Phát triển phương pháp phát hiện ricin trong mẫu nước sử dụng aptamer kết hợp với Real-Time PCR

Nghiên cứu khoa học công nghệ Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số 59, 02 - 2019 151 PHÁT TRIỂN PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN RICIN TRONG MẪU NƯỚC SỬ DỤNG APTAMER KẾT HỢP VỚI REAL-TIME PCR Ngô Ngọc Trung1*, Nguyễn Thị Thu Thủy2, Lã Thị Huyền2, Lê Quang Huấn2 Tóm tắt: Ricin là một loại lecin thực vật, được tìm thấy nhiều trong hạt Thầu Dầu. Ricin gây độc cho tế bào động vật bằng cách thay thế một base adenine đơn trên cấu trúc vòng sarcin-ricin (SRL), từ đó làm thay đổi cấu trúc của tiểu đơn vị lớn rARN 28S, gây ức chế quá trình tổng hợp protein trong tế bào. Do vậy, ricin được xếp vào nhóm vũ khí sinh học nguy hiểm được sử dụng trong chiến tranh hoặc khủng bố. Phương pháp real time PCR là một trong những phương pháp phát hiện và định lượng ADN hiện đại nhất hiện nay. Các nghiên cứu sử dụng phương pháp real time PCR để phát hiện ricin trong mẫu lương thực, thực phẩm thông qua phát hiện ADN của đoạn gen mã hóa cho độc tố ricin. Tuy nhiên, chưa có nhiều công trình công bố về sử dụng phương pháp real time PCR để phát hiện trực tiếp ricin trong mẫu môi trường. Bài báo này trình bày các nghiên cứu phát triển phương pháp phát hiện ricin sử dụng kỹ thuật real-time PCR dựa trên aptamer Ar 5.9 đặc hiệu ricin. Kết quả nghiên cứu cho thấy phương pháp này có thể phát hiện ricin trong môi trường nước với ngưỡng phát hiện (LOD) là 0,36 ng, giới hạn định lượng (LOQ) là 1,32 ng/ml, độ nhạy với nước ngầm và nước mặt đạt 98%, nước sinh hoạt đạt 99%, độ đặc hiệu đạt 98%. Từ khóa: Ricin; Real-time PCR phát hiện Ricin; Aptamer đặc hiệu Ricin. 1. MỞ ĐẦU Ricin từ hạt thầu dầu là một loại glycoprotein thuộc nhóm lectin, có khối lượng phân tử khoảng 65 kDa. Phân tử gồm 02 chuỗi polypetid (chuỗi A và B) nối với nhau qua cầu nối disunfua (-S-). Sau khi xâm nhập vào tế bào, ricin được vận chuyển đến bộ máy Golgi và tại đây, chuỗi A sẽ tách khỏi phân tử ricin, đi vào nhân và đến ribosom. Chuỗi A làm thay đổi cấu trúc của tiểu đơn vị lớn rARN 28S bằng cách thay thế một base adenine đơn (A4324) trên cấu trúc vòng sarcin-ricin (SRL) [10], từ đó gây bất hoạt tiểu đơn vị này và gây ra ức chế quá trình tổng hợp protein trong nhân tế bào dẫn đến gây chết tế bào. Bên cạnh đó, ricin tinh sạch có các tính chất như không mùi, không vị, dễ tan trong nước và có thể tồn tại trong môi trường trong một thời gian dài. Các nghiên cứu còn cho thấy giá trị LD50 của ricin đối với động vật như Thỏ, Chuột nhắt trắng trong khoảng từ 1-5µg/kg [6]. Do vậy, ricin được liệt vào danh sách các chất cực độc dùng trong chiến tranh sử dụng vũ khí hủy diệt lớn hoặc khủng bố quy mô vừa và nhỏ [11]. Bởi vậy, phát triển các phương pháp phát hiện độc tố ricin là rất cần thiết, đảm bảo an toàn sinh học trong cộng đồng cũng như sử dụng trong huấn luyện sẵn sàng chiến đấu trong quân đội. Real-time PCR là một kỹ thuật được sử dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau, trong đó có ứng dụng phát hiện các vi sinh vật và độc tố gây bệnh cho người cũng như phát hiện các độc tố trong môi trường. Để phát hiện ricin, Xiahua He và cộng sự đã phát triển phương pháp ImmunoPCR (IPCR) sử dụng kháng thể đơn dòng kháng chuỗi A kết hợp với một đoạn ADN đã được biotin hóa. Sau khi gắn với ricin, đoạn ADN sẽ được tách ra và phát hiện bằng real-time PCR. Phương pháp này là sự kết hợp giữa ELISA và real-time PCR nên có độ nhạy cực cao với ngưỡng phát hiện là 10 pg ricin [6]. Tiếp theo, ông cũng phát triển phương pháp phát hiện ricin trong các mẫu thực phẩm như thịt bò, sữa, trứng với ngưỡng phát hiện đến 10 pg/ml [7]. Xiahua He cũng phát triển phương pháp real-time PCR để phát hiện trực tiếp genome của hạt thầu dầu trong thực phẩm với ngưỡng phát hiện là 0,5 µg ricin/1g mẫu [8]. Trong một nghiên cứu khác, Eva Felder và cộng sự đã phát Hóa học & Kỹ thuật môi trường N. N. Trung, , L. Q. Huấn, “Phát triển phương pháp phát hiện với real-time PCR.” 152 hiện ricin trực tiếp trong hỗn hợp bột của hạt cây Thầu Dầu bằng phương pháp real-time PCR với độ nhạy là 3 copy tương đương với 3 tế bào/phản ứng [9]. Aptamer là các sợi đơn ADN hoặc ARN có cấu trúc đặc biệt và có khả năng gắn kết đặc hiệu với các phân tử đích khác nhau. Aptamer Ar5.9 là một đoạn ADN sợi đơn đặc hiệu ricin được sàng lọc dựa trên quy trình SELEX cải tiến sử dụng cột sàng lọc Nanosep 3K Omega [5]. Tính đặc hiệu cao của Ar5.9 với ricin là cơ sở để sử dụng phương pháp real-time PCR phát hiện ricin trong mẫu môi trường với sơ đồ sau: Hình 1. Sơ đồ phát hiện ricin dựa trên phương pháp Real-time PCR sử dụng aptamer Ar5.9. Các mẫu môi trường nước (nước mặt, nước ngầm, nước sinh hoạt) sau khi lấy về phòng thí nghiệm được xử lý mẫu và gắn kết protein trong mẫu lên đĩa 96 giếng. Ricin có bản chất là protein nên cũng được gắn lên đĩa một cách dễ dàng. Tiếp theo là quá trình rửa trôi các thành phần không gắn kết bằng đệm chuyên dụng, blocking đĩa để tránh các thành phần khác gắn lên. Aptamer Ar5.9 sau đó được thêm vào để gắn kết đặc hiệu với ricin trong giếng. Tiếp theo là quá trình rửa trôi các aptamer thừa, không gắn kết với các phân tử ricin. Hỗn hợp aptamer - ricin được biến tính nhiệt để loại bỏ gắn kết giữa ricin và aptamer Ar5.9, sau đó sử dụng phản ứng real-time PCR để phát hiện các aptamer Ar5.9 đã gắn kết với ricin. Từ đường chuẩn giữa aptamer Ar5.9 và ricin đã biết, có thể phát hiện ricin trong mẫu môi trường dựa vào phản ứng real-time PCR. Phương pháp này có thể phát hiện và định lượng ricin chính xác với thời gian thực hiện nhanh, thao tác dễ dàng với độ nhạy, độ đặc hiệu cao. 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu và hóa chất 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu Ricin tinh sạch, aptamer Ar5.9 được cung cấp bởi Viện Hóa học Môi trường quân sự. Trình tự của Aptamer Ar5.9: 5’ - ATCCGTCACACCTGCTCTCATATG - TCGCCATGGTAAGATGTCTCGCTCTCGTTCGTGTCTTTAG - AGCTTTGGTGTTGTTGGCTCCCGTT- 3’ 2.1.2. Các hóa chất chính sử dụng trong nghiên cứu Các loại hóa chất cơ bản dùng trong nghiên cứu: TBPS, PBS, agarose, SDS (Pro-lab), nước khử ion 2 lần, nước đã xử lý ARN và ADN, methanol, tween 20%, skim milk, MgCl2 (Merk), Master Mix (Fisher scientific), dung dịch gốc của dNTPs ( Hybaid, Germany), Primer F, Primer R (Invitrogen) và một số hóa chất phân tích tinh khiết khác. Cặp mồi chạy phản ứng real-time PCR: ApF2: 5’ – ATCCGTCACACCTGCTCTCATA - 3’ Nghiên cứu khoa học công nghệ Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số 59, 02 - 2019 153 ApR2: 5’- ATACGGGAGCCAACACCAAAGC - 3’ 2.2. Thiết bị nghiên cứu Máy li tâm (Eppendorf, Đức), tủ cấy vô trùng (Sanyo, Nhật), tủ hút, máy đo pH (Metter, Thuỵ Sĩ), máy vortex (Rotolab OSI), máy Real-time PCR (Aligent,Mỹ), máy đo nanodrop, tủ lạnh sâu (Sanyo, Nhật), cân phân tích 10-4 g (Mettler Toledo), pipetman các loại (Gilson) và một số thiết bị nghiên cứu khác. 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Xây dựng đường chuẩn giữa ricin với aptamer Ar5.9 và thử nghiệm với các mẫu nước [4] Từ dung dịch ricin gốc ban đầu có nồng độ 0,45 mg/ml, tiến hành pha loãng xuống 0,1 mg/ml bằng nước cất 2 lần rồi tiếp tục pha loãng mỗi bậc 10 lần (09 phần nước cất: 01 phần ricin) để đạt các nồng độ 0,1; 1,0; 10; 100; 1.000; 10.000 và 100.000 ng/ml. 100 μl ricin với các nồng độ 0,1; 1,0; 10; 100; 1.000; 10.000 và 100.000 ng/ml được hòa trong đệm gắn bản (coating buffer, 50 mM bicarbonate buffer, pH 9,6), ủ trong các giếng của khay polystiren 16 giờ. Để loại bỏ ricin dư thừa, các giếng được rửa 03 lần với 300 μl đệm rửa TPBS (PBS + 0,05% tween-20). Đĩa sau đó được phủ với skim milk 5% pha trong PBS và ủ 60 phút ở nhiệt độ phòng, rửa bằng đệm PBS 1X 03 lần. 50µl aptamer Ar5.9 được thêm vào các giếng và ủ lắc ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ. Sau đó các giếng được rửa với TPBS 1X ba lần, sau đó rửa tiếp với PBS ba lần. 100 μl PBS được thêm vào sau khi rửa. Sốc nhiệt ở 95oC trong 5 phút để phá vỡ liên kết Ar5.9 - ricin. Dịch thu được được đưa vào phản ứng real-time PCR để xác định mối tương quan giữa ricin và aptamer Ar5.9. Để xác định ricin trong các mẫu nước, sau khi được pha vào đệm gắn bản với tỷ lệ 1:9 sẽ được thực hiện tương tự như các bước trong xây dựng đường chuẩn. Kết quả thu được từ phản ứng real-time PCR sẽ được so sánh với đường chuẩn thu được giữa aptamer Ar5.9 và ricin để xác định ngưỡng phát hiện, độ nhạy, độ đặc hiệu của phản ứng. 2.3.2. Phương pháp real-time PCR để phát hiện aptamer Ar5.9 [7] Các thành phần của phản ứng real-time PCR được trình bày trong bảng dưới đây: Bảng 1. Thành phần các chất trong phản ứng real-time PCR. Thành phần Thể tích (µl) Master Mix 2x 10 Primer AptF 10 µM 0,8 Primer AptR 10 µM 0,8 ADN khuôn 3,0 H2O 5,4 Tổng 20 Chu kỳ nhiệt của phản ứng real-time PCR: bước 1: biến tính 95oC trong 3 phút; bước 2: chu trình lặp lại 40 chu kỳ (95oC trong 05 giây, 40oC trong 10 giây; bước 3: Phân tích điểm nóng chảy (Melting Curves): 95oC trong 30 giây, 65 oC trong 30 giây và 95oC trong 30 giây. 2.3.3. Phương pháp xác định độ nhạy, độ đặc hiệu [1] Tiến hành thử nghiệm trên các loại mẫu nước khác nhau tại nồng độ nhỏ nhất mà phương pháp có thể phát hiện được (dựa vào kết quả xác định giới hạn định lượng của phương pháp). Mỗi loại nước (nước mặt, nước ngầm, nước sinh hoạt và đối chứng) được thử nghiệm với 100 mẫu. Độ nhạy và độ đặc hiệu của phép thử được xác định theo công thức: Hóa học & Kỹ thuật môi trường N. N. Trung, , L. Q. Huấn, “Phát triển phương pháp phát hiện với real-time PCR.” 154 2.3.4 Phương pháp xác định ngưỡng phát hiện (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ mà tại đó giá trị xác định được lớn hơn độ không đảm bảo đo của phương pháp. Đây là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu có thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng được. Có nhiều cách xác định LOD khác nhau tùy thuộc vào phương pháp áp dụng là phương pháp công cụ hay không công cụ. Một trong các cách tiếp cận có thể chấp nhận được là cách tính dựa trên độ lệch chuẩn thực hiện trên mẫu trắng. Phân tích mẫu trắng 10 lần song song, tính độ lệch chuẩn (độ lệch chuẩn của các phép thử phải khác 0), LOD được tính theo công thức [4]: Công thức tính LOD: LOD = 00 SD3x   Với SD0 = 1n )xx( 2 0i0   Trong đó:  0x = trung bình của mẫu trắng SD0 = độ lệch chuẩn của mẫu trắng Giới hạn định lượng (LOQ) là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà ta có thể định lượng bằng phương pháp khảo sát và cho kết quả có độ chụm mong muốn. Có nhiều cách khác nhau để xác định LOQ, phụ thuộc vào từng phương pháp cụ thể mà lựa chọn cho phù hợp. Một trong các cách thường được sử dụng để tính LOQ là dựa trên độ lệch chuẩn, tính trên mẫu trắng với công thức: LOQ = 00 SD10x   [4]. 2.3.5 Phương pháp lấy mẫu nước Các mẫu nước mặt, nước ngầm, nước sinh hoạt được lấy theo các tiêu chuẩn Việt Nam hiện hành [2]. 2.3.6. Phương pháp sắc ký miễn dịch phát hiện ricin Sử dụng test phát hiện nhanh độc tố ricin theo nguyên lý sắc ký miễn dịch, để so sánh định tính với quá trình phân tích, phát hiện ricin theo phương pháp real-time PCR. Test phát hiện nhanh ricin bằng nguyên lý sắc ký miễn dịch được cung cấp bởi Viện Hóa học Môi trường Quân sự và hãng Osborn (Mỹ) [1]. 2.3.7. Phương pháp thống kê sinh học trong xử lý kết quả thí nghiệm Tất cả các kết quả nghiên cứu được thực hiện lặp lại 03 lần, lấy giá trị trung bình và xử lý số liệu theo phương pháp thống kê sinh học sử dụng hàm chuẩn với độ tin cậy 95%, sai số cho phép  = 5% [3]. 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Kết quả phản ứng real-time PCR với aptamer Ar5.9 Aptamer Ar5.9 được pha loãng với các nồng độ từ 90 nM giảm dần 10 lần đến 0,009 nM và thực hiện phản ứng real - time PCR với cặp mồi AptF/R. Đây là bước thử nghiệm Nghiên cứu khoa học công nghệ Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số 59, 02 - 2019 155 khả năng liên kết giữa aptamer Ar5.9 với cặp mồi đặc hiệu nhằm thu nhận tín hiệu khuếch đại aptamer Ar5.9 trong phản ứng real-time PCR. Kết quả thu được như sau: Hình 2. Kết quả chạy Real-time PCR với Aptamer Ar5.9 (hình 2A) và xác định điểm nóng chảy (Tm) trong phản ứng Real-time sử dụng SYBR-Green I (Hình 2B). Hình 3. Kết quả điện di sản phẩm sau khi chạy real-time PCR Ar5.9. Đường chạy M: Marker Đường chạy: 1, 2, 3, 4, 5: các sản phẩm của Ar5.9 sau khi chạy real-time PCR với các nồng độ từ 0,009; 0,09; 0,9; 9,0 và 90 nM Kết quả cho thấy giá trị Ct thu được giảm dần theo từng nồng độ aptamer Ar5.9 tăng dần. Kết quả tính hệ số tương quan cho thấy giá trị R2 = 0,991 kết hợp với phân tích nhiệt độ nóng chảy (Tm) cho thấy sản phẩm real-time PCR của 05 nồng độ aptamer Ar5.9 có đỉnh Tm khoảng 810C. Bên cạnh đó, mẫu trắng có giá trị Ct đạt 35,5. Điều này là do các cặp mồi đã bắt cặp với nhau trong phản ứng real-time PCR với đỉnh Tm khoảng 770C (thể hiện trong hình 2B). Kết quả điện di các sản phẩm sau khi chạy real-time PCR cho thấy chỉ có 01 băng duy nhất với kích thước khoảng 80 bp, chứng tỏ không có sản phẩm phụ là các cặp mồi tự bắt cặp với nhau trong phản ứng real-time PCR có aptamer Ar5.9. Điều này chứng tỏ aptamer Ar5.9 đủ điều kiện sử dụng trong phản ứng Real-time PCR để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo. 3.2. Kết quả phát hiện ricin trong môi trường đệm gắn bản (coating buffer) Thí nghiệm được tiến hành với các nồng độ ricin khác nhau pha trong đệm coating buffer. Khảo sát mối tương quan giữa 07 nồng độ ricin với aptamer Ar5.9 có nồng độ 90 nM, kết quả thu được như sau: Hóa học & Kỹ thuật môi trường N. N. Trung, , L. Q. Huấn, “Phát triển phương pháp phát hiện với real-time PCR.” 156 Bảng 2. Kết quả phát hiện ricin trong đệm gắn bản sử dụng aptamer Ar5.9. Hình 4. Kết quả kiểm tra bằng sắc ký miễn dịch với các nồngđộ ricin 1: 10.000 ng; 2: 1.000 ng; 3: 500 ng; 4: 50 ng; 5: 10 ng. Kết quả cho thấy không có sự tuyến tính về giá trị Ct tại các nồng độ ricin 10.000; 100.000 ng/ml. Khoảng tuyến tính bắt đầu từ nồng độ ricin 0,1 ng đến 1000 ng, giá trị Ct giảm khoảng 3-4 đơn vị sau mỗi độ pha loãng 10 lần. Từ các kết quả thu được, xây dựng đường chuẩn xác định mối tương quan giữa aptamer Ar5.9 và ricin trong đệm gắn bản, trong khoảng tuyến tính 0,1 - 1000 ng như sau: Hình 5. Đường chuẩn biểu diễn mối tương quan giữa ricin và aptamer Ar5.9 qua phản ứng real-time PCR trong đệm gắn bản 50 mM. Âm tính V¹ch ®äc kÕt qu¶ Dương tính V¹ch kiÓm tra 1 2 3 4 5 Tt Nồng độ ricin (ng) Giá trị Ct (Trung bình) 1 0 35,5 ± 0,05 2 0,1 35,2 ± 0,07 3 1,0 32,5 ± 0,08 4 10 27,6 ± 0,05 5 100 24,5 ± 0,09 6 1.000 21,7 ± 0,09 7 10.000 20,6 ± 0,12 8 100.000 18,4 ± 0,07 Nghiên cứu khoa học công nghệ Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số 59, 02 - 2019 157 Từ các kết quả thu được, có thể khảng định đã xây dựng thành công đường chuẩn xác định định lượng ricin trong nước bằng kỹ thuật real-time PCR kết hợp aptamer Ar5.9 với phương trình đường chuẩn: y = 31,79-3,53*log(x), với R2 = 0,992 trong khoảng xác định từ 0,1 đến 1000 ng/ml. 3.3. Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp phát hiện ricin sử dụng real-time PCR kết hợp aptamer Ar5.9 Để xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp real-time PCR kết hợp aptamer Ar5.9 phát hiện ricin, chúng tôi lựa chọn phương pháp đánh giá trên 10 mẫu âm tính (mẫu nước cất 2 lần, chạy phản ứng real-time PCR sử dụng aptamer Ar5.9) với phương trình y = 31,79-3,53*log(x), với công thức tính LOD = xtb+ 3SD, LOQ = xtb+ 10SD, kết quả thể hiện trên bảng sau: Bảng 3. Kết quả real-time PCR trên 10 mẫu trắng. Stt Ct Log(x) = (Ct-31,79)/ (-3,53) Ricin (nanogam) (X0i-Xtb) 2 1 35,55 -1,065155807 0,086068 0,000122739 2 35,53 -1,059490085 0,087199 0,007603612 3 35,50 -1,050991501 0,088922 0,007907096 4 35,52 -1,056657224 0,087769 0,007703455 5 35,54 -1,062322946 0,086632 0,007505059 6 35,55 -1,065155807 0,086068 0,007407785 7 35,51 -1,053824363 0,088344 0,007804611 8 35,5 -1,050991501 0,088922 0,007907096 9 35,54 -1,062322946 0,086632 0,007505059 10 35,52 -1,056657224 0,087769 0,007703455 TB Xtb 0.09714 LOQ = 1,32 LOD = 0,36 SD = 0,0876 Từ kết quả thu được trên bảng 3.29, tiến hành tính toán giá trị SD và xtb bằng phương pháp bình phương tối thiểu, thu được giá trị Xtb = 0,086; SD = 0,0198, từ đó tính được LOD = xtb+ 3SD = 0,36 ng/ml; LOQ = xtb+ 10SD = 1,32 ng/ml. 3.4. Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của phương pháp phát hiện ricin sử dụng aptamer Ar5.9 và real-time PCR Ricin được pha loãng từ nồng độ ban đầu là 0,45 mg/ml về nồng độ 1,32 ng/ml và thử nghiệm với kỹ thuật real-time PCR sử dụng aptamer Ar5.9. Mẫu âm tính cũng được thử nghiệm lặp lại nhiều lần và ghi nhận kết quả. Kết quả thí nghiệm được trình bày dưới bảng sau: Bảng 4. Kết quả xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của phương pháp real-time PCR sử dụng aptamer Ar5.9 phát hiện ricin. Loại mẫu Số lượng mẫu Kết quả Real-time PCR (Ct) Dương tính thật Dương tính giả Âm tính thật Âm tính giả Nước sinh hoạt 100 31,36±0,07 99 0 0 1 Nước mặt 100 31,36 ± 0,05 98 0 0 2 Nước ngầm 100 31,36± 0,04 98 0 0 2 Mẫu đối chứng 100 35,5± 0,05 0 2 98 0 Hóa học & Kỹ thuật môi trường N. N. Trung, , L. Q. Huấn, “Phát triển phương pháp phát hiện với real-time PCR.” 158 Kết quả phân tích cho thấy giá trị Ct thu được với các mẫu có độ ổn định cao. Tuy nhiên, vẫn có các giá trị dương tính giả và âm tính giả trong các mẫu phân tích. Các số liệu thu được cũng không chênh lệch nhiều so với giá trị theo đường chuẩn lý thuyết. Áp dụng công thức tính độ nhạy và độ đặc hiệu, ta tính được: Kết quả thí nghiệm cho thấy độ nhạy với nước mặt và nước ngầm đạt 98%, nước sinh hoạt đạt 99% và độ đặc hiệu đạt 98%, điều này hoàn toàn phù hợp với các nghiên cứu trước đây về real-time PCR vì phương pháp này có độ nhạy và đặc hiệu rất cao. Kết quả này tương đương với phương pháp sắc ký miễn dịch khi xác định ricin trong nước [1]. Tuy nhiên, độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp vẫn thấp hơn so với một số nghiên cứu về real-time PCR phát hiện ricin. Điển hình là nghiên cứu của Xiaohua He và cộng sự đã phát hiện gen mã hóa cho ricin từ cây Thầu Dầu bằng phương pháp real-time PCR với ngưỡng phát hiện 1 bản ADN và độ nhạy đạt 100% [8]. Khả năng phản ứng chéo được xác định bằng cách thử nghiệm với một số mẫu protein tương tự ricin gồm lectin tinh sạch từ đậu tương (LĐT), nấm hương (LNH), nấm mỡ (LNM) và mẫu đối chứng. Kết quả được trình bày trong bảng sau: Bảng 5. Kết quả Ct (trung bình) xác định khả năng phản ứng chéo với một số loại lectin tương tự. Mẫu Ricin (1,32 ng) LĐT (10 ng) LNH (10 ng) LNM (10 ng) Đối chứng Kết quả 31,36± 0,05 35,7± 0,08 35,6 ± 0,07 35,2 ± 0,06 35,5 ± 0,03 Kết quả phân tích cho thấy giá trị Ct của các loại lectin tương tự ricin tương đương với mẫu trắng. Điều này chứng tỏ aptamer Ar5.9 không liên kết chéo với một số loại mẫu protein có cấu trúc gần giống ricin. Điều này được giải thích do aptamer Ar5.9 chỉ liên kết đặc hiệu với ricin chứ không liên kết với bất kỳ loại protein nào khác. Do đó, mặc dù có rất nhiều loại protein khác nhau nhưng cũng không xảy ra phản ứng chéo nào. 3.5. Phát hiện ricin bằng phương pháp real - time PCR kết hợp Ar5.9 trong các mẫu nước Thí nghiệm được tiến hành với các mẫu nước sinh hoạt, nước ngầm qua xử lý được lấy tại Viện Hóa học Môi trường quân sự, nước mặt được lấy tại hạ lưu sông Đà (hạ lưu khu vực thủy điện Hòa Bình, là nguồn nước trước khi xử lý để trở thành nước sinh hoạt). Các mẫu nước được lấy mẫu, phân tích xác định các chỉ số hóa sinh theo các tiêu chuẩn Việt Nam (các kim loại nặng, chất tẩy rửa, E.coli, Coliform, các mẫu đạt tiêu chuẩn về nước sinh hoạt, nước mặt, nước ngầm theo các quy chuẩn Việt Nam, đảm bảo không có các yếu tố tác động đến cấu trúc không gian của ricin (số liệu không hiển thị trong bài báo). Để đảm bảo độ ổn định, các mẫu nước được đưa vào môi trường đệm gắn bản với tỷ lệ 1:9. Các mẫu nước sau quá trình xử lý mẫu được bổ xung ricin sao cho đạt nồng độ cuối cùng trong khoảng từ 1,32 ng đến 1.000 ng. Thực hiện quá trình gắn kết ricin vào khay polystyren, ủ với aptamer Ar5.9 và thực hiện phản ứng real-time PCR để phát hiện aptamer gắn kết với ricin. So sánh giá trị Ct theo đường chuẩn (Ct LT) và giá trị Ct thực tế thu được (Ct TĐ), kết quả được trình bày trong bảng 6: Nghiên cứu khoa học công nghệ Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số 59, 02 - 2019 159 Bảng 6. Kết quả chạy real-time PCR với các mẫu nghiên cứu. Tt Ricin (ng) Giá trị Ct (Trung bình, SD) Ct LT (Ct TĐ) Nước sinh hoạt Nước mặt Nước ngầm 1 1,28 31,36 31,35± 0,05 31,29± 0,03 31,32± 0,05 2 10 28,26 28,25 ± 0,06 28,23 ± 0,04 28,24 ± 0,07 3 60 25,51 25,5 ± 0,05 25,51 ± 0,05 25,45 ± 0,04 4 100 24,73 24,72 ± 0,06 24,7 ± 0,05 24,6 ± 0,06 5 500 22,26 22,3 ±0,05 22,3 ± 0,06 22,3 ± 0,04 6 1000 21,2 21,3 ± 0,05 21,3 ± 0,06 21,3 ± 0,05 Kết quả thử nghiệm cho thấy giá trị Ct thu được qua phản ứng real-time PCR với 03 loại mẫu nước đều tuyến tính với nồng độ ricin trong khoảng từ 1,32 - 1000 ng, không có sai khác nhiều và đều nằm trong khoảng tuyến tính đã thiết lập. Điều này chứng minh khả năng liên kết tốt với aptamer Ar5.9 và ricin trong khoảng giá trị trên. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi có sai khác với các nghiên cứu của Xiaohua He và cộng sự. Trong nghiên cứu này, Xiaohua He sử dụng kháng thể đơn dòng gắn lên khay và bắt cặp đặc hiệu với ricin theo kiểu sandwich và sử dụng kháng thể đơn dòng thứ cấp gắn chuỗi ADN sau đó tiến hành real-time PCR chuỗi ADN để phát hiện ricin thì ngưỡng phát hiện đạt tới 10 pg/ml [7]. Trong một nghiên cứu khác, Lubelli và cộng sự cũng đã phát hiện ricin trong huyết thanh người qua 02 loại kháng thể đơn dòng có gắn chuỗi ADN có ngưỡng phát hiện đến 10 fg/ml [6]. Tuy nhiên, trong nghiên cứu này, chúng tôi gắn trực tiếp ricin lên khay polystyren và sử dụng aptamer Ar5.9 để gắn kết đặc hiệu ricin nên giới hạn phát hiện không tiếp cận được như các nghiên cứu sử dụng kháng thể đơn dòng gắn kết ricin trước khi đưa vào phản ứng real-time PCR. 4. KẾT LUẬN Nghiên cứu đã ứng dụng aptamer đặc hiệu ricin Ar5.9 và kỹ thuật real-time PCR để phát triển thành công phương pháp phát hiện ricin trong các loại mẫu nước (nước mặt, nước ngầm và nước sinh hoạt). Phương pháp có ngưỡng phát hiện và giới hạn định lượng với ricin lần lượt là 0,36 ng/ml và 1,32 ng/ml, độ nhạy với nước ngầm và nước mặt đạt 98%, với nước sinh hoạt đạt 99% và độ đặc hiệu đạt 98%. Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy aptamer Ar5.9 không phản ứng chéo với các mẫu protein có cấu trúc lectin gần giống với ricin. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Nguyễn Quốc Hùng, “Hoàn thiện công nghệ sản xuất và áp dụng thử Test phát hiện nhanh độc tố ricin”, Đề tài AT cấp Bộ Quốc Phòng, 2015. [2]. TCVN 6663-1:2011, “Chất lượng nước – lấy mẫu – Phần 1: Hướng dẫn lập chương trình lấy mẫu và kỹ thuật lấy mẫu”, Trung tâm tiêu chuẩn đo lường chất lượng, Số 8, Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội, 2011. [3]. Nguyễn Văn Đức, Lê Thanh Hải, “Phương pháp kiểm tra thống kê sinh học”, Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật, (2012), tr 34-50. [4]. Trần Cao Sơn, “Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học và vi sinh vật học”, NXB Khoa học và Kỹ thuật, 2015. [5]. Ngô Ngọc Trung, Lã Thị Huyền, Trần Thị Bích Đào, Lê Quang Huấn, “Nghiên cứu sàng lọc aptamer đặc hiệu độc tố ricin”, Tạp chí Nghiên cứu khoa học và công nghệ quân sự, số 55, tháng 6/2018, Tr. 160-168. Hóa học & Kỹ thuật môi trường N. N. Trung, , L. Q. Huấn, “Phát triển phương pháp phát hiện với real-time PCR.” 160 [6]. Lubelli, C,. Chatgilialoglu, A. Bolognesi, P. Strocchi, M. Colombatti, and F. Stirpe, “Detection of ricin and other ribosome –inactivating proteins by an immune- polymerase chain reaction assay”, Analytical Biochemistry, Vol 355, issue 1, (2006), pp. 102-109. [7]. Xiaohua He et al, “Development of a Novel Immuno-PCR Assay for Detection of Ricin in Ground Beef, Liquid Chicken Egg, and Milk”, Journal of Food Protection, Vol 73, No 4 (2010), pp. 695-700. [8]. Xiaohua He et al, “Detection of Castor Contamination by Real-Time Polymerase Chain Reaction”, Journal of Agricultural and Food Chemistry, Vol 55, (2007), pp. 545-550. [9]. Eva Felder, “Simultaneous Detection of Ricin and Abrin DNA by Real-Time PCR (qPCR)”, Toxins, Vol 4, (2012), 633-642. [10]. Kortepeter MG, Parker GW, “Potential biological weapons threats”, Emerging Infection Disease, (1999), pp. 523–527. [11]. Manashi Bagchi, Shirley Zafra-Stone, Francis C.Lau, and Bebasis Bagchi, “Ricin and Abrin, Handbook of Toxicology of Chemical Warfare Agents”, Publish by Elsevier, (2009), pp 681-720. ABSTRACT DEVELOPMENT OF RICIN DETECTION METHOD IN WATER SAMPLES USING THE APTAMER AND REAL-TIME PCR Ricin is a kind of plan lectin which is found in Castor bean. Ricin is toxic to animal cells by replacing a single adenine base on the sarcin-ricin ring structure (SRL), thereby altering the structure of the large rRNA 28S subunit and inhibiting protein synthesis in the cell. As such, ricin is classified as a dangerous biological weapon used in warfare or terrorism. In this study, we developed an analytical method for ricin detection using the real-time PCR based on ricin-specific aptamer Ar5.9. The result showed that ricin in water could be detected at the limit of quantitative 1,32 ng, the sensitivity for underground and surface water is 98%, for domestic water is 99% and the specificity is 98%. Keywords: Ricin; Real-time PCR detection of ricin; Ricin-specific aptamer. Nhận bài ngày 21 tháng 12 năm 2018 Hoàn thiện ngày 12 tháng 02 năm 2019 Chấp nhận đăng ngày 19 tháng 02 năm 2019 Địa chỉ: 1Viện Hóa học Môi trường quân Sự/Bộ tư lệnh Hóa học; 2 Viện Công nghệ sinh học/ Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. * Email: trungbio@gmail.com.