caf1 có kích thước 513 bp đã được tổng hợp thành công bằng 2 phương pháp: gapless PCR và TBIO. Hơn nữa, đã biểu hiện thành công protein độc này trong tế bào E. coli ở dạng tan. Kết quả này cho phép tổng hợp các gen một cách chủ động, mở ra triển vọng tổng hợp các gen tái tổ hợp khó trong tương lai. Lời cảm ơn: Công trình được thực hiện bằng nguồn kinh phí Đề tài Nghiên cứu Khoa học Công nghệ cấp Bộ Quốc phòng theo Hợp đồng nghiên cứu khoa học và công nghệ cấp Bộ Quốc phòng, mã số đề tài: 216.33.051. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Perry R.D., Fetherston J.D . “Yersinia pestis etiologic agent of plague”.Clin Microbiol Rev. 10(1)(1997), tr: 35-66. Hóa học & Kỹ thuật môi trường N. P. Minh, , N. N. Hưng, “So sánh hai phương pháp tổng hợp gen Yersina pestis.” 98 [2]. Bộ Y tế. Quyết định “Về việc ban hành kế hoạch hành động phòng chống dịch hạch tại Việt nam. 5126/QĐ-BYT (2014), tr: 1-22. [3]. Centers for Disease Control and Prevetion. “Plague in the United States”. CDC (2017). [4]. Zhou D, Han Y, Yang R. “Molecular and physiological insights into plague transmission, virulence and etiology”. Microbes Infect. 8(1)(2006), tr: 273-84. [5]. Andrews GP, Heath DG, Anderson GW Jr, Welkos SL, Friedlander AM.“Fraction 1 capsular antigen (F1) purification from Yersinia pestis CO92 and from an Escherichia coli recombinant strain and efficacy against lethal plague challenge”.Infect Immun.64(6)(1996), tr: 2180-7. [6]. Galyov EE., Smirnov OY, Karlishev AV, Volkovoy KI, Denesyumk AI, Nazimov IV, Rubtsov KS, Abramov VM, Dalvadyanz SM, and Zav’yalov VP. “Nucleotide sequence of the Yersinia pestis gene encoding F1 antigen and the primary structure of the protein”. FEBS Lett. 277(1990), tr: 230–232. [7]. Wittig B and Wittig S. “Reverse transcription of tRNA”. Nucleic Acids Res.5(4) (1978), tr: 1165–1178. [8]. Ai-Sheng Xiong, Ri-He Peng, Jing Zhuang, Feng Gao, YiLi, Zong-Ming Cheng & Quan-Hong Yao.“Chemical gene synthesis: strategies, softwares, error corrections, andapplications”,FEMS Microbiol Rev.32 (2008), tr: 522 – 540. [9]. Scarpulla,R.C., Narang,S. and Wu, R. “Use of a new retrieving adaptor in the cloning of a synthetic human insulin A-chain gene”.Anal.Biochem, 121 (1982), tr: 356-365. [10]. Gupta,N.K., Ohtsuka,E., Sgaramella,V., Buchi,H., Kumar,A., Weber,H. and Khorana,H.G. “Studies on polynucleotides, 88. Enzymatic joining of chemically synthesized segments corresponding to the gene for alanine-tRNA”.Proc. Natl Acad. Sci. USA,60(1968), tr: 1338-1344. [11]. Mandecki,W. and Bolling,T.J. “FokI method of gene synthesis”.Gene, 68(1988), tr: 101-107. [12]. Erova TE, Rosenzweig JA, Sha J, Suarez G, Sierra JC, Kirtley ML, van Lier CJ, Telepnev MV, Motin VL, Chopra AK. “Evaluation of protective potential of Yersinia pestis outer membrane protein antigens as possible candidates for a new- generation recombinant plague vaccine”. Clin Vaccine Immunol.20(2)(2013), tr: 227-38. [13]. Tsui PY, Tsai HP, Chiao DJ, Liu CC, Shyu RH. “Rapid detection of Yersinia pestis recombinant fraction 1 capsular antigen”.Appl Microbiol Biotechnol.99(18)(2015), tr: 7781-9. [14]. Lei Young and Qihan Dong. “Two-step total gene synthesis method”.Nucleic Acids Research,32(7) (2004) [15]. Xinxin Gao, Peggy Yo, Andrew Keith,, Timothy J. Raganand Thomas K. “Thermodynamically balanced inside-out (TBIO) PCR-based gene synthesis: a novel method of primer design for high-®delity assembly of longer gene sequences”,Nucleic Acids Research, 31(22) (2003). [16]. Hoefer. “Protein electrophores”,User Manua,(1994). Nghiên cứu khoa học công nghệ Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số 58, 12 - 2018 99 ABSTRACT COMPARISON OF TWO METHODS FOR SYNTHESIZING THE GENE caf1 ENCODING FOR THE F1 CAPSULAR ANTIGEN OF Yersinia pestis In the post-genomic era, the demand for synthesizing a desired DNA sequence is increasing and easier.However, some dangerous and harmful gene sequences may not be synthesized due to safety reasons. Therefore, it would be of great significance to reduce the cost and time of gene synthesis, thereby gaining the initiative in research. In this study, we describe two methods for synthesizing the gene caf1, encoding for F1 antigen, to express in E. coli. After the codon optimization for the expression in E. coli host cells, short oligos were designed and synthesized. Gene caf1 was synthesized artificially by two methods: “gapless” PCR and TBIO (Thermodynamically balanced inside-out). The synthesized sequences were then introduced into the cloning vector pJET1.2/blunt to check and compare the synthesis ability of the two techniques. The correct sequence of genes is expressed in E. coli.Data show that both strategies allow synthesizing the target sequence, with the accuracy of 2/6 plasmid lines for “gapless” technique and 3/6 for TBIO.The target sequence was then introduced into pET-22b(+) vector and expressed in E. coli BL21 (DE3) in the form of (His)10 affinity tag fusion. As the result of SDS-PAGE, the recombinant protein Caf1 was expressed in E. coli as soluble form and was purified by His-tag affinity chromatography. The recombinant Caf1 was then confirmed by Western blot with Caf1 antibody. Keywords: F1 antigen; Gene synthesis; Caf1 gene. Nhận bài ngày 19 tháng 6 năm 2018 Hoàn thiện ngày 29 tháng 10 năm 2018 Chấp nhận đăng ngày 11 tháng 12 năm 2018 Địa chỉ: 1Viện Hóa học, Môi trường quân sự; 2Viện Vệ sinh dịch tễ Tây Nguyên. *Email: nguyenminh_ctet@yahoo.com.vn.