Phát hiện đột biến kháng thuốc trên bệnh nhân viêm gan siêu vi B mạn điều trị với thuốc nucleoside/nucleotide

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 21 * Số 1 * 2017 Nghiên cứu Y học Bệnh Nhiễm 15 PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN KHÁNG THUỐC TRÊN BỆNH NHÂN VIÊM GAN SIÊU VI B MẠN ĐIỀU TRỊ VỚI THUỐC NUCLEOSIDE/NUCLEOTIDE Bùi Phan Quỳnh Phương*, Lê Minh Châu**, Cao Minh Nga*** TÓM TẮT Mở đầu: Điều trị viêm gan siêu vi B là một thách thức đối với ngành y tế trên thế giới. Tuy các loại thuốc Nucleoside/Nucleotide mang lại hiệu quả điều trị bệnh viêm gan B mạn tính, nhưng vấn đề kháng thuốc vẫn còn là mối quan tâm hiện nay. Mục tiêu nghiên cứu: (1) Phát hiện đột biến kháng thuốc và kiểu gen của siêu vi viêm gan B. (2) Mô tả các đột biến kháng thuốc Nucleoside/Nucleotide Đối tượng và phương pháp: Có tổng cộng 72 bệnh nhân đang điều trị Nucleoside/Nucleotide được chọn, thời gian điều trị trung bình 26 tháng. Đáp ứng siêu vi được đo bằng nồng độ HBVDNA, đột biến kháng thuốc được xác định bằng phương pháp giải trình tự chuỗi bộ gen phiên mã ngược của siêu vi B. Các yếu tố liên quan với đáp ứng siêu vi, kiểu gen và đột biến kháng thuốc được phân tích. Kết quả: Tổng số 72 trường hợp với 41 nam (56,94%) và 31 nữ (43,06%), trung bình độ tuổi 39,52 ± 11,02. Chỉ phát hiện hai loại kiểu gen B và kiểu gen C. Tất cả có 16 trường hợp kháng thuốc (chiếm 22,2%), các loại đột biến được phát hiện là M204I (37,50%), M204V (12,50%), L180M + M204I (12,50%), L180 + M204V (18,75%) và M204V + L180M + V173L (6,25%), A181T (12,50%). Không phát hiện đột biến kháng thuốc với Tenofovir và Entecavir. Nồng độ HBVDNA trước điều trị cao và thời gian điều trị kéo dài có liên quan với sự phát triển đột biến kháng thuốc (p <0,05). Kết luận: Nghiên cứu này khẳng định giải trình tự đóng vai trò rất quan trọng trong việc xác định kiểu gen siêu vi viêm gan B và các đột biến kháng thuốc; từ những kết quả này chúng tôi có thể chọn lựa điều trị tối ưu cho bệnh nhân. Từ khóa: đột biến kháng thuốc, nucleotide, nucleoside. ABSTRACT DETECT RESISTANCE MUTATIONS IN PATIENTS CHRONIC HEPATITIS B TREATMENT WITH NUCLEOSIDE/NUCLEOTIDE ANALOGUE Bui Phan Quynh Phuong, Le Minh Chau, Cao Minh Nga * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement of Vol. 21 - No 1 - 2017: 15 - 22 Background and objective: Management of hepatitis B is a global public health challenge, antiviral therapy for chronic hepatitis B (CHB) has improved the outcomes. Nucleos(t)ide analogues have become the mainstream drugs for the treatment of CHB, however, drug resistance is a serious problem. In this study, we aim to characterize the antiviral resistance mutations to nucleos(t)ide analogues in patients diagnosed CHB. Both drug resistance gene mutation detection and HBV genotyping are helpful for guiding clinical treatment. Patients and Methods: Total 72 nucleot(s)ides-treated patients, with median treatment duration 26 months were studied. Virological response was measured by hepatitis B virus (HBV)DNA levels. Antiviral resistance mutations were identified by sequencing HBV-reverse transcriptase domains. Factors associated with virological response and antiviral resistance mutations were analyzed. * Đại học Y khoa Phạm Ngọc Thạch **BV Nguyễn Tri Phương ***Đại học Y Dược TP. HCM Tác giả liên lạc: BSCKII. Bùi Phan Quỳnh Phương ĐT: 098.998.5275 Email: khoiphuong@yahoo.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 21 * Số 1 * 2017 Chuyên Đề Nội Khoa 16 Results: Total 72 cases with 41 males (56.94%) and 31 females (43.06%), median age 39.52 ± 11.02. There are only two genotype of HBV: genotype B and genotype C. Totally there are 16 cases (22.2%) mutations with following established proportions and types M204I (37,50%), M204V (12,50%),L180M+M204I (12.50%), L180+M204V (18.75%) and M204V+L180M+V173L (6.25%), A181T (12.50%). No resistance mutations detected with Tenofovir and Entecavir. High HBVDNA levels before treatment and increased treatment duration were associated with the development of nucleo(t)ides resistant mutations (p<0.05). Conclusions: This study confirms the sequencing plays a very important role in identifying hepatitis B virus genotypes and resistance mutations; from those results, we can approach on optimal treatment course. Keyword: resistance mutations, nucleotide, nucleoside ĐẶT VẤN ĐỀ Theo ước tính của Tổ chức Y tế Thế giới, hiện nay khoảng 400 triệu người đang mang mầm bệnh siêu vi viêm gan B mạn tính, trong đó hơn một triệu người có thể chết vì hậu quả của bệnh như xơ gan, ung thư biểu mô tế bào gan(7). Việt Nam nằm trong vùng lưu hành cao của siêu vi viêm gan B, tỉ lệ nhiễm siêu vi viêm gan B mạn chiếm 10–20% tổng số dân số(8). Từ khi FDA (Food and Drug Administration= Cơ quan quản lý thuốc và thực phẩm Mỹ) công nhận các thuốc đặc trị của bệnh viêm gan siêu vi B mạn gồm Interferon và các thuốc uống thuộc nhóm nucleoside/nucleotide, đã góp phần hạn chế các biến chứng của bệnh. Các loại thuốc uốngcó ưu điểm là dễ dung nạp, ít tác dụng phụ, tuy nhiên do thời gian sử dụng kéo dài nên kháng thuốc là điều khó tránh khỏi. Đây là một trong những nguyên nhân quan trọng gây thất bại trong điều trị viêm gan siêu vi B mạn tính. Tại một số cơ sở y tế, việc chẩn đoán kháng thuốc chủ yếu chỉ dựa vào sự gia tăng trở lại nồng độ HBVDNA trong quá trình điều trị mà chưa thực hiện xét nghiệm tìm đột biến kháng thuốc. Trong hệ thống xét nghiệm sinh học phân tử, giải trình tự chuỗi được xem là tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán kháng thuốc. Xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Phát hiện đột biến kháng thuốc trên bệnh nhân viêm gan siêu vi B mạn điều trị bằngnucleoside/nucleotide” tại Bệnh viện Đại học Y dược cơ sở 2, đồng thời vừa xác định kiểu gen, vừa xác định đột biến kháng thuốc nucleoside/nucleotide, nhằm mục đích xem những trường hợp không đáp ứng điều trị trên lâm sàng có thật sự do đột biến kháng thuốc hay không, từ đó có cơ sở để quyết định chọn lựa phác đồ điều trị phù hợp cho bệnh nhân. Mục tiêu nghiên cứu Xác định tỉ lệ kiểu gen của siêu vi viêm gan B và tỉ lệ đột biến kháng thuốc trên bệnh nhân đang điều trị viêm gan siêu vi B mạn bằng nucleoside/nucleotide. Mô tả các mối liên quan giữa đột biến kháng thuốc với các yếu tố liên quan việc điều trị viêm gan siêu vi B mạn. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Bệnh nhân đang điều trị với các thuốc đồng phân Nucleoside/Nucleotide tại phòng khám viêm gan Bệnh viện Ðại học Y dược Thành phố Hồ Chí Minh, cơ sở 2, trong thời gian từ 1/10/2014– 31/3/2015. Thiết kế nghiên cứu Mô tả cắt ngang. Tiêu chuẩn chọn mẫu Ðối tượng được chọn vào nghiên cứu khi thỏa các điều kiện sau: Ðối tượng viêm gan siêu vi B mạn được điều trị bằng các loại đồng phân nucleoside/nucleotide ít nhất 3 tháng và không đáp ứng điều trị tại phòng khám gan Bệnh viên Ðại học Y dược TPHCM, cơ sở 2. Nồng độ HBVDNA>103 copies/mL tại thời điểm nghiên cứu. Đồng ý tham gia vào nghiên cứu. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 21 * Số 1 * 2017 Nghiên cứu Y học Bệnh Nhiễm 17 Tiêu chuẩn loại trừ Đồng nhiễm HCV hay HIV. Các trường hợp viêm gan do nguyên nhân khác (viêm gan tự miễn, do rượu, do thuốc, nhiễm mỡ). Các bệnh nội khoa mạn tính. Cỡ mẫu Dựa vào công thức chọn mẫu phù hợp phương pháp nghiên cứu, chúng tôi có được 72 trường hợp. Phương pháp thu thập số liệu Chúng tôi chọn những bệnh nhân thoả tiêu chuẩn thực hiện qui trình giải trình tự để xác định đột biến kháng thuốc và xác định kiểu gen của siêu vi viêm gan B gồm các bước chính: (1) Thực hiện PCR; (2) Thực hiện phản ứng cắt; (3) Điện di và phân tích kết quả. Bảng câu hỏi được soạn sẵn có ghi nhận lại các yếu tố dịch tễ học, tiền sử bệnh, các xét nghiệm sinh hoá, dấu ấn huyết thanh viêm gan siêu vi B, nồng độ HBVDNA tại thời điểm bắt đầu điều trị và lúc tiến hành nghiên cứu.Bệnh nhân được giải thích rõ mục tiêu nghiên cứu và đồng ý lấy máu tiến hành xét nghiệm giải trình tự chuỗi tại phòng xét nghiệm sinh học phân tử bệnh viện Đại học Y Dược cơ sở 2. Xử lý và phân tích số liệu Số liệu thu thập sẽ được mã hóa và nhập vào chương trình STATA 12 để xử lý và phân tích. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Đặc điểm dịch tễ học Trong thời gian nghiên cứu từ 1/10/2014 đến 31/3/2015, chúng tôi đã thu thập được 72 trường hợp, bao gồm nam 41 trường hợp (chiếm 56,94%), nữ 31 trường hợp (chiếm 43,06%), tuổi nhỏ nhất là 15, lớn nhất là 61, tuổi trung bình là 39,52 ±11,02 tuổi. Loại thuốc bệnh nhân đang sử dụng và thời gian điều trị Đa số bệnh nhân được điều trị với Tenofovir (36,11%), có 59 trường hợp (81,14%) đang điều trị một loại thuốc,13 trường hợp (13,06%) phối hợp hai loại thuốc. Thời gian điều trị trung bình chung các loại thuốc 26,77 ± 13,67 tháng. Bảng 1. Loại thuốc nucleoside/nucleotide đang sử dụng và thời gian điều trị Loại thuốc đang điều trị Tần số (Tỉ lệ) Thời gian trung bình Lamivudine 17 (23,61%) 31,41 ±13,91 tháng Adefovir 7 (9,72%) 30,86 ±11,42 tháng Entecavir 9 (12,5%) 15,22 ±9,07 tháng Tenofovir 26 (36,11%) 25,07 ±11,60 tháng Lamivudine + Adefovir 4 (5,36%) 52 ±5,65 tháng Lamivudine + Tenofovir 8 (11,11%) 20,87 ±7,12 tháng Entecavir + Tenofovir 1 (1,39%) 8 tháng Tổng cộng 72 (100%) Đặc điểm về kiểu đáp ứng điều trị Bảng 2. Đặc điểm về kiểu đáp ứng điều trị Kiểu đáp ứng Tần số Tỉ lệ (%) Không đáp ứng tiên phát 4 5,56 Không đáp ứng/đáp ứng một phần 32 44,44 Bùng phát siêu vi 33 45,83 Bùng phát sinh hoá 3 4,17 Tổng cộng 72 100 Nhận xét: Bùng phát siêu vi gặp nhiều nhất, có 33 trường hợp (45,83%). Nồng độ HBVDNA lúc khởi đầu điều trị Bảng 3. HBVDNA lúc khởi đầu điều trị và khi thất bại điều trị Nồng độ HBVDNA Khởi đầu điều trị Khi thất bại điều trị 4log10 2 (2,78%) 32 (44,44%) 5log10 24 (33,33%) 19 (26,39%) 6log10 19 (26,39%) 6 (8,33%) 7log10 8 (11,11%) 4 (5,56%) 8log10 14 (19,45%) 6 (8,33%) 9log10 5 (6,94%) 5 (6,94%) Tổng cộng 72 (100%) 72 (100%) Nhận xét: Nồng độ HBVDNA lúc khởi đầu điều trị có trị số trung bình là 6,3log10 ±1,3 copies/mL vàtại thời điểm xét nghiệm đột biến kháng thuốc trung bình là 5,3log10± 1,6 copies/mL Tần suất đột biến kháng thuốc Chúng tôi phát hiện được 16 trường hợp đột biến kháng thuốc, chiếm tỉ lệ 22,22%, có 14 trường hợp kháng Lamivudine, chiếm 19,44%, Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 21 * Số 1 * 2017 Chuyên Đề Nội Khoa 18 có 2 trường hợp kháng Adefovir, chiếm 2,78%. Không ghi nhận trường hợp nào đột biến kháng Entecavir và Tenofovir. Tỉ lệ kiểu gen của siêu vi viêm gan B là 72,22% đối với genotype B và 27,78% đối với genotype C. Các vị trí đột biến kháng thuốc được phát hiện Bảng 4. Các vị trí đột biến kháng thuốc được phát hiện Thuốc Điểm đột biến Tần số Tỉ lệ Lamivudine M204I 6 37,50% M204V 2 12,50% L180M+M204I 2 12,50% L180M+ M204V 3 18,75 % M204V+l180M +V173L 1 6,25% Adefovir A181T 2 12,50% Tuổi trung bình của hai nhóm có đột biến và không đột biến Bảng 5. So sánh tuổi trung bình hai nhóm có đột biến và không đột biến Không đột biến (n=56) Có đột biến (n=16) P Tuổi trung bình 39,37 ± 9,84 40,06 ± 14,79 0,82 Nhận xét: Tuổi trung bình của hai nhóm không khác biệt nhau một cách có ý nghĩa (p>0,05). Mối liên quan giữa đột biến kháng thuốc và thời gian điều trị Bảng 6.Đột biến kháng thuốc và thời gian điều trị Không đột biến (n=56) Có đột biến (n–16) P Thời gian điều trị trung bình 24,78 ± 12,71 33,75 ± 15,01 0,01 Nhận xét: Thời gian điều trị trung bình của hai nhómkhác biệt nhau một cách có ý nghĩa (p<0,05). Mối liên quan giữa đột biến kháng thuốc và kiểu gen Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa đột biến kháng thuốc và kiểu gen (p >0,05). Bảng 7. Mối liên quan giữa đột biến kháng thuốc và kiểu gen Kiểu gen/ Đột biến Không Có Tổng cộng B 40 12 52 C 16 4 20 Tổng cộng 56 16 72 Mối liên quan giữa đột biến kháng thuốc và nồng độ HBVDNA thời điểm bắt đầu điều trị Bảng 8. Mối liên quan giữa kháng thuốc và HBVDNA khởi đầu HBVDNA / Đột biến Không Có Tổng cộng < 6log10 25 1 26 ≥ 6log10 31 15 46 Tổng cộng 56 16 72 Nhận xét: Có sự khác biệt có ý nghĩa giữa đột biến kháng thuốc và HBVDNA lúc khởi đầu điều trị (p<0,05). Mối liên quan giữa đột biến kháng thuốc và HBVDNA khi thất bại điều trị Bảng 9. Mối liên quan giữa kháng thuốc và HBVDNA khi thất bại điều trị HBVDNA / Đột biến Không Có Tổng cộng <6log10 39 12 51 ≥6log10 17 4 21 Tổng cộng 56 16 72 Nhận xét: Không có sự khác biệt có ý nghĩa (p>0,05). Mối liên quan giữa việc xuất hiện đột biến kháng thuốc và kiểu đáp ứng điều trị Bảng 10. Mối liên quan giữa đột biến kháng thuốc và kiểu đáp ứng Kiểu đáp ứng/ Đột biến Không Có Tổng cộng Không đáp ứng tiên phát 4 0 4 Không đáp ứng/đáp ứng một phần 28 4 32 Bùng phát siêu vi 22 11 33 Bùng phát sinh hoá 2 1 3 Tổng cộng 56 16 72 Nhận xét: Tỉ lệ có đột biến trong nhóm bùng phát siêu vi là 11/33= 33,33%. Tỉ lệ đột biến nhóm đáp ứng một phần/không đáp ứng là 4/32= 12,5%. Có sự khác biệt về tỉ lệ đột biến giữa hai nhóm bùng phát siêu vi và không đáp ứng/đáp ứng một phần. (prtesti, p<0,05). Không có sự Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 21 * Số 1 * 2017 Nghiên cứu Y học Bệnh Nhiễm 19 khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa đột biến kháng thuốc và các kiểu thất bại điều trị Fisher exact = 0,13 (>0,05). BÀN LUẬN Đặc điểm chung Trong 72 trường hợp, tỉ lệ nam cao hơn nữ (56,94% so với 43,06%). Tuổi trung bình là 39,53 ± 11,01.Kết quả tuổi trung bình của chúng tôi tương tự với các nghiên cứu khác đều nằm trong khoảng 30 đến 40 tuổi. Tất cả có 59 trường hợp khởi đầu với đơn trị liệu, 13 trường hợp có phối hợp 2 loại thuốc như Lamivudine và Adefovir (5,56%), Lamivudine và Tenofovir (11,11%), Entecavir và Tenofovir (1,39%). Thời gian điều trị trung bình của 72 trường hợp là 26,77 ± 13,67 tháng. Theo y văn, để đạt mục tiêu đáp ứng siêu vi toàn phần, thời gian điều trị viêm gan siêu vi B mạn có thể kéo dài nhiều năm, tuỳ theo từng trường hợp bệnh nhân cụ thể, đôi khi dùng suốt đời. So sánh với các kết quả khác, chúng tôi ghi nhận có điểm tương đồng nhau giữa thời gian điều trị trung bình giữa các nhóm nghiên cứu(3,9,10,11). Kết quả của chúng tôi có tỉ lệ bùng phát siêu vi là 45,83%, cao nhất trong các kiểu không đáp ứng điều trị trên lâm sàng. Salpini và cộng sự đã nghiên cứu trên 204 bệnh nhân viêm gan siêu vi B mạn điều trị với các thuốc nucleoside/nucleotide xác định có 27,5% không đáp ứng tửng phần/toàn phần, nhưng cóđến 72,5% trường hợp bị bùng phát siêu vi(12). Nồng độ HBVDNA trong huyết thanhlà xét nghiệm để xác định trường hợp nào cần điều trị và nên thực hiện định kỳ trong quá trình điều trị để biết có đạt kết quả đáp ứng điều trị hay không thông qua mức độ ức chế siêu vi. Đặc biệt nồng độ HBVDNA trong huyết thanh lúc khởi đầu được xem là một trong những yếu tố liên quan với khả năng phát sinh kháng thuốc.Kết quả chúng tôi có nồng độ HBVDNA với trị số trung bình là 6,3log10 ±1,3 copies/mL. Khi chúng tôi chia 2 nhóm gồm nhóm có nồng độ HBVDNA thấp (<6log10) và nồng độ HBVDNA cao (≥6log10), ghi nhận có 46 trường hợp trong nhóm có nồng độ HBVDNA cao (63,89%). Tại thời điểm thất bại điều trị trên lâm sàng, nồng độ HBVDNA trung bình được ghi nhận là 5,3log10±1,6 copies/mL, bệnh nhân được tiến hành thực hiện xét nghiệm giải trình tự chuỗi. Tỉ lệ kiểu gen và tỉ lệ đột biến kháng thuốc Chúng tôi chỉ phát hiện kiểu gen B và C trong mẫu nghiên cứu, kiểu gen B có 52 trường hợp (tỉ lệ 72,22%), kiểu gen C có 20 trường hợp (tỉ lệ 27,78 %). Kết quả này cũng tương tự với kết quả nghiên cứu của H.T.Đạt với kiểu gen B chiếm đa số với tỉ lệ 62,3%, kiểu gen C chiếm tỉ lệ 37,7%(3). N.T.N.Đoan với kết quả kiểu gen B chiếm 75%, kiểu gen C chiếm 25%. Thuy Le cho kết quả kiểu gen B là 61%, kiểu gen C là 18. C.M.Nga ghi nhận trên bệnh nhi nhiễm siêu vi viêm gan B, kiểu gen B chiếm đa số (69,6%) so với kiểu gen C (7,6%), tỉ lệ nhiễm hỗn hợp kiểu gen B và C là 22,8%(2). Nhiều tác giả Châu Á khác như Akuta N. trong một nghiên cứu tại Nhật về ảnh hưởng kiểu gen trên đáp ứng điều trị chống siêu vi đã ghi nhận đa số mang 2 kiểu gen B và C, kiểu gen C thường có sự chuyển đổi huyết thanh HBeAg chậm hơn và diễn tiến bệnh gan nặng hơn so với kiểu gen B(1). Hsieh với nghiên cứu tại Đài Loan cũng cho thấy tỉ lệ kiểu gen B chiếm nhiều hơn so với kiểu gen C (60% so với 40%)(4). Theo y văn, kiểu gen B của HBV thường có chuyển đổi huyết thanh B sớm hơn, thoái triển bền vững hơn, phản ứng viêm hoại tử của gan ít hơn, tiến triển tới xơ gan chậm hơn và tỉ lệ ung thư gan thấp hơn so với kiểu gen C. Tuy nhiên, mức độ kháng thuốc của kiểu gen B thì cao hơn so với kiểu gen C. Bằng phương pháp giải mã trình tự đoạn gen HBV polymerase, chúng tôi đã phát hiện được 16 trường hợp có đột biến kháng thuốc, tương đương tỉ lệ đột biến là 22,22%. Trong 16 trường hợp có đột biến kháng thuốc, có tất cả 14/16 trường hợp kháng Lamivudine, chiếm Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 21 * Số 1 * 2017 Chuyên Đề Nội Khoa 20 19,44% tổng số nghiên cứu và 87,5% trường hợp kháng thuốc. Có 2/16 trường hợp kháng Adefovir, chiếm 2,78% mẫu nghiên cứu và chiếm 12,5% trường hợp kháng thuốc. Chúng tôi không phát hiện trường hợp nào kháng Entecavir và Tenofovir. Đặc điểm kháng thuốc của từng loại thuốc Lamivudine là thuốc điều trịviêm gan siêu vi B mạn xuất hiện đầu tiên. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phát hiện tất cả 14 trường hợp kháng thuốc trong 29 trường hợp điều trị với Lamivudine bao gồm đơn trị và phối hợp, thời gian điều trị trung bình của Lamivudine là 31,41±13,91 tháng. Phát hiện được 87,5% kháng với Lamivudine trên tổng số các trường hợp có đột biến kháng thuốc và chiếm 19,44% tổng số mẫu nghiên cứu.Sự phân bố các vị trí đột biến kháng Lamivudine theo nghiên cứu của chúng tôi gồm 6 trường hợp M204I (37,5%), 2 trường hợp M204V (12,5%), 2 trường hợp L180M+M204I (12,5%), 3 trường hợp L180M+M204V (18,7%) và có sự xuất hiện 1 trường hợp xuất hiện tổ hợp đột biến kháng thuốc M204V+L180M+V173L (6,2%). Nếu gộp chung các điểm đột biến ở cùng vị trí nhưng thay đổi acid amin khác nhau thì chúng tôi có tất cả 8 trường hợp đột biến tại M204I/V và 5 tổ hợp hai đột biến L180M+M204V/I và một tổ hợp có ba điểm đột biến nêu trên. Có một trường hợp xuất hiện tổ hợp đột biến kháng thuốc M204V+L180M+V173L, đây là tổ hợp đột biến rất quan trọng đối với sức khoẻ cộng đồngdo có khả năng làm xuất hiện và lây lan một chủng siêu vi viêm gan B không đáp ứng với thuốc chủng ngừa(9). Adefovir là loại thuốc nhóm nucleotide được chấp nhận vào năm 2002 dùng để điều trị viêm gan siêu vi B mạn. Từ đó, Adefovir thường được chỉ định thêm vào hay thay đổi những trường hợp nào nghi kháng với Lamivudine.Chúng tôi có tổng cộng 11 trường hợp điều trị Adefovir đơn trị liệu và phối hợp với Lamivudine, có 2/11 trường hợp kháng Adefovir phát hiện đột biến ở vị trí A181T và một trường hợp có tiền sử điều trị không đáp ứng với điều trị Lamivudine trước đó, chiếm 2,78% trong tổng số 72 mẫu nghiên cứu và chiếm 12,5% trong các trường hợp có đột biến kháng thuốc. Entecavir là thuốc có hiệu lực mạnh và hàng rào kháng thuốc cao, hiệu quả trong điều trị viêm gan siêu vi B mạn, thể hiện qua cải thiện mô học, ổn định men gan và giảm nồng độ HBVDNA. Tuy nhiên, kháng Entecavir sẽ xuất hiện tỉ lệ cao ở người có kháng Lamivudine. Chúng tôi có 9 trường hợp được điều trị khởi đầu đơn trị liệu với Entecavir, và một trường hợp kết hợp Entecavir và Tenofovir. Tuykhông ghi nhận được trường hợp nào có đột biến kháng Entecavir, nhưng chúng tôi đặc biệt chú ý các bệnh nhân có kháng Lamivudine có xuất hiện tổ hợp đột biến L180M+M204V/I và tổ hợp ba đột biến gồm L180M+M204V+V173L để tránh sử dụng Entecavir cho những trường hợp này. Chúng tôi không ghi nhận trường hợp nàocó xuất hiện đột biến kháng thuốc Tenofovir trong tất cả 26 trường hợp đơn trị Tenofovir và 8 trường hợp có sự kết hợp Lamivudine và Tenofovir và 1 trường hợp Entecavir và Tenofovir. Điều này phù hợp với một số nghiên cứu khác ở Việt Nam và thế giới(9,10). Mối liên quan giữa đột biến kháng thuốc và các yếu tố khác Khi so sánh tuổi trung bình của nhóm có và không đột biến, chúng tôi ghi nhận không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê, so sánh với N.T.N.Đoan cótuổi trung bình của nhóm đột biến dài hơn nhóm không đột biến 10 tháng(5), có thể sự khác nhau này do cỡ mẫu và thời điểm nghiên cứu khác nhau. Thời gian trung bình giữa nhóm không đột biến ngắn hơn so với thời gian trung bình của nhóm có đột biến, có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,01), chứng tỏ khả năng xuất hiện đột biến khi bệnh nhân viêm gan siêu vi B mạn điều trị lâu dài thuốc uống nucleoside/nucleotide. Chúng tôi ghi nhận không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa kiểu gen và đột biến Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 21 * Số 1 * 2017 Nghiên cứu Y học Bệnh Nhiễm 21 kháng thuốc, cũng như không có sự khác biệt giữa các kiểu gen và từng vị trí đột biến kháng thuốc, kết quả này có tương tự một số tác giả trong nước(3,10). Jie Ma nhận xét tần suất đột biến kháng thuốc ở kiểu gen B cao hơn một cách có ý nghĩa thống kê so với kiểu gen C (61,4% so với 23,6%, p=0,007), tuy nhiên điểm đột biến A181T cao hơn nhiền ở kiểu gen C so với kiểu gen B (61% so với 11%, p=0,021. Theo Koffi và cộng sự, nếu nồng độ HBVDNA cao tồn tại trong máu thời gian càng lâu thì càng dễ sinh đột biến kháng thuốc(6). Như vậy, chúng ta nhận thấy rằng quyết định của các thầy thuốc lâm sàng quan trọng đối với việc thay đổi thuốc đúng thời điểm nhằm hạn chế đột biến kháng thuốc có thể xảy ra. Tất cả các trường hợp bắt đầu vào lộ trình điều trị viêm gan siêu vi B mạn thì xét nghiệm định lượng nồng độ HBVDNA là không thể thiếu. Kết quả của chúng tôi có nồng độ HBVDNA khởi đầu trung bình vào khoảng 6,31log10 copies/mL. Chúng tôi phân chia thành hai nhóm với nồng độ HBVDNA thấp (<6log10 copies/mL) và cao (≥6log10 copies/mL). Khi so sánh mối liên quan giữa đột biến kháng thuốc và nồng độ HBVDNA, chúng tôi nhận thấy có sự liên quan giữa nồng độ HBVDNA trước điều trị và đột biến kháng thuốc (p<0,05). Tuy nhiên do đây là nghiên cứu mô tả cắt ngang nên chúng tôi không xác định được rõ liên quan đến mức độ nào.Jeong Han Kimcũng đã cho kết quả tỉ lệ trung bình của HBVDNA ban đầu là 7,3log10 copies/mL và ghi nhận nồng độ HBVDNA cao có liên quan đến đột biến kháng thuốc. Nồng độ HBVDNA là xét nghiệm rất quan trọng để theo dõi diễn tiến và hiệu quả điều trị viêm gan siêu vi B mạn. Trên thực tiễn lâm sàng, có những cơ sở y tế chưa có điều kiện để thực hiện phương pháp xét nghiệm tìm đột biến kháng thuốc thì xét nghiệm nồng độ HBVDNA là vô cùng quan trọng để có thể biết bệnh nhân có đáp ứng điều trị hay không. Phát hiện bùng phát siêu vi cần phải biết nồng độ HBVDNA trong huyết thanh trước điều trị, thời điểm đáp ứng tiên phát và thời điểm lúc HBVDNA tăng trở lại. Kết quả của chúng tôi ghi nhận mối liên quan giữa nồng độ HBVDNA tại thời điểm không đáp ứng điều trị và đột biến kháng thuốc không khác biệt có ý nghĩa thống kê. Đa số kết quả đột biến kháng thuốc của chúng tôi đều có sự gia tăng HBVDNA nhưng giá trị <6log10 copies/mL. Kỹ thuật giải trình tự chuỗi trực tiếp mà chúng tôi thực hiện trong nghiên cứu này chỉ phát hiện đột biến kháng thuốc khi nồng độ HBVDNA > 103copies/mL, do đó có những trường hợp trên lâm sàng có thất bại điều trị mà xét nghiệm HBVDNA chỉ phát hiện ≤ 103copies/mL nên chúng tôi không thực hiện được kỹ thuật này. Những trường hợp này chúng tôi sẽ theo dõi diễn tiến và đánh giá lại sau ba tháng, đồng thời dặn dò bệnh nhân tuân thủ điều trị tốt, nếu HBVDNA vẫn tiếp tục tăng lại sẽ thực hiện lại kỹ thuật giải trình tự chuỗi trực tiếp để chẩn đoán xác định. Về mối liên quan giữa đột biến kháng thuốc và tất cả các kiểu đáp ứng điều trị, chúng tôi nhận thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê. Tuy nhiên, khi so sánh nhóm bùng phát siêu vi và nhóm đáp ứng một phần hay không đáp ứng điều trị, chúng tôi có ghi nhận đột biến kháng thuốc cao một cách có ý nghĩa ở nhóm bùng phát siêu vi hơn (33,33% so với 12,5%, p<0,05). Những trường hợp không đáp ứng hoàn toàn hay đáp ứng một phần được phát hiện kháng thuốc chiếm tỉ lệ 12,5% bệnh nhân. Những trường hợp này đều có tiền sử tiếp xúc với Lamivudine. Tuy nhiên, trong nhóm này, có đến 87,5% trường hợp không ghi nhận có đột biến kháng thuốc, trong đó có cả những trường hợp đang điều trị với Entecavir và Tenofovir là thuốc có hoạt lực mạnh. Điều này có thể do bệnh nhân không gắn kết với điều trị một cách nghiêm ngặt. Salpini cũng ghi nhận tỉ lệ đột biến kháng Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 21 * Số 1 * 2017 Chuyên Đề Nội Khoa 22 thuốc trong nhóm bùng phát siêu vi cao hơn so với nhóm đáp ứng một phần hay đáp ứng không toàn phần là 79,1% so với 53,6% (p=0,001). KẾT LUẬN Qua nghiên cứu 72 bệnh nhân đang điều trị với các thuốc đồng phân Nucleoside/Nucleotide tại phòng khám viêm gan Bệnh viện Ðại học Y Dược TP. HCM, cơ sở 2, trong thời gian từ 1/10/2014 – 31/3/2015, chúng tôi rút ra được kết luận như sau: Tỉ lệ kiểu gen của siêu vi viêm gan B là 72,22% đối với genotype B và 27,78% đối với genotype C. Tỉ lệ đột biến kháng thuốc trên bệnh nhân đang điều trị viêm gan B mạn bằng nucleoside/nucleotide là 22,22%, trong đó kháng Lamivudine là 19,44% và kháng Adefovir là 2,78%. Đột biến kháng thuốc không khác biệt có ý nghĩa thống kê với các yếu tố kiểu gen của HBV, nồng độ HBV-DNA tại thời điểm không đáp ứng điều trị và các kiểu đáp ứng với điều trị của HBV. Đột biến kháng thuốc khác biệt có ý nghĩa thống kê với nồng độ HBV-DNA trước điều trị (p<0,05). Phát hiện đột biến kháng thuốc bằng phương pháp giải trình tự gen đóng vai trò rất quan trọng trong việc đồng thời xác định kiểu gen vừa phát hiện đột biến kháng thuốc; từ những kết quả này giúp các bác sĩ lâm sàng có thể chọn lựa điều trị tối ưu cho bệnh nhân. Đây là một trong những bước phát triển trong công tác cận lâm sàng tại bệnh viện giúp cho việc điều trị trở nên dễ dàng và rõ ràng hơn. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Akuta N, Kumada H (2005). “Influence of hepatitis B virus genotypes on the response to antiviral therapies”, J Antimicrob Chemother 55, 139-42. 2. Cao Minh Nga, Nguyễn Thanh Bảo, và Nguyễn Thị Hải Yến. (2011). “Sự phân bố kiểu gen của virus viêm gan B ở trẻ em nhiễm HBV”, Y học Thành phố Hồ Chí Minh Tập 15. 3. Hồ Tấn Đạt, và Phạm Thị Thu Thuỷ. (2006). “Xác định kiểu gen và các đột biến kháng thuốc của siêu vi viêm gan B bằng kỹ thuật giải trình tự chuỗi”. 4. Hsieh TH, Tseng TC, Liu CJ, Lai MY, Chen PJ, Hsieh HL, Chen DS, Kao JH (2009). “Hepatitis B virus genotype B has an earlier emergence of lamivudine resistance than genotype C”, Antivir Ther 14, 1157-63. 5. Kim JH, Jung YK, Joo MK, Yim HJ, Park JJ, Kim JS, Bak YT, Yeon JE, Byun KS (2010). “Hepatitis B viral surface mutations in patients with adefovir resistant chronic hepatitis B with A181T/V polymerase mutations”, J Korean Med Sci 25, 257-64. 6. Koffi J, Egounlety R, Pradat P, Lebosse F, Si-Ahmed SN, Lussier V, Chevallier P, Bailly F, Zoulim F (2014). “Impact of lamivudine-resistance mutations on entecavir treatment outcome in hepatitis B”, Eur J Gastroenterol Hepatol 26, 146-54. 7. Lavanchy D (2005). “Worldwide epidemiology of HBV infection, disease burden, and vaccine prevention”, J Clin Virol 34 Suppl 1, S1-3. 8. Nguyễn Hữu Chí. (2014), Các loại bệnh viêm gan siêu vi, Nhà xuất bản Thanh niên 9. Nguyễn Quỳnh Chi. (2010). Xây dựng kỹ thuật giải mã đột biến gen kháng thuốc của siêu vi viêm gan B, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh. Luận văn thạc sĩ Y học, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh. 10. Nguyễn Thị Nhã Đoan. (2010). Đột biến kháng thuốc trên bệnh nhân viêm gan siêu vi B mạn điều trị Nucleos(t)ides. Luận văn thạc sĩ Y học, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh. 11. Phạm Thị Lệ Hoa, Nguyễn Hữu Chí, Cao Ngọc Nga, và Nguyễn Thị Cẩm Hường. (2008). “Đặc tính kháng Lamivudine trên bệnh nhân viêm gan B mạn không đáp ứng điều trị tại BV Bệnh Nhiệt đới”,1- 2008. 12. Salpini R, Alteri C, Cento V, Pollicita M, Micheli V, Gubertini G, De Sanctis GM, Visca M, Romano S, Sarrecchia C, Andreoni M, Angelico M, Parruti G, Svicher V, Perno CF (2013). “Snapshot on drug-resistance rate and profiles in patients with chronic hepatitis B receiving nucleos(t)ide analogues in clinical practice”, J Med Virol 85, 996-1004. 13. Thuy TTL, Ryo H, Phung LV (2005). “Distribution of genotype/subtype and mutational spectra of the surface gene of hepatitis B virus circulating in Hanoi, Vietnam”, J Med Virol 76, 161-9. Ngày nhận bài báo: 24/11/2016 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 21/12/2016 Ngày bài báo được đăng: 01/03/2017