Sinh tổng hợp mới (de novo) liên tục và chuyển hoá nhanh thành bilirubin của haem là cần thiết đối với cơ chế bảo vệ tế bào

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 5 * 2016 SINH TỔNG HỢP MỚI (DE NOVO) LIÊN TỤC VÀ CHUYỂN HOÁ NHANH THÀNH BILIRUBIN CỦA HAEM LÀ CẦN THIẾT ĐỐI VỚI CƠ CHẾ BẢO VỆ TẾ BÀO Trần Tiến Tài* TÓM TẮT Mở đầu: Haem đóng vai trò một thành phần cấu tạo của nhiều protein tham gia vào quá trình vận chuyển oxy, chuỗi hô hấp và chuyển hoá thuốc. Tuy vậy, quá trình dị hoá của haem ở tế bào động vật vẫn còn nhiều điều chưa sáng tỏ. Haem giáng hoá thành sắt, carbon monoxit (CO) và biliverdin, chất sau đó được chuyển hoá thành bilirubin. Do việc định lượng bilirubin tương đối phức tạp, dù có quan trọng về mặt lâm sàng lâm sàng,quá trình sản xuất và vận chuyển sản phẩm này còn nhiều điều chưa được làm rõ. Đối tượng - Phương pháp nghiên cứu:Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng UnaG, một loại protein huỳnh quang gắn bilirubin được tìm thấy gần đây, vào việc khảo sát bilirubin trên nhiều dòng tế bào người. Kết quả:Chúng tôi tìm thấy một lượng bilirubin đáng kể được tạo ra ở nhiều dòng tế bào không phải huyết cầu. Những kết quả thu được cho thấy có sự tổng hợp haem ở mức cơ sở và sự chuyển hoá tiếp tục thành bilirubin. Đáng chú ý, nhiều biến đổi quan trọng được ghi nhận với bilirubin khi tế bào ở trạng thái tress. Kết luận: Do tổn thương tế bào khi stress bị thúc đẩy bởi sự phong toả chuyển hoá haem nhưng lại được cải thiện bởi việc bổ sung biliverdin và bilirubin, có khả năng sự tổng hợp mới haem và chuyển hoá thành bilirubin theo sau đó đóng vai trò không thể thiếu trong bảo vệ tế bào khỏi sự tổn thương. Từ khoá: bilirubin, haem, bảo vệ tế bào ABSTRACT CONTINUOUS DE NOVO BIOSYNTHESIS OF HAEM AND ITS RAPID TURNOVER TO BILIRUBIN ARE NECESSARY FOR CYTOPROTECTION AGAINST CELL DAMAGE Tran Tien Tai * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement of Vol. 20 - No 5 - 2016: 42 - 51 Background: It is well known that haem serves as the prosthetic group of various haemoproteins that function in oxygen transport, respiratory chain, and drug metabolism. However, much less is known about the functions of the catabolites of haem in mammalian cells. Haem is enzymatically degraded to iron, carbon monoxide (CO), and biliverdin, which is then converted to bilirubin. Owing to difficulties in measuring bilirubin, however, the generation and transport of this product remain unclear despite its clinical importance. Objectives-Method: We used UnaG, the recently identified bilirubin-binding fluorescent protein, to analyses bilirubin production in a variety of human cell lines. Results:We detected a significant amount of bilirubin with many non-blood cell types, which was sensitive to inhibitors of haem metabolism. These results suggest that there is a basal level of haem synthesis and its conversion into bilirubin. Remarkably, substantial changes were observed in the bilirubin generation when cells were exposed to stress insults. Conclusion: Since the stress-induced cell damage was exacerbated by the pharmacological blockade of haem metabolism but was ameliorated by the addition of biliverdin and bilirubin, it is likely that the de novo synthesis of haem and subsequent conversion to bilirubin play indispensable cytoprotective roles against cell damage. * Bộ môn Sinh lý – Sinh lý bệnh – Miễn dịch học, ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch Tác giả liên lạc: TS.BS. Trần Tiến Tài ĐT: 0908610974 Email: trantientai@pnt.edu.vn 42 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện An Bình năm 2016 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 5 * 2016 Nghiên cứu Y học Key worlds: bilirubin, haem, against cell damage MỞ ĐẦU qua chất cảm ứng với stress HO-1(34,13). Vì vậy, sự cảm ứng HO-1 sinh lý có khả năngbảo toàn mô Haem cần 8 men trong quá trình sinh tổng trước các stress oxy hoá, góp phần vào sự điều hợp và 3 men cho sự giáng hoá nó. Ba bước khởi hoà các đáp ứng viêm in vivo, và hoạt động như đầu và kết thúc của tổng hợp hợp haem diễn ra một cơ chế tự vệ của mô(34,13,19). Tuy nhiên, cơ chế trong ty thể. Trongphản ứng đầu tiên, 5- chính xác của phản ứng HO-1 đối với chức năng aminolevulenic acid (ALA) synthase xúc tác sự bảo vệ này vẫn còn chưa rõ. ngưng kết glycine và succinyl-CoA tạo thành Gần đây,protein huỳnh quang tìm thấy trong ALA(36,30). Ferrochelatase là men tổng hợp cuối lươn UnaG được phát hiện gắn với bilirubin tự cùng, xúc tác cho việc gắn sắt vào do với ái lực cao(18). Việc định lượng bilirubin protoporphyrin IX (PPIX) để tạo thành haem(29,5). trong mô và huyết thanh trở thành một ứng Haem tạo thành được dụng hữu ích của UnaG. Chúng tôi khảo sát sự vận chuyển ra khỏi ty thể và sử dụng để tạo tạo thành bilirubin ở tế bào người bằng UnaG và nên các protein hoàn chỉnh. Chuỗi chuyển hoá tìm thấy tất cả các dòng tế bào được khảo sát liên haem được điều hoà tại một vài bước và còn tục sản xuất và phóng thích bilirubin, thông qua chịu sự điều khiển của nhịp sinh học, các sinh tổng hợp haem. Thêm vào đó, tế bào duy trì hormones và stress oxi hoá(8,15,14). Tuy vậy, sự liên dòng chuyển hoá haem, sản xuất và phóng thích kết giữa haem và các con đường chuyển hoá sản phẩm đầu cuối bilirubin. Hoạt động trao đổi khác vẫn còn ít được biết đến. chất liên tục này của haem cần thiết cho sự bảo Bilirubin là sản phẩm cuối cùng của sự giáng vệ tế bào khỏi tress và duy trì cân bằng nội môi hoá haem. Nó được tạo ra từ phản ứng với haem của chúng. oxygenase (HO), có tác dụng giáng hoá haem PHƯƠNG PHÁP thành biliverdin, sắt và carbon monoxide (CO)(3,1). Cuối cùng, biliverdin reductase trong tế Xây dựng plasmid biểu hiện UnaG bào chất tạo ra bilirubin, chất được đào thải sau Để xây dựng vector vi khuẩn biểu hiện mang khi liên hợp với glucoronate trong gan. HO (gồm UnaG, pcDNA3-flag-UnaG(18) được cắt với các HO-1 và HO-1) đóng vai trò là một chất điều hoà men BamHI và EcoRI, và đoạn chèn được phân có tác dụng duy trì nồng độ haem nội bào. Sắt lập gắn vào các điểm BamHI và EcoRI của tạo bởi HO được tái sử dụng vào các protein có pET32a(+). Tiếp theo, pET-UnaG được chuyển chứa sắt(26,10,25). Bilirubin có đặc tính chống oxy vào BL21. UnaG được cảm ứng với 0.3mM hoá(24,35). Dạng liên hợp của nó không tan trong isopropyl thiogalactopyranoside (IPTG) và tinh nước, gắn vào albumin và được chuyển vào tế sạch bằng hạt ion nickel. bào gan thông qua nhiều hệ thống vận Nuôi cấy tế bào chuyển(24,35). Sau khi glucuronin hoá bởi các men gan, bilirubin liên hợp được tiết vào mật. Sự gián Tế bào ung thư biểu mô cổ tử cung HeLa, đoạn trong vận chuyển gan mật sẽ dẫn đến triệu ung thư gan HepG2, ung thư biểu mô da A431, chứng vàng da trong nhiều bệnh lý của gan(35,7). ung thư vú MCF7, ung thư gan Alexander Mặc dù bilirubin trong mật bắt nguồn chủ yếu từ (PLC/PRF/5) và phôi thận HEK293T được nuôi hemoglobin của tế bào hồng cầu lão hoá qua con trong môi trường Eagle’s điều chỉnh theo đường chuyển hoá gan(7), sự sản xuất và vận Dulbecco (DMEM) bổ sung 7% FCS, penicillin chuyển bilirubin ở mô ngoại vi chưa được nhắc (100 đơn vị/ml) và streptomycin (100 ug/ml). Tế đến.Bên cạnh đó, CO có thể liên quan đến sự bảo bào ung thư ruột DLD-1 và ung thư máu K562 vệ tế bào khỏi những tổn thương oxy hoá thông được nuôi bằng RPMI1640 chứa 7% FCS và kháng sinh. HEK293T được chuyển pcDNA3- Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện An Bình năm 2016 43 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 5 * 2016 flag UnaG bằng Lipofectamine 2000 (Invitrogen) máy đọc quang 96 giếng. Thí nghiệm được tiến và ủ 16 giờ. Để tạo ra tế bào chuyển gen ổn định hành với 4-6 lần lặp. (18) HepG2 và HeLa, pcDNA3-flag UnaG (10ug) Thống kê được chuyển với calcium phosphate(31). G148 ở Các kết quả được thể hiện ở dạng trung nồng độ đích 300 ug/ml được cho vào môi bình±SD và phân tích bằng Student’s t-test trường nuôi để chọn lọc. Sau 5 ngày, những không ghép cặp. Các phân tích thống kê được dòng tế bào kháng G418 được chuyển nuôi vào ghi nhận khác biệt tại mức p<0.05 sử dụng phần đĩa 24 giếng với môi trường chứa G418 300 mềm Microsoft Excel 2010(25,31). ug/ml. Từng dòng được phân lập và đánh giá biểu hiện UnaG bằng kính hiển vi huỳnh quang. KẾT QUẢ 4 dòng biểu hiện UnaG được thu nhận, trộn lẫn Bilirubin được tổng hợp trong tế bào và để tránh biến thể dòng và duy trì với DMEM phóng thích ra môi trường chứa 7% FCS và kháng sinh. Với tế bào chứng, UnaG được phát hiện gắn vào bilirubin tự HepG2 được chuyển vector pcDNA3.1 và phân do và phát huỳnh quang(18). Nhằm đánh giá sự lập tế bào kháng G418. Haem trong tế bào được sản xuất bilirubin ở tế bào người, đầu tiên chúng đánh giá bằng chỉ thị màu sử dụng bộ khảo sát tôi đo nồng độ bilirubin trong tế bào được nuôi haem. cấy bằng UnaG tái tổ hợp. Do huyết thanh nhau Khảo sát huỳnh quang của bilirubin bê (FCS) có chứa bilirubin (7-10 pmol/ml), chúng Tế bào được nuôi với môi trường tổng hợp tôi sử dụng môi trường tổng hợp không không bilirubin VP-SFM chứa BSA 2 mg/ml. bilirubin VP-SFM thay cho DMEM có chứa FCS Biểu hiện của UnaG trong tế bào sống được để đánh giá lượng bilirubin. Nồng dộ bilirubin quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang. Tiếp trong môi trường nuôi tế bào HEK 293T, HeLa theo tế bào bị phá màng bằng siêu âm, lượng và HepG2 tăng tuyến tính đến 5 giờ. (Hình. 1a). bilirubin gắn vào UnaG được đánh giá bằng Bilirubin sản xuất bởi tế bào DLD-1, Alexander, huỳnh quang và đo với quang phổ kế, sử dụng A431 và MCF7 tương tự với HeLa. Một lượng bước sóng kích thích 480 nm và bước sóng phát nhỏ bilirubin được phóng thích theo thời gian từ xạ được dò trong khoảng 500 đến 550 nm(18). Để tế bào ung thư máu K562. Xử lý tế bào K562 với đo lượng bilirubin trong môi trường, môi trường haeminđưa đến sự gia tăng bilirubin được sản được ủ với UnaG tái tổ hợp mang his-tag (2ug) xuất. (Hình. 1b). Vết miễn dịch cho thấy một số trong 1 giờ ở 25oC. Sau đó UnaG sẽ bị bắt giữ bởi men, bao hồm HO-1, HO-2, biliverdin reductase hạt Ni2+. Sau khi rửa với TBS, UnaG được hoà A (BVRA) và B (BVRB), là những chất có liên với TBS chứa 300 uM imidazole và đo huỳnh quan đến sự tạo thành bilirubin từ haem, hiện quang. diện phổ biến trong những dòng tế bào này, Vết miễn dịch ngoại trừ HO-1 ở K562 (Hình. 1c). Những kết quả trên cho thấy tất cả các dòng tế bào được Dịch tế bào HEK293T được làm mẫu chạy khảo sát sản xuất bilirubin một cách liên tục. Khi SDS-PAGE và điện di trên màng poly(vinylidene tế bào HEK293T được xử lý với ALA, haemin difluoride) (PVDF)(25,31). hoặc biliverdin, bilirubin môi trường gia tăng rõ 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- rệt (Hình. 2a). Ngược lại, bilirubin không được diphenyltetrazolium bromide(MTT) assay. Tế tìm thấy trong môi trường nuôi tế bào được xử bào được xử lý với các chất tác động trong 24h lý với succinyl acetone (SA), chất ức chế đặc hiệu và trộn với MTT (500 ug/ml) trong 1 giờ. MTT của ALA dehydratase. Khi tế bào tiếp xúc với formazan tạo thành được hoà với isopropanol. protoporphrin thiếc (Sn-PP), chất ức chế HO, Đo hấp thu tại bước sóng 590 nm được đo với hoặc protoporphyrin N-methyl (N-MePP), chất 44 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện An Bình năm 2016 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 5 * 2016 Nghiên cứu Y học ức chế ferrochelatase, bilirubin môi trường giảm. cả với sự hiện diện của chất kích ứng (Hình. 4d). (Hình. 2b). Protoporphyrin kẽm (Zn-PP) triệt Những kết quả trên cho thấy sự chuyển hoá tiêu hoàn toàn sự tạo thành bilirubin. Chúng tôi hoặc giáng hoá của haem ở những protein chứa cũng khảo sát lượng haem nội bào ở tế bào HEK. haem không thể được đẩy nhanh trong điều Như trong hình 2c, haem tăng nhẹ bởi ALA hoặc kiện stress. sắt citrate trong khi giảm với SA. Tiếp theo, Vai trò bảo vệ tế bào của biliverdin và chúng tôi đánh giá sự tạo thành bilirubin với tế bilirubin trong phản ứng HO bào HepG2 và HeLa biểu hiển ổn định UnaG. Nhằm đánh giá vai trò sinh lý của sự sản Các tế bàonày phát huỳnh quang trong môi xuất liên tục haem và chuyển hoá nhanh thành trường không bilirubin (Hình. 2d). Độ mạnh bilirubin tiếp đó, tế bào được cho tiếp xúc với huỳnh quang trong tế bào và môi trường tăng những tác nhân gây tổn thương như menadion, khi xử lý với ALA, haemin và bilirubin (Hình. DEM(39,38). Phép đo MTT được thực hiện để 2e) trong khi SA làm giảm cường độ. Mức UnaG lượng giá tổn thương tế bào. Khi tế bào HEK trong tế bào HepG2 biểu hiện UnaG không đổi 293T được xử lý kết hợp với DEM và SA, tế bào trong các điều kiện trên (Hình. 2f). Tiếp đó chết tăng khi so sánh với nhóm chỉ với DEM chúng tôi so sánh sự tạo thành bilirubin trong (Hình. 5a). Việc ngăn chặn tổng hợp haem đưa môi trường khi có hoặc không có sự hiện hiện đến sự nhạy cảm với tổn thương oxy hoá. Thêm của SA. Thí nghiệm này giảm lượng bilirubin nội haemin 10 uM vào tế bào xử lý với DEM và SA bào trong môi trường, ngay cả khi có đưa dẫn tới sự hồi phục của tế bào. Nống độ cao hơn haemin hoặc bilirubin (Hình. 3a,b), cho thấy của haemin (20-50 uM) lại kích ứng độc tế bào. bilirubin được tổng hợpmới có khuynh hướng Tiếp đó, chúng tôi ủ tế bào xử lý DEM và SA với gắn với UnaG. sản phẩm phản ứng của HO. Sự chết tế bào giảm HO-1 cảm ứng bởi sodium arsenite, cadmium trong so sánh với nhóm được xử lý không có chloride và diethyl malate (DEM) không làm tăng sự biliverdin, trong khi hình thành bilirubin. Mặc dù sự cảm ứng HO-1 tricorbonyldichlororuthenium (II) dimer bởi các chất kích ứng haem làm tăng sắt nội (CORM2) hình thành từ CO không giảm thiểu (36,37) bào , chất kích ứng khác haem vẫn chưa được tổn thương tế bào. Bilirubin thêm vào ở nồng độ biết rõ có ảnh hưởng thế nào đến sự hình thành. thấp (0,1 uM) chống lại sự chết tế bào do cảm Khi cho HEK293T tiếp xúc với sodium arsenite, ứng DEM và SA. Tổn thương tế bào do cadmium chloride, và DEM, lượng HO-1 tăng menadione và SA cũng giảm nhờ biliverdin và (Hình. 4a). Việc xử lý tế bào HEK với những chất bilirubin nhung không do CORM. Xử lý tế bào tác động này làm giảm lẫn tăng nhẹ sự hình với DEM với sự hiện diện của Zn-PP làm tế bào thành bilirubin, cho thấy sự tạo thành bilirubin chết, và sự bổ sung haemin làm tăng nhẹ số không tăng rõ rệt điều kiện stress(Hình. 4b).Tế lượng tế bào sống. Sự tổn thương tế bào bởi bào HepG2 biểu hiện UnaG trong tất cả các thử DEM và Zn-PP không hồi phục bởi CORM2, ngiệm cũng không biểu hiện một sự thay đổi rõ nhưng sự hồi phục lại được ghi nhận với với ràng nào trong sự hình thành bilirubin nội và biliverdin. Những kết quả trên gợi ý rằng sự sản ngoại bào, ngoại trừ sự tăng nhẹ trong trường xuất biliverdin và bilirubin do phản ứng HO hợp cadmium. (Hình. 4c). Hơn nữa, xử lý tế bào trong tế bào có vai trò bảo vệ. HepG2 với SA làm giảm bilirubin môi trường kể Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện An Bình năm 2016 45 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 5 * 2016 Hình 1. Sự tạo thành và phóng thích bilirubin ở tế bào người. (a) Sự phóng thích bilirubin từ tế bào ra môi trường theo thời gian. (b) Sự tạo thành bilirubin ở tế bào K562. (c) Phân tích vết miễn dịch các protein liên quan đến sự tạo thành bilirubin. Hình 2.Những thay đổi trong sản xuất bilirubin và lượng haem nội bào khi xử lý với chất ức chế sinh tổng hợp haem, SA hoặc các tiền chất của bilirubin. (a) Bilirubin trong môi trường. (n=4 cho từng nhóm), *p<0,005, **p<0,01 so với nhóm chứng. (b) Hiệu ứng của các chất ức chế. (c) Thành phần haem. (n=4 cho từng nhóm), *p<0,01 (d) Hình ảnh hiển vi. Thanh chuẩn: 20uM. (e) Bilirubin nội và ngoại bào. (n=4 cho từng nhóm). *p<0,01, **p<0,05 so với nhóm chứng. (f) Phân tích vết miễn dịch của UnaG. 46 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện An Bình năm 2016 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 5 * 2016 Nghiên cứu Y học Hình 3. Hiệu ứng của SA, haemin, hoặc bilirubin trên sự sản xuất bilirubin ở tế bào HepG2 biểu hiện UnaG. (a) Hình ảnh hiển vi.(b) Lượng bilirubin nội và ngoại bào. (n=3 cho từng nhóm), *p<0.05 Hình 4. Sự tạo thành bilirubin ở tế bào HEK293T và HepG2 được xử lý arsenite, cadminium và DEM. (a) Phân tích vết miễn dịch (b) Bilirubin trong môi trường. (n=4 cho từng nhóm), *p<0,01. (c) Bilirunbin trong tế bào HepG2 biểu hiện UnaG và tiếp xúc với các chất gây stress. *p<0,01 (d) Bilirubin trong tế bào HepG2 xử lý với SA. (n=4 cho từng nhóm) Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện An Bình năm 2016 47 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 5 * 2016 Hình 5.Sự gia tăng các tổn thương oxy hóa bằng sự ức chế chuyển hóa haem và sự hòi phục nhờ biliverin và bilirubin (a) Sự gia tăng tổn thương tế bào với SA và sự hồi phục nhờ biliverdin và bilirubin. (n=6 cho từng nhóm). *p<0.01, **p<0.05 so với xử lý với DEM và SA. (b) Hiệu ứng của ZN-PP, biliversin và bilirubin đối với tổn thương oxy hóa. (n=5 cho từng nhóm). *p<0.01 BÀN LUẬN bằng huỳnh quang UnaG. Một nghiên cứu trước đây(20) sử dụng thí nghiệm đánh dấu xung với Trong nghiên cứu này, đầu tiên chúng tôi ALA hoặc sắt đồng vị phóng xạ, cho thấy có sự cho thấy nhiều dòng tế bào liên tục sản xuất và giáng hoá nhanh của haem mới tổng hợp trong giáng hoá haem. Bilirubin cuối cùng được tạo ra gan chuột và tế bào gan được phân tách. Từ và phóng thích từ tế bào vào môi trường. Để loại những phát hiện này, chúng tôi kết luận rằng tế bỏ các dòng bilirubin khác vào môi trường, bào động vật liên tục tổng hợp bilirubin từ bước chúng tôi sử dụng môi trường không bilirubin, khởi đầu là tổng hợp haem thông qua con và phát hiện ra tất cả các tế bào được khảo sát đường chuyển hoá haem. liên tục sản xuất bilirubin. Tất cả các tế bào Cho tế bào tiếp xúc với nhứng chất kích ứng nghiên cứu biểu hiện các men tham gia dị hoá stress khác haem, bao gồm asenite, cadminium haem (Hình 1c). Tế bào ung thư máu K563 chỉ và DEM, đưa đến sự cảm ứng HO-1, nhưng chỉ tạo ra khoảng 1/10 lượng bilirubin sản xuất bởi tế những thay đổi nhỏ trong sản xuất bilirubin bào HEK293T và HepG2. K563 không biểu hiện (Hình 4 b,c). Hơn nữa, thử nghiệm với SA dẫn HO-1, nhưng HO-2 giáng hoá haem tạo thành tới việc dừng hoàn toàn sự sản xuất bilirubin biliverdin, chất được biến đổi thành bilirubin bởi trong điều kiện tress bởi arsenite, cadminium và BVR. Vì vậy, ngay cả hồng cầu, những tế bào sử DEM. Quan sát này cho thấy rằng sự cảm ứng dụng haem với số lượng lớn để tổng hợp của HO-1 không phải luôn đi đôi với sự giáng hemoglobin, sản suất bilirubin qua con đường hoá của các cấu thành haem nhằm bảo vệ tế bào giáng hoá haem. Kumagai và cộng sự(18) đã báo khỏi các stress oxy hoá. Quan sát tương tự được cáo rằng bilirubin hiện diện rộng rãi trong não ghi nhận bởi Shetefel và cộng sự(33), cụ thể, chất của phôi chuột (E16.5) và tế bào HeLa xác định 48 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện An Bình năm 2016 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 5 * 2016 Nghiên cứu Y học cảm ứng khác haem là arsenite kích ứng sự biểu rằng tổng hợp haem là cần thiết cho sự bảo vệ hiện của HO-1 ở đại thực bào chuột RAW264.7 chống lại những tổn thương oxy hoá. Việc bổ nhưng không làm thay đổi sự chuyển hoá sắt sung 10uM haemin phần nào hồi phục tế bào, của tế bào. Những tác giả này cũng phát hiện cho thấy rằng dòng heam là cần thiết cho việc rằng tế bào biểu hiện ổn định HO-1 được bảo vệ bảo vệ chống lại tổn thương oxy hoá. Ngược lai, khỏi stress oxy hoá, nhưng sự tổng hợp ferritin haemin đưa từ ngoài vào với lượng dư lại gây ra không tăng. Một nghiên cứu in vivo(2) cho thấy sự tổn thương. Vì vậy, haem là một phân tử 2 mức bilirubin nước tiểu ở chuột được tiêm mặt; ở nồng độ sinh lý, nó thực hiện những vai arsenite từ vừa đến mạnh theo sau sự cảm ứng trò cần thiết, trong khi lượng dư thừa của hem của HO-1 gan. Bilirubin nước tiểu nhanh chóng dẫn đến stress oxy hoá hoặc tổn thương tế vào. trở về mức cơ bản, mặc dù HO-1 gan tiếp túc Với sự hiện diện của Zn-PP, một chất ức chế biểu hiện ở mức cao. Vì vậy, cảm ứng của HO-1 cạnh tranh của phản ứng HO, tế bào trở nên không liênquan đến sự giáng hoá của haem nhạy cảm với tổn thương, gợi ý rằng các sản trong điều kiên stress, nhưng những quá trình phẩm của phản ứng HO có thể là những chất khác có thể xảy ra để đáp ứng lại stress tế bào. bảo vệ chống lại sự phá huỷ. Trái lại, HO-1 tăng được cho rằng dẫn đến sự gia Cuối cùng, biliverdin và bilirubin, nhưng tăng giáng hoá của haem nội bào và thay đổi không phải CO, làm giảm nhẹ các tổn thương tế tình trạng sắt nội bào theo sau(17). Những sự kiện bào. Bilirubin ở nồng độ thấp (100 nM) có hiệu này có thể liên quan đến sự bảo vệ tế bào chống quả trong việc phòng ngừa phá huỷ tế bào lại stress oxy hoá. Thực tế, việc biểu hiện HO-1 nhưng không có tác dụng ở nồng độ cao hơn (1- được ghi nhận làm thay đổi sự phân phối sắt nội 10 uM). Trong môi trường nuôi cấy chứa 10% bào, đưa đến hiệu ứng bảo vệ tế bào chống lại FCS, nồng độ bilirubin tương đương 1nM, mức hydrogen peroxide(19). Trên cơ sở những quan sát không đủ phòng ngừa stress oxy hoá. Tuy nhiên, này, sự cảm ứng HO-1 không phải lúc nào cũng xem xét một nghiên cứu khác(28)cho thấy nồng đọ có sự tương quan với sự giáng hoá của haem và 1-20 uM bilirubin cảm ứng HO-1 thông qua hoạt chuyển hoá sắt. Tuy nhiên, sự điều hoà haem và hoá yếu tố phiên mã đáp ứng stress Nrf2, việc chuyển hoá sắt là chuyên biệt theo tế bào. Xem dùng bilirubin ở nồng độ cao hơn có thể gây xét sự biểu hiện ở khía cạnh xúc tác, HO-1 và stress tế bào. Dựa trên những phát hiện của HO-2 bất hoạt vẫn dẫn đến hiệu ứng bảo vệ tế chúng tôi, bilirubin trong tế bào được xử lý với bào chống lại stress oxy hoá(16,12), HO thuần có SA không hoàn toàn bổ sung bởi bilirubin từ thể bảo vệ tế bào hiệu quả; nói cách khác, chức ngoài, có khả năng bilirubin tạo mới(de novo) năng bảo vệ tế bào của HO có thể tách biệt với trong tế bào hiệu quả hơn trong việc phòng ngừa mức độ giáng hoá của haem bằng phản ứng HO. các tổn thương tế bào. Vì vậy, có thể sự chuyển Nhiều nghiên cứu(3,26,6) cho thấy hiệu ứng bảo hoá biliverdin thành bilirubin bởi BVR đóng vai vệ tế bào của phản ứng HO hoặc sản phẩm của trò quan trọng trong việc tự vệ tế bào. Về mặt nó CO, biliverdin và bilirubin. Chúng tôi tìm này, BVR điều hoà bởi biliverdin trở thành một thấy haem được tổng hợp liên tục, giáng hoá và yếu tố phiên mã là một chất đièu hoà quan trọng cuối cùng chuyển hoá thành bilirubin. Thêm vào trong các đáp ứng miễn dịch bẩm sinh đo sự tác đó, tế bào liên tục sản xuất CO, biliverdin và động hoặc chấn thương(22,40). bilirubin ở một mức cơ bản (Hình. 2,3). Vì vậy, Khoảng 80% bilirubin hình thành mỗi ngày để đánh giá đặc tính sinh lý của sự chuyển hoá bắt nguồn từ sự giáng hoá của haemoglobin liên tục heam, tế vào được cho tiếp xúc với trong hồng cầu(21). 20% còn lại từ sự tạo hồng cầu những tác nhân oxi hoá DEM và menadione. Sự không hiệu quả ở tuỷ xương và sự giáng hoá của tổn thương tế bào tăng với xử lý bằng SA, chỉ ra các protein hem khác. Các nghiên cứu trên Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện An Bình năm 2016 49 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 5 * 2016 chuyển hoá bilirubin chủ yếu được tiến hành với 3. Baranano DE and Snyder SH (2001). Neural roles for heme oxygenase: contrasts to nitric oxide synthase. Proc Natl Acad (35,7) gan người và động vật . Dữ liệu trong nghiên Sci U S A. 98(20): 10996-1002. cứu này cung cấp bằng chứng rằng bilirubin ở tế 4. Chiabrando D, et al. (2012). The mitochondrial heme exporter bào ngoại vi được sản xuất trực tiếp thông qua FLVCR1b mediates erythroid differentiation. J Clin Invest. 122(12): 4569-79. con đương haem và không phải luôn từ những 5. Crooks DR, et al. (2010). Posttranslational stability of the heme protein haem. Những nghiên cứu trước đó(32,11) biosynthetic enzyme ferrochelatase is dependent on iron cho thấy ALA đồng vị phóng xạ được tiêm vào availability and intact iron-sulfur cluster assembly machinery. Blood. 115(4): 860-9. chuột, bilirubin đồng vị xuất hiện trong mật 6. Dolinay T, Choi AM, and Ryter SW (2012). Heme Oxygenase- trong vòng 15 phút. Bilirubin này có thể bắt 1/CO as protective mediators in cigarette smoke- induced lung cell injury and chronic obstructive pulmonary disease. Curr nguồn từ sự chuyển hoá nhanh nguồn từ bào Pharm Biotechnol. 13(6): 769-76. tương tế bào gan giáng hoá mà không liên quan 7. Erlinger S, Arias IM, and Dhumeaux D (2014). Inherited đến các protein haem. Những kết quả hiện tại disorders of bilirubin transport and conjugation: new insights into molecular mechanisms and consequences. cho thấy haem mới tổng hợp liên tục được Gastroenterology. 146(7): 1625-38. chuyển hoá thành bilirubin. Bilirubin được xuất 8. Feng D and Lazar MA (2012). Clocks, metabolism, and the ra ngoại bào, gắn vào albumin, và được vận epigenome. Mol Cell. 47(2): 158-67. 9. Gentile S, Persico M, and Tiribelli C (1990). Abnormal hepatic chuyển đến gan thông qua hệ tuần hoàn. Về mặt uptake of low doses of sulfobromophthalein in Gilbert's này, bệnh nhân thiếu máu tán huyết chịu tình syndrome: the role of reduced affinity of the plasma membrane carrier of organic anions. Hepatology. 12(2): 213-7. trạng tăng bilirubin máu do sự gia tăng bilirubin 10. Gozzelino R, Jeney V, and Soares MP (2010). Mechanisms of tự do trong huyết thanh, có thể do sự sản xuất cell protection by heme oxygenase-1. Annu Rev Pharmacol quá mức bilirubin(24,7). Sự sụt giảm thanh thải Toxicol. 50: 323-54. 11. Grandchamp B, et al. (1981). Formation and disposition of bilirubin bởi tế bào gan có thể gây ra sự tích tụ newly synthesized heme in adult rat hepatocytes in primary bilirubin tự do, nhưng điều này rất hiếm(23,9). culture. J Biol Chem. 256(22): 11677-83. Những khiếm khuyết của các protein vận 12. Hori R, et al. (2002). Gene transfection of H25A mutant heme oxygenase-1 protects cells against hydroperoxide-induced chuyển bilirubin cần được làm rõ để giải thích cytotoxicity. J Biol Chem. 277(12): 10712-8. các bệnh nghiêm trọng. Gan bình thường biểu 13. Hull TD, Agarwal A, and George JF (2014). The mononuclear phagocyte system in homeostasis and disease: a role for heme hiện một số lượng lớn các protein vận chuyển, oxygenase-1. Antioxid Redox Signal. 20(11): 1770-88. bao gồm các ion dương hữu cơ, những chất có 14. Igarashi K and Watanabe-Matsui M (2014). Wearing red for thể loại bỏ một lượng lớn bilirubin trong hệ tuần signaling: the heme-bach axis in heme metabolism, oxidative stress response and iron immunology. Tohoku J Exp Med. hoàn và liên hợp với glucuronate. 232(4): 229-53. 15. Itoh R, et al. (2013). Imaging of heme/hemeproteins in nucleus KẾT LUẬN of the living cells expressing heme-binding nuclear receptors. Do tổn thương tế bào khi stress bị thúc đẩy FEBS Lett. 587(14): 2131-6. 16. Kim YS and Dore S (2005). Catalytically inactive heme bởi sự phong toả chuyển hoá haem nhưng lại oxygenase-2 mutant is cytoprotective. Free Radic Biol Med. được cải thiện bởi việc bổ sung biliverdin và 39(4): 558-64. bilirubin, có khả năng sự tổng hợp mới haem và 17. Kovtunovych G, et al. (2010). Dysfunction of the heme recycling system in heme oxygenase 1-deficient mice: effects chuyển hoá thành bilirubin theo sau đó đóng vai on macrophage viability and tissue iron distribution. Blood. trò không thể thiếu trong bảo vệ tế bào khỏi sự 116(26): 6054-62. 18. Kumagai A, et al. (2013). A bilirubin-inducible fluorescent tổn thương. protein from eel muscle. Cell. 153(7): 1602-11. TÀI LIỆU THAM KHẢO 19. Lanceta L, et al. (2013). Haem oxygenase-1 overexpression alters intracellular iron distribution. Biochem J. 449(1): 189-94. 1. Alam J, et al. (2004). Regulation of heme oxygenase-1 gene 20. Lodola A and Jones OT (1978). Evidence for a rapidly turned transcription: recent advances and highlights from the over pool of haem in isolated hepatocytes. FEBS Lett. 90(2): International Conference (Uppsala, 2003) on Heme 250-4. Oxygenase. Antioxid Redox Signal. 6(5): 924-33. 21. London IM, et al. (1950). On the origin of bile pigment in 2. Arthur DM, et al. (2012). Urinary excretion of bilirubin normal man. J Biol Chem. 184(1): 351-8. oxidative metabolites in arsenite-treated mice. J Toxicol Sci. 37(3): 655-61. 50 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện An Bình năm 2016 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 5 * 2016 Nghiên cứu Y học 22. Maines MD (2007). Biliverdin reductase: PKC interaction at 33. Sheftel AD, Kim SF and Ponka P (2007). Non-heme induction the cross-talk of MAPK and PI3K signaling pathways. of heme oxygenase-1 does not alter cellular iron metabolism. J Antioxid Redox Signal. 9(12): 2187-95. Biol Chem. 282(14): 10480-6. 23. Martin JF, et al. (1976). Abnormal hepatic transport of 34. Simon T, Anegon I and Blancou P (2011). Heme oxygenase indocyanine green in Gilbert's syndrome. Gastroenterology. and carbon monoxide as an immunotherapeutic approach in 70(3): 385-91. transplantation and cancer. Immunotherapy. 3(4 Suppl): 15-8. 24. McDonagh AF, Palma LA, and Lightner DA (1980). Blue light 35. Sticova E and Jirsa M (2013). New insights in bilirubin and bilirubin excretion. Science. 208(4440): 145-51. metabolism and their clinical implications. World J 25. Ohgari Y et al. (2011). Roles of porphyrin and iron Gastroenterol. 19(38): 6398-407. metabolisms in the delta-aminolevulinic acid (ALA)-induced 36. Taketani S (2005). Aquisition, mobilization and utilization of accumulation of protoporphyrin and photodamage of tumor cellular iron and heme: endless findings and growing cells. Photochem Photobiol. 87(5): 1138-45. evidence of tight regulation. Tohoku J Exp Med. 205(4): 297- 26. Origassa CS and Camara NO (2013). Cytoprotective role of 318. heme oxygenase-1 and heme degradation derived end 37. Taketani S et al. (1989). The human 32-kDa stress protein products in liver injury. World J Hepatol. 5(10): 541-9. induced by exposure to arsenite and cadmium ions is heme 27. Paul S et al. (1997). ATP-dependent uptake of natural product oxygenase. FEBS Lett. 245(1-2): 173-6. cytotoxic drugs by membrane vesicles establishes MRP as a 38. Taketani S et al. (1990). Induction in mouse peritoneal broad specificity transporter. Proc Natl Acad Sci U S A. 94(26): macrophages of 34 kDa stress protein and heme oxygenase by 14976. sulfhydryl-reactive agents. J Biochem. 108(1): 28-32. 28. Qaisiya M, et al. (2014). Bilirubin mediated oxidative stress 39. Wang X et al. (2008). Cytoprotection of human endothelial involves antioxidant response activation via Nrf2 pathway. cells from menadione cytotoxicity by caffeic acid phenethyl Cell Signal. 26(3): 512-20. ester: the role of heme oxygenase-1. Eur J Pharmacol. 591(1-3): 29. Sakaino M et al. (2009). Dual mitochondrial localization and 28-35. different roles of the reversible reaction of mammalian 40. Wegiel B et al. (2011). Biliverdin inhibits Toll-like receptor-4 ferrochelatase. FEBS J. 276(19): 5559-70. (TLR4) expression through nitric oxide-dependent nuclear 30. Sassa S (1990). Regulation of the genes for heme pathway translocation of biliverdin reductase. Proc Natl Acad Sci U S A. enzymes in erythroid and in non-erythroid cells. Int J Cell 108(46): 18849-54. Cloning. 8(1): 10-26. 31. Sawamoto M et al. (2013). The p53-dependent expression of frataxin controls 5-aminolevulinic acid-induced accumulation Ngày nhận bài báo: 03/08/2016 of protoporphyrin IX and photo-damage in cancerous cells. Ngày phản biện nhận xét bài báo: 10/08/2016 Photochem Photobiol. 89(1): 163-72. 32. Schwartz S et al. (1971). Erythropoietic defects in Ngày bài báo được đăng: 05/10/2016 protoporphyria: a study of factors involved in labelling of porphyrins and bile pigments from ALA- 3 H and glycine- 14 C. J Lab Clin Med. 78(3): 411-34. Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện An Bình năm 2016 51