Phát hiện đồng thời virus cúm A và Human Metapneumovirus (hMPV) trên mẫu phết ở họng mũi bằng kỹ thuật Multiplex RT-PCR

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 5 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 251 PHÁT HIỆN ĐỒNG THỜI VIRUS CÚM A VÀ HUMAN METAPNEUMOVIRUS (hMPV) TRÊN MẪU PHẾT Ở HỌNG MŨI BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX RT-PCR Nguyễn Đại Thức*, Dương Ngọc Anh Trang**, Nguyễn Ngọc Tấn**, Nguyễn Thu Ngọc*** TÓM TẮT Đặt vấn đề: Virus cúm A và human Metapneumovirus (hMPV) là hai trong số các virus gây ra bệnh nhiễm trùng cấp tính đường hô hấp phổ biến nhất. Bệnh do 2 loại virus này có triệu chứng tương tự nhau như ho, hắt hơi, sốt cao kéo dài, mệt mỏi, thường không gây nguy hiểm nhưng trong một số trường hợp phát hiện và điều trị muộn vẫn có thể gây tử vong ở người, như virus cúm A/H5. Chúng tôi thực hiện đề tài này nhằm mục đích xây dựng quy trình chẩn đoán đồng thời hai loại virus nói trên trong cùng một phản ứng PCR. Phương pháp: Khảo sát hoạt động của primer trên phản ứng RT – PCR làm tiền đề xây dựng và tối ưu hóa quy trình multiplex RT - PCR phát hiện đồng thời virus cúm A và hMPV từ dịch phết họng mũi bệnh nhân. Khảo sát trên mẫu dịch phết họng mũi lâm sàng của bệnh nhân ghi ngờ nhiễm bệnh. Kết quả: Chọn được nhiệt độ bắt cặp tối ưu của hệ primer là 55oC; nồng độ tối ưu cả hệ primer lần lượt cho virus cúm A và hMPV là 0,48 µM và 0,56 µM. Sự đặc hiệu của hệ primer được khẳng định khi kết quả phản ứng PCR chỉ cho kết quả dương tính với RNA khuôn mẫu của hai virus nói trên trong khi âm tính với các virus cúm B, Respiratory syncytial virus (RSV), Adeno virus, Rhino virus, Parainfluenza virus (PIV) cũng gây bệnh về đường hô hấp có các triệu chứng tương tự hai loại virus mục tiêu. Quy trình multiplex RT - PCR có độ đặc hiệu cao và độ nhạy đạt 0,002 pg/µl. Kết quả kiểm tra thực nghiệm trên 14 mẫu thu từ bệnh nhân cho thấy có 3 mẫu phết họng-mũi cho kết quả dương tính với virus cúm A, 1 mẫu phết họng-mũi dương tính với virus hMPV, nhưng chưa phát hiện thấy mẫu đồng nhiễm cả hai loại virus. Kết luận: Đã xây dựng và tối ưu hóa thành công quy trình multiplex RT-PCR phát hiện đồng thời hai loại virus hô hấp đang lưu hành. Từ khóa: virus cúm A, human metapneumovirus (hMPV) ABSTRACT DETECTION INFLUENZA A VIRUS AND HUMAN PNEUMOVIRUS (hMPV) ON NASOPHARYNGEAL SPECIMEN BY USING MUTIPLEX RT-PCR Nguyen Dai Thuc,Duong Ngoc Anh Trang, Nguyen Ngoc Tan, Nguyen Thu Ngoc * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 – No. 5 - 2019: 251 – 258 Background: Influenza A virus and human Metapneumovirus (hMPV) are two of the most common acute respiratory infections. Diseases caused by these two viruses have similar symptoms such as coughing, sneezing, prolonged high fever, fatigue, in most case, they do not cause serious illness but sometime ca cause death, such as influenza A/H5 virus. We carried out this project with the aim of building a concurrent diagnostic procedure for the two viruses mentioned in the same PCR reaction. Methods: Investigation of primers activity on RT-PCR reaction is a premise to build and optimize multiplex RT - PCR process to simultaneously detect influenza A virus and hMPV from patient's nasal throat swab. Experimental results on 14 samples from patients showed that 3 clinical specimens tested positive for influenza A virus and only one clinical specimen tested positive for hMPV, no co - infected specimens were found. *Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh **Đại học Nông Lâm ***Viện Pasteur TP.Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: ThS. Nguyễn Đại Thức ĐT: 0916347616 Email: nguyendaithuctb@gmail.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 5 * 2019 Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 252 Results: In order to determine the PCR conditions, the results showed that the optimal pairing temperature of the primer set was at 55°C; the optimal primers concentration of influenza A virus and hMPV were 0.48 µM and 0.56 µM, respectively. Specificity of the primer system was confirmed when the PCR results were positive for the RNA template of the two viruses while negative for the other viruses, which also causes respiratory illnesses with similar symptoms to the two target viruses, such as influenza B virus, Respiratory syncytial virus (RSV), Adeno virus, Rhino virus, Parainfluenza virus (PIV). The multiplex RT - PCR has high specificity and sensitivity at 0.002 pg/µl. Experimental results on 14 samples from patients showed that 3 clinical specimens tested positive for influenza A virus and only one clinical specimen tested positive for hMPV, no co - infected specimens were found. Conclusion: Successfully developed and optimized multiplex RT-PCR process for simultaneous detection of two circulating respiratory viruses. Keywords: influenza A virus, human metapneumovirus (hMPV) ĐẶT VẤN ĐỀ Virus cúm A và human Metapneumovirus (hMPV) là hai trong số các virus gây ra bệnh nhiễm trùng cấp tính đường hô hấp phổ biến nhất trên người(2,3). Virus cúm A dễ lây lan thành dịch nên sau khi thu mẫu từ bệnh nhân bị nghi ngờ nhiễm virus hô hấp, nếu cúm A dương tính sẽ không kiểm tra tiếp virus hMPV. Như vậy sẽ bỏ sót các trường hợp mẫu đồng nhiễm cả hai loại virus này. Mặc dù phương pháp qRT - PCR có khả năng phát hiện virus trong khoảng thời gian ngắn nhưng sinh phẩm hóa chất khá đắt tiền và khó khăn trong việc thiết kế phản ứng phát hiện đồng thời các virus trong cùng một phản ứng, dẫn đến việc âm tính giả một trong hai loại virus khi có sự đồng nhiễm. Từ những hạn chế trên “Phát hiện đồng thời virus cúm A và human Metapneumovirus (hMPV) trên mẫu bệnh phẩm người bằng kỹ thuật multiplex RT- PCR” được thực hiện nhằm xây dựng kỹ thuật multiplex RT-PCR trên nền tảng của kỹ thuật RT-PCR đơn để hỗ trợ công tác chẩn đoán và điều trị. Mục tiêu nghiên cứu Tối ưu quy trình multiplex RT-PCR phát hiện đồng thời virus cúm A và hMPV từ dịch phết họng-mũi bệnh nhân. ĐỐI TƯỢNG-PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Nghiên cứu cắt ngang với phương pháp chọn mẫu thuận tiện được thực hiện trên 14 mẫu dịch phết họng - mũi nghi ngờ nhiễm virus cúm A và hMPV do bệnh viện Nhi Đồng 1 và Bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới gửi đến. Sử dụng đối chứng dương của virus cúm A và hMPV và các mẫu đối chứng âm là các mẫu dương tính Adeno virus, virus cúm B, RSV, Rhino virus, PIV 1, 2, 3 do Trung tâm cúm Quốc gia cung cấp. Primer sử dụng có trình tự do Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) công bố và tổng hợp bởi công ty Intergrated DNA Technology (IDT)(5,7). Phương pháp nghiên cứu Tách chiết RNA Sử dụng kít QIAamp Viral RNA Mini của hãng QIAGEN - Mỹ. Thực hiện tách chiết mẫu dịch phết họng, mũi theo hướng dẫn đính kèm(5,6). Kiểm tra primer bằng phần mềm Sử dụng các phần mềm sinh tin học kiểm tra các thông số và đặc tính vật lý của các cặp primer sử dụng (Bảng 1, 2). Kiểm tra primer về mặt thực nghiệm: phản ứng RT-PCR đơn Thành phần phản ứng RT - PCR với tổng thể tích là 22,5 µl, trong đó: Nước không chứa RNase: 13,6 µl; RT - PCR Buffer 5X:5 µl; Primer F và primer R: 2,4 µl; dNTPs: 0,5 µl ; Enzyme: 1 µl và RNA mẫu: 2,5 µl(4). Điện di sản phẩm RT-PCR trên gel agarose 2% ở 150V- 50 phút, quan sát kết quả dưới tia UV trong máy chụp gel (UVP)(4,6). Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 5 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 253 Bảng 1. Trình tự primer phát hiện virus cúm A Tên primer Gen đích Trình tự Vị trí bắt cặp Sản phẩm PCR (bp) A/M30F M1, M2 5’ - TTC TAA CCG AGG TCG AAA CG - 3’ 18 - 37 232 bp A/M264R2 5’ - ACA AAG CGT CTA CGC TGC AG - 3’ 230 - 249 A/M30F: primer xuôi A/M264R2: primer ngược (WHO - SOP 2008) Bảng 2. Trình tự primer phát hiện hMPV Tên primer Gen đích Trình tự Vị trí bắt cặp Sản phẩm PCR (bp) MPV/M1a M 5’ - GGA GTC CTA CCT AGT AGA C - 3’ 3 - 21 537 bp MPV/M2 5’ - GCA GCT TCA ACA GTA GCT G - 3’ 521 - 539 MPV/M1a: primer xuôi MPV/M2: primer ngược (WHO - SOP 2008) Khảo sát hoạt động của các primer đơn Thực hiện phản ứng RT - PCR đơn nhằm kiểm tra sự hoạt động của các primer với RNA của hai mẫu đối chứng (+) đại diện cho hai cặp primer là virus cúm A và hMPV. Điện di sản phẩm RT – PCR. Khảo sát nhiệt độ bắt cặp của các primer đơn Bảng 3. Thí nghiệm về nhiệt độ bắt cặp trong phản ứng RT – PCR Giai đoạn Nhiệt độ (oC) Thời gian Chu kỳ Phản ứng phiên mã ngược 50 30 phút 1 Hoạt hóa phản ứng PCR 94 15 phút 1 Biến tính 94 30 giây 40 Bắt cặp 50, 53, 55, 57, 60 30 giây Kéo dài 72 1 phút Hậu kéo dài 72 10 phút 1 Khảo sát hoạt động của hệ primer Tiến hành phản ứng multiplex RT - PCR với mẫu RNA đối chứng dương (theo tỷ lệ 1:1). Điện di sản phẩm RT - PCR nhằm kiểm tra kích thước vạch sẵn. Khảo sát nồng độ hệ primer Khảo sát nồng độ từ 0,36 µM đến 0,56 µM. Thu sản phẩm RT - PCR, tiến hành điện di, phân tích kết quả chọn nồng độ các primer tối ưu cho cả quá trình. Khảo sát độ đặc hiệu của hệ primer Nhằm kiểm tra sự bắt cặp đặc hiệu của hệ primer khi khảo sát với các virus khác. Sử dụng các virus cúm B, Adeno virus, RSV, Rhino virus, PIV 1, 2, 3 như là đối chứng âm. Khảo sát giới hạn phát hiện của phản ứng multiplex RT - PCR phát hiện virus cúm A và hMPV Trộn lẫn RNA tổng số của virus cúm A và hMPV theo tỷ lệ 1:1, pha loãng thành các độ pha loãng cách nhau 10 lần, nồng độ RNA tổng số ban đầu 10-1. Ghi nhận nồng độ RNA thấp nhất mà cả hai loại virus vẫn cho kết quả dương tính. KẾT QUẢ Kiểm tra sự phù hợp của các primer trên phần mềm sinh tin học Kết quả khảo sát các điều kiện của phản ứng multiplex RT - PCR Kết quả khảo sát khả năng hoạt động của các primer đơn (Bảng 4). Sản phẩm RT - PCR đơn cho thấy ở cả hai giếng chứa RNA virus A và hMPV xuất hiện vạch kích thước như dự đoán, lần lượt là: 232 bp và 537 bp, không xuất hiện vạch sản phẩm phụ (Hình 1). Bảng 4. Các đặc tính của hệ primer Oligonucleotide % GC Tm (oC) ΔG Hairpin (kcal/mole) ΔG Seft Dimer (kcal/mole) ΔG Hetero - Dimer (kcal/ mole) A/ M30F A/ M264R2 MPV/M1a MPV/ M2 A/ M30F 50 54,5 -1,3 -6,76 - -4,95 -6,01 -3,52 A/ M264R2 55 58,1 -3,97 -10,24 -4,95 - -6,82 -9,83 MPV/ M1a 52,6 52,6 -1,04 -4,64 -6,01 -6,82 - -3,9 MPV/ M2 52,6 53,9 -2,98 -8,29 -3,52 -9,83 -3,9 - Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 5 * 2019 Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 254 Hình 1. Kết quả điện di RT - PCR đơn. (1)-(2) đối chứng âm của virus cúm A, hMPV; (3)-(4) RNA tách chiết từ virus cúm A,hMPV; (M) thang chuẩn 100 bp Kết quả khảo sát nhiệt độ bắt cặp của các primer đơn Khảo sát nhiệt độ bắt cặp cho từng cặp primer trên dãy nhiệt độ 50-60oC. Chọn được nhiệt độ 55oC cho vạch sản phẩm có cường độ sáng, rõ, không có vạch sản phẩm phụ ở cả hai loại virus (Hình 2). Kết quả khảo sát khả năng hoạt động của hệ primer Phản ứng multiplex RT - PCR sử dụng đồng thời hai cặp primer với mẫu RNA của hai loại virus trộn theo tỷ lệ 1:1. Kết quả điện di cho kích thước sản phẩm ở giếng chứa mẫu trộn lẫn virus cúm A và hMPV xuất hiên đồng thời 2 vạch sản phẩm và có kích thước tương tự mẫu RNA từng loại virus (Hình 3). Hình 2. Kết quả điện di khảo sát nhiệt độ bắt cặp của các primer. (M) thang chuẩn 100 bp;(-) đối chứng âm RT-PCR Hình 3. Kết quả điện di multiplex RT – PCR (1)-(2) đối chứng âm; (3)-(4) RNA tách chiết từ virus cúm A, hMPV; (5) multiplex RT-PCR; (M) thang chuẩn 100 bp. 1 2 3 4 M 537 bp 500 bp 232 bp 200 bp 1 2 3 4 5 M 537 bp 500 bp 232 bp 200 bp Virus cúm A hMPV M 50 53 55 57 60 50 53 55 57 60 (oC) 500 bp 537 bp 232 bp Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 5 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 255 Kết quả khảo sát nồng độ của hệ primer Bảng 5. Các giá trị nồng độ hệ primer (µM) Primer Nồng độ primer (µM) Virus cúm A 0,36 0,36 0,36 0,48 0,48 0,48 0,56 0,56 0,56 hMPV 0,36 0,48 0,56 0,36 0,48 0,56 0,36 0,48 0,56 Hình 4. Kết quả điện di khảo sát nồng độ primer Từ (1) đến (9) multiplex RT - PCR với hai nguồn RNA tách chiết từ hai virus cúm A và hMVP có nồng độ hệ primer thay đổi; (-): đối chứng âm multiplex RT - PCR; (M): thang chuẩn 100 bp Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của hệ primer Hình 5. Kết quả điện di khảo sát độ đặc hiệu. (1): multiplex RT - PCR với hai nguồn RNA virus cúm A và hMPV; (2) đối chứng âm của multiplex RT - PCR; (3)-(9) multiplex RT - PCR với các RNA các virus khác; (M): thang chuẩn 100 bp Kết quả khảo sát giới hạn phát hiện của phản ứng Hình 6. Kết quả điện di khảo sát giới hạn phát hiện của phản ứng theo nồng độ RNA giảm dần Các giếng chứa RNA tách chiết từ hai nguồn RNA từ virus cúm A và hMPV theo nồng độ mẫu giảm dần; (-) đối chứng; (M) thang chuẩn 100 bp M 1 2 3 4 5 6 7 8 537 bp 400 bp 232 bp 537 bp 232 bp 1 2 3 4 5 6 7 8 9 (-) M 500 bp 200 bp 11 10-1 10-2 10 -3 10-4 10-5 10 -6 10-7 10 -8 10-9 ( - ) 537 500 232 200 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 5 * 2019 Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 256 Pha loãng bậc 10 liên tiếp thành nhiều nồng độ khác nhau. Nồng độ đối chứng dương ban đầu là 10 -1 pha loãng 10 lần cho đến nồng độ cuối cùng là 10 -10 (Hình 6). Kết quả khảo sát trên các mẫu phết họng - mũi Kiểm tra trên 14 mẫu dịch phết họng-mũi, thu được kết quả: 3 mẫu dương tính với virus cúm A (chiếm 21,4%), 1 mẫu dương tính với hMPV (chiếm 7,14%) và chưa phát hiện mẫu đồng nhiễm (Hình 7). Kết quả phản ứng qRT - PCR trên mẫu phết họng-mũ Để khẳng định kết quả của phản ứng multiplex RT - PCR trên 14 mẫu phết họng- mũi, tiến hành thực hiện phản ứng qRT - PCR. Kết quả trình bày ở Hình 8 và Bảng 6 cho virus cúm A. Kết quả phản ứng chẩn đoán phát hiện virus cúm A và hMPV trên 14 mẫu phết họng-mũi này là chính xác và quy trình multiplex RT-PCR phát hiện đồng thời virus cúm A và hMPV đã được thiết kế và tối ưu thành công các điều kiện của phản ứng multiplex RT-PCR và các kết quả xét nghiệm là tin cậy. Hình 7. Kết quả điện di khảo sát các mẫu phết họng-mũi (-) đối chứng âm; (1)-(14) mẫu phết họng-mũi; (15) đối chứng dương; (M) thang chuẩn 100 bp Bảng 6. So sánh kết quả phản ứng multiplex RT - PCR và qRT - PCR Mẫu Virus cúm A hMPV Mutiplex RT – PCR (Ct) qRT - PCR Mutiplex RT – PCR (Ct) qRT - PCR Đối chứng âm - - - - Đối chứng dương 30,82 + 29,00 + 1 - - - - 2 - - - - 3 - - - - 4 - - - - 5 - - - - 6 29,67 + - - 7 - - - - 8 - - - - 9 - - - - 10 36,84 + - - 11 - - 31,45 + 12 - - - - 13 - - - - 14 33,57 + - - (-): âm tính; (+): dương tính 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 M 537 bp 500 bp 232 bp 200 bp Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 5 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 257 Hình 8. Đường khuếch đại tín hiệu huỳnh quang chẩn đoán virus cúm A và hMPV BÀN LUẬN Đánh giá khả năng hoạt động của hệ primer bằng phần mềm sinh tin học Cả hai cặp primer trên đều đạt yêu cầu về chiều dài. Nhiệt độ biến tính của hai cặp primer chênh lệch trong giới hạn cho phép, đảm bảo cho sự nhân bản của primer thành công trong cùng một điều kiện nhiệt độ. Thành phần % GC, đều nằm trong khoảng giới hạn cho phép. Sự hình thành cấu trúc thứ cấp, ∆G của các cấu trúc thứ cấp ở mức cho phép. Vì vậy, trên phương diện lý thuyết, hai cặp primer được sử dụng để phát hiện hai loài virus trên có thể nhân bản đúng trình tự đích và có độ đặc hiệu cao, tuy có tạo thành cấu trúc thứ cấp nhưng giá trị ∆G của các cấu trúc thứ cấp giữa các primer dao động không đáng kể. Do đó, hai cặp primer trên có thể trộn chung trong một phản ứng multiplex RT – PCR (Bảng 4). Đánh giá về mặt thực nghiệm Kết quả điện di khảo sát hoạt động các primer tạo sản phẩm RT-PCR: 232 bp ứng với virus cúm A và 537 bp ứng với hMPV, các vạch sản phẩm đều là duy nhất, không xuất hiện vạch sản phẩm phụ và tạo sản phẩm có kích thước tương tự khi trộn lẫn RNA tách chiết từ 2 nguồn virus (Hình 1, 3). Cả hai cặp primer đều có biên độ nhiệt hoạt động khá rộng. Tuy nhiên, ở nhiệt độ 55 o C cho vạch sản phẩm có cường độ sáng và rõ nhất; ở các nhiệt độ cao hơn, kết quả không có sự thay đổi. nhiệt độ bắt cặp tối ưu của hai cặp primer là 55 o C. Chọn được nồng độ primer virus cúm A và hMPV, lần lượt là 0,48 µM - 0,56 µM cho vạch sản phẩm đậm, rõ nét và không tạo sản phẩm phụ (Hình 4). Cặp primer trong nghiên cứu này có độ đặc hiệu cao: không cho vạch sản phẩm chứng tỏ hệ primer bắt cặp đặc hiệu, không cho kết quả dương tính với các loại virus khác (Hình 5). Pha loãng nồng độ RNA để xác định độ nhạy: Phản ứng multiplex RT – PCR cho vạch sản phẩm khi nồng độ RNA mẫu là 10-7. Đo hàm lượng mẫu RNA ở nồng độ 10-1 đạt 2 ng/µl. Như vậy ngưỡng phát hiện của phản ứng multiplex RT - PCR nàylà 0,002 pg/µl (Hình 6). KẾT LUẬN Các thông số và đặc tính vật lý của hệ primer Chứng dương virus cúm A Chứng dương hMPV Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 5 * 2019 Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 258 thỏa mãn các yêu cầu trên phương diện bằng phần mềm sinh tin học và hoạt động tốt khi khảo sát trên mẫu đối chứng dương. Xây dựng được quy trình multiplex RT- PCR phát hiện đồng thời hai loại virus hiện đang lưu hành, ngưỡng phát hiện của phản ứng là 0,002 pg/µl. Trên 14 dịch phết họng mũi lâm sàng, đã phát hiện 3/14 mẫu dương tính với virus cúm A (chiếm 21,4%), 1/14 mẫu dương tính với hMPV (chiếm 7,14%) và chưa phát hiện mẫu đồng nhiễm với hai loại virus nói trên. Các mẫu dương tính ở phản ứng này được kiểm tra bằng kỹ thuật qRT - PCR và cho thấy 100% kết quả là phù hợp. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bellau-Pujol S, Vabret A, Legrand L, et al (2005). Development of three multiplex RT-PCR assays for the detection of 12 respiratory RNA viruses. J Virol Methods, 126(1-2):53-63. 2. Bouvier NM and Palese P (2008). The Biology of Influenza Viruses. Vaccine, 26(4):D49 - D53. 3. Đặng Đức Anh, Phan Thị Ngà và Vũ Thị Quế Hương (2010). Virus y học. Nhà xuất bản Y Học Hà Nội, pp.28 - 45. 4. Lê Duy Thành (2009). Cơ sở sinh học phân tử. Nhà xuất bản Giáo dục TP. Hồ Chí Minh, pp.134 - 153. 5. QIAGEN (2010). QIAamp Viral RNA Mini Handbook, 3 rd edition. URL: HB-0354- 004_1112868_HB_QA_Viral_RNA_Mini_0318_WW.PDF. 6. QIAGEN (2010). QIAGEN Onestep RT-PCR Kit Handbook. URL: HB-0660-002%201101184_LL_RT- PCR_OneStep_RTPCR_0316_WW_WEB.pdf. 7. WHO (2017). Influenza. URL: https://www.who.int/influenza/. Ngày nhận bài báo: 30/07/2019 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 30/08/2019 Ngày bài báo được đăng: 10/10/2019