Số lượng tế bào T CD8 (+) và tế bào T CD 4 (+) ở bệnh nhân bị nhiễm siêu vi viêm gan C mạn có men gan bình thường và ở bệnh nhân có men gan tăng

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 9 * Phụ bản của Số 1 * 2005 Nghiên cứu Y học SỐ LƯỢNG TẾ BÀO T CD8 (+) VÀ TẾ BÀO T CD 4 (+) Ở BỆNH NHÂN BỊ NHIỄM SIÊU VI VIÊM GAN C MẠN CÓ MEN GAN BÌNH THƯỜNG VÀ Ở BỆNH NHÂN CÓ MEN GAN TĂNG Đỗ Đại Hải*, Huỳnh Thanh Bình*, Võ Ngọc Quốc Minh*, Phạm Hoàng Phiệt* TÓM TẮT Viêm gan siêu vi C (VGSV-C) là một quá trình bệnh lý miễn dịch với sự gia tăng ALT phản ánh sự tác động chống lại siêu vi C của tế bào lymphô T. Công trình được thiết kế nhằm khảo sát sự khác biệt của các dưới quần thể lymphô T trong máu ngoại vi của bệnh nhân VGSV-C mạn có ALT bình thường so với nhóm bệnh nhân có men gan tăng. 16 bệnh nhân có ALT tăng (nhóm B), 13 bệnh nhân có men gan bình thường (nhóm A), cả 2 nhóm bệnh nhân được lựa chọn có tuổi và giới tương đương. Tỷ lệ và số lượng tế bào TCD4 và TCD8 được thực hiện bằng máy đếm tế bào dòng chảy (FACS calibur flow cytometer của Becton Dickinson) Kết quả cho thấy không có sự khác biệt TCD4+ ở 2 nhóm bệnh nhân. Số lượng tế bào TCD8+ tăng có ý nghĩa thống kê ở nhóm A so với người bình thường và nhóm B. Phải chăng sự gia tăng TCD8 là một yếu tố để tiên lượng tốt. Chúng tôi sẽ tiếp tục nghiên cứu cắt dọc trên bệnh nhân VG-C viêm gan C có điều trị. SUMMARY SUBPOPULATION OF T CELLS (TCD4 AND TCD8) IN TWO GROUPS OF PATIENTS WITH CHRONIC HEPATITIS C: NORMAL ALT GROUP AND ELEVATED ALT GROUP. Do Dai Hai, Huynh Thanh Binh, Vo Ngoc Quoc Minh, Pham Hoang Phiet * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 9 * Supplement of No 1 * 2005: 52 – 56 It is well accepted that the chronic active hepatitis C is an immunopathologic process in which the elevation of ALT level may reflex the activation of Tc cells against infected hepatocytes. The aim of this study is to investigate the differences of T cell subpopulations between the patients with chronic hepatitis C having elevated ALT level and those with normal ALT. 16 chronic hepatitis C with elevated ALT level (group B) are matched with 13 patients with normal ALT (group A). Absolute number and percentage of T cell subpopulations (TCD4, TCD8, TCD3+8+, TCD3+4+) are performed on Cell Dyn 3500 (Abbott) and FACS calibur flow cytometer (Becton Dickinson) The results: The TCD4+ subpopulation is similar between the two groups. The absolute number as well as the percentage of TCD8+ subpopulation is significantly higher in group A patients comparing with group B patients and normal population. The mechanism of this difference is still an open question for the moment. ĐẶT VẤN ĐỀ Viêm gan siêu vi C là một bệnh lý miễn dịch. Trên lâm sàng tổn thương tế bào gan được biểu hiện gián tiếp qua sự tăng men gan ALT. Tổn thương mô bệnh học là biểu hiện trực tiếp của hoại tử tế bào gan song trên thực tế Việt Nam việc sinh thiết gan rất ít được thực bệnh nhân. Về cơ chế bệnh sinh, đáp ứng miễn dịch dịch thể không giữ vai trò quan trọng trong sự gây tổn thương tế bào gan, các nghiên cứu mới đây cho thấy bản thân HCV cũng không trực tiếp gây tổn thương tế bào gan. Sự hủy hoại tế bào bị nhiễm là do các tế bào lymphô T gây độc với sự hổ trợ của tế bào T giúp * Bộ môn Sinh lý bệnh – Miễn dịch – ĐH Y Dược TP. Hồ Chí Minh Chuyên đề Y Học cơ sở 52 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 9 * Phụ bản của Số 1 * 2005 đỡ. Bởi vậy mục tiêu của nghiên cứu này là so sánh các quần thể tế bào T ở máu ngoại vi (qua các dấu ấn CD4, CD8, CD3) trên các bệnh nhân nhiễm mạn tính siêu vi viêm gan C ở nhóm có men ALT bình thường và ở nhóm có men ALT cao. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đây là một nghiên cứu có kiểm soát và tiền cứu Đối tượng Tiêu chuẩn chọn bệnh Bệnh nhân nhiễm HCV mạn tính có anti HCV dương tính đến khám và theo dõi ở phòng khám viêm gan của Bệnh Viện Đại Học Y Dược TP. Hồ Chí Minh từ tháng: 6-2002 đến tháng 12-2002,. Thuộc cả 2 giới và ở trong lứa tuổi từ 30 đến 62, chưa điều trị. Phân nhóm Các bệnh nhân đủ tiêu chuẩn trên nếu có men ALT bình thường sẽ được chọn (nhóm A) và một bệnh nhân khác khám sau đó nếu có men ALT tăng ≥ 80IU/L, cùng giới, tuổi không chênh lệch quá 5 tuổi cũng được chọn (nhóm B) Loại trừ Tất cả bệnh nhân đồng nhiễm HIV, HBV, các bệnh nhiễm mạn kèm theo, sử dụng corticoids, có thai và cho con bú. Phương pháp Các đối tượng đã chọn được lấy máu tĩnh mạch trong chất chống đông EDTA và thử ngay. Công thức máu và số lượng được đếm trên máy tự động Cell Dyne 3500 của hãng Abbott Chúng tôi sử dụng phương pháp nhuộm huỳnh quang miễn dịch trực tiếp và đếm tế bào dòng chảy (Direct Immunofluorescence Staining of Cell Surfaces and flow cytometry). Phân định tế bào dựa trên sự hiện diện của kháng nguyên bề mặt. Với hệ thống FACS Calibur 4 màu, chúng tôi có thể nhận diện được cùng một lúc 4 dấu ấn trên bề mặt tế bào. Trong nghiên cứu này chúng tôi phân tích 3 dấu ấn: CD3+, CD4+, CD8+. Sau đó, dùng phần mềm Cell Quest để tính toán tỷ lệ các dưới quần thể (TCD3, TCD4, TCD8, TCD3+4+, TCD3+8+) Bộ Kit định danh gồm các kháng thể đơn dòng có gắn huỳnh quang khác nhau: FITC, PE, Per CP, APC do hãng Becton Dickinson cung cấp đã được chúng tôi sử dụng. Số liệu được xử lý bằng các phương pháp thống kê y sinh học, sử dụng phần mềm SPSS 10.0 được dùng để phân tích dữ liệu. KẾT QUẢ Bảng 1: Tuổi và giới Nhóm A Nhóm B Tuổi trung bình Tổng số bệnh nhân 13 16 Nam 5 11 45,00 ± 8,68 Nữ 8 5 46.69 ± 9, 94 Nhận xét: không có sự khác biệt về tuổi ở 2 nhóm nam và nữ (p= 0,629) Bảng 2: Số lượng tuyệt đối tế bào mang dấu ấn CD3, CD4,CD8 và ở máu ngoại vi của 2 nhóm bệnh nhân. Số lượng tế bào / μl Dấu ấn Nhóm A Nhóm B P CD3 1809 ± 648 1608 ± 458 0,200 CD4 960 ± 429 901 ± 354 0,689 CD8 1125 ± 401 856 ± 547 0,151 Nhận xét: Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về số lượng tế bào mang dấu ấn CD3+, CD4+, CD8+ ở nhóm có men gan bình thường (nhóm A) và ở nhóm có men gan tăng (nhóm B) Bảng 3: Số lượng các dưới quần thể lymphô T ở máu ngoại vi của hai nhóm bệnh nhân tính theo kết hợp 2 dấu ấn Số lượng tế bào / μl Dấu ấn Nhóm A Nhóm B P CD3+ CD4+ 925 ± 414 872 ± 360 0,718 CD3 +CD8+ 860 ± 337 613 ± 236 0.028 Nhận xét: Không có sự khác biệt về số lượng tế bào T CD3+CD4+ ở hai nhóm bệnh nhân. Số lượng tế bào TCD3+CD8+ ở nhóm có men gan bình thường cao hơn ở nhóm viêm gan có ý nghĩa thống kê (p= 0,028) Miễn Dịch– Sinh Lý Bệnh 53 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 9 * Phụ bản của Số 1 * 2005 Nghiên cứu Y học 0 200 400 600 800 1000 CD3+CD4+ CD3+CD8+ Nhóm A Nhóm B Biểu đồ 1 Bảng 4: So sánh số lượng các dưới quần thể tế bào T giữa 2 nhóm bệnh nhân và số lượng tế bào TCD3CD4 và TCD3CD8 của người bình thường. Số lượng tế bào / μl Dấu ấn Nhóm A Giá trị bình thường* P CD3+ CD4+ 925 ± 414 915 ± 339 0,928 CD3 +CD8+ 860 ± 337 626 ± 245 0.005 0 200 400 600 800 1000 CD3+ CD4+ CD3 +CD8+ Nhóm A Bình thường Biểu đồ 2 Nhận xét: Số lượng tế bào CD3+CD4+ của các bệnh nhân không viêm gan không khác với người bình thường. Số lượng tế bào CD3+CD8+ nhiều hơn ở người bình thường có ý nghĩa thống kê (p=0,005) Bảng 5: Số lượng tế bào / μl Dấu ấn Nhóm B Giá trị bình thường* P CD3+ CD4+ 872 ± 360 915 ± 339 0,667 CD3 +CD8+ 613 ± 236 626 ± 245 0.849 Nhận xét: Số lượng tế bào CD3+CD4+ và CD3+CD8+ ở bệnh nhân viêm gan không khác với người bình thường. Ghi chú: Số lượng tế bào TCD4+ và TCCD8+ ở người bình thường. (5) BÀN LUẬN Đáp ứng miễn dịch chống HCV khá phức tạp, đến nay chưa có nhiều nghiên cứu trực tiếp trên người, các hiểu biết chủ yếu thu được từ nghiên cứu trên thực nghiệm (chimpanzee). Đáp ứng miễn dịch bẩm sinh không phát huy được tác dụng loại trừ được vi rút vì bị ức chế ngay từ đầu dưới tác động bởi các kháng nguyên của vi rút như protein E2. Kháng thể đặc hiệu thường chỉ được hình thành sau 7-10 tuần [3] từ khi nhiễm là dấu hiệu cho biết nhiễm HCV chứ không thể lọai trừ tế bào bị nhiễm vì kháng thể chống kháng nguyên protein vỏ thường có tác động trung hòa chống sự xâm nhập của virus vào tế bào và nhắm vào virus để chúng bị loại bỏ bởi tế bào thực bào. Kháng thể chỉ gây tổn thương tế bào gan khi nhận điện được kháng nguyên trên màng tế bào, nhưng đến ngày nay các kháng nguyên cấu trúc, E1, E2, NS3,NS4 chỉ thấy trong bào tương của tế bào gan(6), chưa thấy trên màng tế bào (in vivo và in vitro) (Hình 1). Vì vậy tổn thương tế bào gan thông qua kháng thể không giữ vai trò quan trọng và hầu như không tham gia vào cơ chế viêm gan do HCV. Đến nay người ta nghĩ rằng đáp ứng miễn dịch tế bào giữ vai trò quan trọng trong việc kiểm soát tình trạng nhiễm, gây tổn thương gan khi loại trừ tế bào bị nhiễm nên việc nghiên cứu đáp ứng miễn dịch tế bào thông qua việc nghiên cứu số lượng các dưới quần thể tế bào lymphô TH (TCD4+) và TC (TCD8+) ở máu ngoại vi có thể giúp ích cho việc đánh giá phần nào trạng thái miễn dịch của người bệnh. Hình 1: Đáp ứng miễn dịch chống HCV Chuyên đề Y Học cơ sở 54 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 9 * Phụ bản của Số 1 * 2005 Trong công trình nghiên cứu trên hai nhóm bệnh nhân bị nhiễm HCV, nhóm A là nhóm có ALT bình thường nói lên trạng thái tự giới hạn được tình trạng nhiễm, chúng tôi thấy số lượng tế bào TCD4+ không khác với người bình thường, trong khi số lượng tế bào TCD8+ nhiều hơn ở người bình thường có ý nghĩa thống kê (p=0,005) (Bảng 4). Khi so sánh với số lượng tế bào TCD8+ ở nhóm có viêm gan chúng tôi nhận thấy số lượng tế bào TCD8+ ở bệnh nhân có men gan bình thường cũng cao hơn (p=0.028) (Bảng 3). Phải chăng có tình trạng đáp ứng tăng sinh mạnh của các tế bào T gây độc, nhờ đó việc kiểm soát tình trạng nhiễm có hiệu quả. Chúng tôi thấy nhận định này cũng phù hợp với các chuyên gia về viêm gan khi nghiên cứu trên chimpanzee là: có sự đáp ứng tăng sinh lâu dài của tế bào TCD8+ trên con vật loại trừ được HCV (7), điều này không xảy ra trên những con vật tiếp tục bị viêm gan mạn. Điều này khác với viêm gan siêu vi B mà trước đây chúng tối đã nghiên cứu, trên nhóm bệnh nhân có viêm gan (ALT tăng), số lượng tế bào TCD4+ và TCD8+đều gia tăng. 1000 100 10 106/ml 1 0 0 1 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Thời gian (tuần) HCV ALT HCV / tổn thương gan Biểu đồ 3: Gần đây công trình tổng quan về nghiên cứu động học đáp ứng miễn dịch của HCV và HBV (3) cho thấy HCV sao chép rất sớm, trong vòng 1 tuần sau nhiễm số lượng HCV có thể đạt đến 106/ml trước khi men gan ALT gia tăng (Hình 2), có thể sự gia tăng này đã kích thích TCD8+ đặc hiệu hoạt động. Cerney(8) khi nghiên cứu về tế bào TCD8+ trên bệnh nhân viêm gan do vi rút C, bằng phương pháp hồi qui tuyến tính để tính ra số tế bào tiền thân của T gây độc (CTLs), có thể ước đoán số lượng tế bào TCD8+ ở máu ngoại vi có thể gấp 10-100 lần hơn số lượng tế bào TCD8+ hiện diện tại gan. Mặc dù có sự tạo khoang (compartmentalization), việc nghiên cứu các tế bào lymphô từ máu ngoại vi cũng có thể mang lại nhiều ý nghĩa trên thực hành. Trên nhóm bệnh nhân bị viêm gan do vi rút C mạn, chúng tôi nhận thấy số lượng tế bào TCD4+, TCD8+ không khác với người bình thường (Bảng 4) và khi so sánh với nhóm A, số lượng TCD8+ có trị số thấp hơn có ý nghĩa thống kê (p=0.028) (Bảng 3). Với số liệu này chúng tôi có thể nói không có sự đáp ứng tăng sinh tế bào T gây độc, điều này cũng phù hợp với các chuyên gia về viêm gan do vi rút (3): có sự suy sụp về cả đáp ứng miễn dịch dịch thể và tế bào ở bệnh nhân viêm gan siêu vi C mạn, số lượng tế bào CTLs giảm dần về số lượng và chất lượng cả trong gan và trong máu ngoại vi do sự đáp ứng lệch về hướng đáp ứng Th2. Do đó dù CTLs giữ vai trò trong sự tổn thương tế bào gan nhưng không đủ khả năng loại trừ siêu vi. Tóm lại, ở bệnh nhân có khả năng tự kiểm soát được tình trạng nhiễm, có sự đáp ứng tăng sinh tế bào TCD8+ trong máu ngoại vi. Miễn Dịch– Sinh Lý Bệnh 55 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 9 * Phụ bản của Số 1 * 2005 Nghiên cứu Y học KẾT LUẬN Số người bị nhiễm HCV ngày càng tăng, hiện tại ở Việt Nam tỷ lệ nhiễm tùy theo thống kê có thể từ 4 đến 10%, trong đó có 80% diễn tiến thành viêm gan mạn. Hiện nay việc điều trị dựa trên nguyên lý ức chế sự sao chép phối hợp với các thuốc điều biến miễn dịch (IFN α, Thymosine α). Việc kích hoạt hệ thống miễn dịch bằng vaccine trị liệu (therapeutic vaccine) phối hợp với ức chế sao chép của virút (ribavirin) là một chiến lược mới đang được cổ vũ. Qua nghiên cúu chúng tôi nhận thấy có sự gia tăng tế bào TCD8+ rất rõ nét ở những bệnh nhân tự kiểm soát được vi rút. Như vậy trong quá trình điều trị, sự gia tăng số lượng tế bào TCD8+ phải chăng là một yếu tố để tiên lượng tốt, để chúng minh điều này chúng tôi sẽ thực hiện nghiên cứu cắt dọc trên bệnh nhân viêm gan C có điều trị. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bertoletti A. Ferrari C. Kinetics of immune response during HBV and HCV infection July 2003- Volume 23- Number 1 2. Cerney A, MacHutchinson JG. Cytotoxic T lymphocyte response to hepatitis C derived peptids containing the HLA A.2.1 binding motif. Journal of Clincal Investigation 1995; 95: 521-530. 3. Nelson. DR Lau JYN. Pathogenesis of chronic hehatitis C virus infection, page 65-76, 1998. 4. Schinazi RF. Therapies for viral hepatitis. International medical press, 1998 5. Selby MJ, Choo QL, Berger K. Expression, identification and subcellular localization of proteins encoded by the hepatitis C genome. Journal of General Virology 1993; 74:1103-1113. 6. Thimme R, Oldach D, Chang KM. Determinants of viral clearance and persistence during acute hepatitis C infection. J Exp Med 2001: 194:1395-1406. 7. Tran Khiem Hung, Lymphocyte subpopulation in healthy adults donors of Ho Chi Minh City. Viet Nam. Journal of Medical Research. Vol 26. No 6. 2003. pp 27-32. 8. Võ Ngọc Quốc Minh. Điều trị viêm gan siêu vi C bằng phối hợp bằng Ribavirin và Interferon. Luận văn thạc sĩ y học. 2003 Chuyên đề Y Học cơ sở 56