Phản ứng PCR phát hiện vi khuẩn lao trên một số đối tượng khác nhau

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 9 * Phụ bản của Số 1 * 2005 Nghiên cứu Y học PHẢN ỨNG PCR PHÁT HIỆN VI KHUẨN LAO TRÊN MỘT SỐ ĐỐI TƯỢNG KHÁC NHAU Mai Nguyệt Thu Hồng*, Cao Minh Nga**, Huỳnh Thanh Bình*** TÓM TẮT Nhằm ứng dụng kỹ thuật khuếch đại chuỗi gen (PCR) để phát hiện vi khuẩn lao trên một số đối tượng khác nhau, chúng tôi đã khảo sát 83 mẫu đàm được thu thập tại một số cơ sở y tế ở TP. HCM từ tháng 01/2001 đến tháng 10/2003. Nhóm chứng là 32 mẫu đàm thu được từ người đến tiêm phòng bệnh lao tại Viện Pasteur TP. HCM. Kết quả khảo sát cho thấy 100% (21/21) bệnh nhân lao cho kết quả PCR dương tính, trong khi chỉ có 90,47% (19/21) mẫu cho kết quả nuôi cấy dương tính. Ở nhóm nghi ngờ mắc bệnh lao 19,39% (8/46) mẫu bệnh phẩm có kết quả PCR dương tính, nhóm có tiếp xúc bệnh lao thì 15,35% (4/26) mẫu cho kết quả PCR dương tính và ở nhóm chứng là 6,25% (2/32). Ở tất cả các nhóm này, kết quả nuôi cấy đều âm tính. Kết quả trên cho thấy thử nghiệm PCR nhạy hơn phương pháp nuôi cấy để phát hiện vi khuẩn lao trong mẫu bệnh phẩm. SUMMARY DETECTION OF MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS ON DIFFERENT SUBJECTS BY PCR Mai Nguyet Thu Hong, Cao Minh Nga, Huynh Thanh Binh * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 9 * Supplement of No 1 * 2005: 68 – 72 The PCR test has been developed for detection of M. tuberculosis on different subjects. In order to apply this technique, we studied 93 sputum‘sample of the patients and tuberculosis contact group in the Health Centers in Ho Chi Minh city from 1/2001 to 10/2003. The control group is the BCG vaccination group in Pasteur Institute in HCM city. The result showed that 100% (21/21) tuberculosis patients had the positive PCR test but only 90.47% (19/21) positive samples for the culture medium. We also detected 17.39% (8/46) positive samples in high risk group, 15.35% (4/26) in tuberculosis contact group in applying the PCR test for detection the M. tuberculosis. And the ratio of positive samples of control group is 6.25% (2/32). In all these groups, the culture medium gave the negative result. This result demonstrated that the PCR test is more sensitive than the culture technique for detection of Mycobacterium tuberculosis. ĐẶT VẤN ĐỀ Lao là một trong những bệnh truyền nhiễm có tỉ lệ mắc và tử vong đứng hàng đầu trên thế giới. Hơn 1/3 dân số thế giới nhiễm lao với 8,4 triệu ca mắc mới và 1,9 triệu ca tử vong hàng năm. 95% ca mắc và 98% ca tử vong đều xảy ra ở các nước chậm phát triển. Sự bùng phát bệnh lao ngày càng gia tăng cùng với sự xuất hiện đại dịch HIV. Các thống kê cho thấy 1/3 số bệnh nhân AIDS tử vong đều là những ca đồng nhiễm bệnh lao. * Viện Pasteur TP. HCM ** Bộ môn Vi sinh – Khoa Y – Đại Học Y Dược TP. HCM *** Bộ môn Miễn dịch-Sinh lý bệnh – Khoa Y – Đại Học Y Dược TP. HCM Chuyên đề Y Học cơ sở 68 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 9 * Phụ bản của Số 1 * 2005 Là bệnh có khả năng lây lan cao, nhưng việc phát hiện và điều trị bệnh lại đòi hỏi thời gian dài. Phương pháp chẩn đoán chính xác được áp dụng là nuôi cấy vi khuẩn cần phải sau 2 tháng mới có thể xác định bệnh. Phương pháp nhuộm soi vi khuẩn có thể phát hiện bệnh rất sớm, nhưng chỉ chẩn đoán được các trường hợp bệnh phẩm có chứa nhiều vi khuẩn và dễ bỏ sót các ca bệnh. Vì vậy, nhiều phương pháp chẩn đoán nhanh vi khuẩn lao được ứng dụng như nuôi cấy bệnh phẩm trên môi trường lỏng, xác định vi khuẩn bằng phương pháp phát hiện đoạn gen đặc hiệu, nhưng chưa phải là tiêu chuẩn vàng để xác định các trường hợp dương tính. Do đó, cần có thêm các nghiên cứu thực nghiệm để làm cơ sở xác định độ nhạy, độ đặc hiệu và các giá trị tiên đoán của các phương pháp này ở các đối tượng nghiên cứu khác nhau. Để góp phần vào các nghiên cứu thực nghiệm này, đề tài sẽ khảo sát tỉ lệ phát hiện vi khuẩn lao bằng phương pháp phát hiện đoạn gen đặc hiệu IS6110 trên mẫu bệnh phẩm đàm ở các đối tượng khác nhau. Từ đó so sánh tỉ lệ phát hiện vi khuẩn bằng phương pháp nuôi cấy cổ điển (được đánh giá là tiêu chuẩn vàng) và chẩn đoán hình ảnh X Quang phim phổi. Khảo sát sẽ xác định được độ đặc hiệu, độ nhạy cảm và giá trị tiên đoán của thử nghiệm phát hiện chuỗi gen trên các đối tượng nghiên cứu và góp thêm cơ sở dữ liệu cho các nhà lâm sàng ứng dụng phương pháp chẩn đoán này. MỤC TIÊU Đề tài "Phản ứng khuếch đại chuỗi gen (PCR) để phát hiện vi khuẩn lao trên một số đối tượng khác nhau” nhằm các mục đích sau đây: -Xác định tình trạng nhiễm vi khuẩn M. tuberculosis trong mẫu đàm bằng phương pháp PCR, phương pháp nuôi cấy và chẩn đoán hình ảnh ở bệnh nhân lao, nhóm nghi ngờ mắc bệnh lao, người tiếp xúc bệnh nhân lao và người lành (không có phản ứng lao tố và được tiêm phòng bệnh lao). -Xác định độ tin cậy, độ đặc hiện và các giá trị tiên đoán của phương pháp PCR ở bệnh nhân lao, nhóm nghi ngờ mắc bệnh lao, người tiếp xúc bệnh nhân lao và người lành (không có phản ứng lao tố và được tiêm phòng bệnh lao). ĐỐI TƯỢNG-PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Mẫu nghiên cứu Gồm 125 cá thể thuộc các nhóm đối tượng sau: -Bệnh nhân lao được xác định tại bệnh viện Phạm Ngọc Thạch (n=21) -Nhóm nghi ngờ mắc bệnh lao: có biểu hiện lâm sàng sốt, ho dai dẳng, có tiền sử tiếp xúc với bệnh nhân lao, phản ứng lao tố trên 15mm (n=46). -Nhóm tiếp xúc thường xuyên với bệnh nhân lao (n=26). -Nhóm chứng: có phản ứng lao tố âm tính và được tiêm phòng vắcxin phòng bệnh lao (n=32). Phương pháp nghiên cứu Đây là nghiên cứu mô tả cắt ngang. Chúng tôi tiến hành lấy mẫu đàm vào lúc sáng sớm. Bệnh nhân được kích thích ho và khạc đàm để xét nghiêm. Mẫu đàm được chứa trong lọ vô trùng và được chuyển đến phòng thí nghiệm trong vòng 4 giờ. Mẫu đàm được bảo quản ở –20oC trước khi tiến hành thí nghiệm. Xử lý bệnh phẩm(1,6) - Tách chất nhày, huyết tương trong bệnh phẩm đàm bằng proteinase K. - Ủ cách thủy 600C qua đêm. Chẩn đoán lâm sàng Bệnh nhân được nghi ngờ có biểu hiện lâm sàng của bệnh lao nếu có các triệu chứng sau (tiêu chuẩn chẩn đoán lâm sàng của chương trình chống lao quốc gia): -Sốt trên 38oC và kéo dài trên 3 tuần -Ho dai dẳng trên 2 tháng -Phản ứng lao tố trên 15mm -Tốc độ lắng máu sau 2 giờ trên 100mm Vi Sinh 69 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 9 * Phụ bản của Số 1 * 2005 Nghiên cứu Y học Hình ảnh X Quang Phim phổi có tổn thương dạng lao phổi đang tiến triển (kết luận của khoa X Quang tại bệnh viện Lao và bệnh phổi Phạm Ngọc Thạch) Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường Lowenstein Jensen (theo phương pháp chẩn đoán của chương trình chống lao quốc gia) Phương pháp PCR(1, 6) đoạn gen đặc hiệu IS6110 - Ly trích DNA của tế bào M. tuberculosis bằng phương pháp Boom. - Thử nghiệm PCR được thực hiện với PCR mix có các đoạn mồi (primers) là Pt18 và INS2 đặc hiệu cho M. tuberculosis. Sử dụng các sinh phẩm của hãng AB gene, tự pha chế PCR mix tại Phòng Y Sinh học Đại học Y Dược TP. HCM. - Phản ứng PCR được thực hiện trên máy luân nhiệt (thermal cycler) của hãng Bio-Rad, theo chương trình đã cài đặt gồm các bước sau: Chu kỳ 1: (x1) Bước 1: 400C; x: 10 phút Chu kỳ 2: (x40) Bước 1: 940C; x: 1 phút 30 giây Bước 2: 650C; x: 2 phút Bước 3: 720C; x: 3 phút Chu kỳ 3: (x1) Bước 1: 720C; x: 60 phút Đọc kết quả Bằng cách xác định sản phẩm PCR qua điện di trên thạch agarose 1,5% có ethidium bromide. Dùng phần mềm Excel để xử lý số liệu. KẾT QUẢ Đặc tính của mẫu nghiên cứu Trong 125 bệnh nhân nghiên cứu có 54 nam (43,2%) và 71 nữ (56,8%). Thuộc lứa tuổi từ 5 đến 74 (bảng 1). Bảng 1. Đặc tính của mẫu nghiên cứu (n=125) Đặc tính mẫu Số ca Tỉ lệ (%) Nam 54 43,2 Giới Nữ 71 56,8 5 – 10 16 12,8 11 – 20 16 12,8 21 – 30 22 17,6 31 – 40 20 16,0 41 – 5 0 23 18,4 51 – 60 14 11,2 61 – 70 8 6,4 Tuổi 71 – 80 6 4,8 Chẩn đoán lâm sàng Bảng 2. Chẩn đoán lâm sàng có triệu chứng lao phổi đang tiến triển. Nhóm đối tượng Số ca khảo sát Số ca chẩn đoán lâm sàng dương tính Tỉ lệ (%) Bệnh nhân lao 21 21 100 Nghi ngờ mắc bệnh lao 46 46 100 Tiếp xúc bệnh nhân lao 26 0 0 Nhóm chứng 32 0 0 Tổng cộng 125 Chẩn đoán X quang phổi có hình ảnh lao phổi đang tiến triển Bảng 3. Chẩn đoán X quang có hình ảnh lao phổi đang tiến triển. Nhóm đối tượng Số ca khảo sát Số ca chẩn đoán X quang dương tính Tỉ lệ (%) Bệnh nhân lao 21 21 100 Nghi ngờ mắc bệnh lao 46 0 0 Tiếp xúc Bệnh nhân lao 26 0 0 Nhóm chứng 32 0 0 Tổng cộng 125 Chuyên đề Y Học cơ sở 70 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 9 * Phụ bản của Số 1 * 2005 Chẩn đoán nuôi cấy vi khuẩn lao trên môi trường Lowenstein Jensen Bảng 4. Chẩn đoán nuôi cấy vi khuẩn lao trên môi trường Lowenstein Jensen Nhóm đối tượng Số ca khảo sát Số ca nuôi cấy vi khuẩn dương tính Tỉ lệ (%) Bệnh nhân lao 21 19 90,47 Nghi ngờ mắc bệnh lao 46 0 0 Tiếp xúc bệnh nhân lao 26 0 0 Nhóm chứng 32 0 0 Tổng cộng 125 Chẩn đoán phát hiện đoạn gen IS6110 Bảng 5. Chẩn đoán phát hiện đoạn gen IS6110 Nhóm đối tượng Số ca khảo sát Số ca phát hiện đoạn gen IS6110 Tỉ lệ (%) Bệnh nhân lao 21 21 100 Nghi ngờ mắc bệnh lao 46 8 17,39 Tiếp xúc bệnh nhân lao 26 4 15,35 Nhóm chứng 32 2 6,25 Tổng cộng 126 Phân tích kết quả phát hiện chuỗi gen Bảng 6. Chẩn đoán phát hiện đoạn gen IS6110 Nhóm bệnh lao Nhóm không mắc lao Tổng số PCR dương tính 21 14 35 PCR âm tính 0 90 90 Tổng số 21 104 135 Từ kết quả trên, cho thấy: -Độ nhạy của phản ứng phát hiện chuỗi gen là 100% -Độ đặc hiệu của phản ứng phát hiện chuỗi gen là 86,35% -Giá trị tiên đoán dương của phản ứng phát hiện chuỗi gen là 60% -Giá trị tiên đoán âm của phản ứng phát hiện chuỗi gen 100% BÀN LUẬN Ứng dụng các kỹ thuật mới để phát hiện nhanh vi khuẩn lao rất cần thiết trong chiến lược phòng ngừa sự lây nhiễm vi khuẩn lao và điều trị kịp thời bệnh lao. Thực vậy, do khả năng lây lan nhanh qua đường hô hấp, khả năng ký sinh nội tế bào của vi khuẩn và tính đề kháng đa kháng sinh nên điều trị bệnh lao đòi hỏi rất nhiều thời gian, nhưng vẫn có tỉ lệ thất bại trong điều trị. Vì vậy, việc tìm các phương pháp chẩn đoán nhanh bệnh lao rất có giá trị góp phần giảm tỉ lệ mắc và tử vong do bệnh lao, nhất là trong tình hình đại dịch HIV hiện nay. Kết quả khảo sát vi khuẩn lao trong 125 mẫu đàm bằng phản ứng khuếch đại chuỗi gencho thấy: -Độ nhạy của phản ứng: 100% -Độ đặc hiệu: 86,35% -Giá trị tiên đoán dương: 60% -Giá trị tiên đoán âm: 100% Căn cứ kết quả trên cho thấy 21/21 (100%) trường hợp bệnh lao đều được phát hiện bằng phản ứng PCR. Tuy nhiên, độ đặc hiệu của phản ứng chưa cao. Đối với các trường hợp không bị bệnh lao, có 14/125 trường hợp cho kết quả dương tính giả. Điều này giống với kết quả nghiên cứu của một số tác giả khác(1, 5, 6) và có thể giải thích như sau: -8 trường hợp có triệu chứng lâm sàng nghi ngờ bệnh lao, nhưng không phát hiện trên hình ảnh X Quang, 4 trường hợp có tiếp xúc với bệnh nhân lao và 2 trường hợp thuộc nhóm chứng. Chúng tôi nhận thấy ngoài 2 đối tượng thuộc nhóm chứng, các trường hợp còn lại đều thuộc nhóm nguy cơ cao và rất dễ có khả năng phát bệnh. Vì vậy, PCR dương tính với vi khuẩn lao là một dấu hiệu để giúp nhà lâm sàng và dịch tễ quan tâm nhiều hơn đến các đối tượng này khi đề nghị các chiến lược điều trị và phòng chống bệnh. -2 trường hợp dương tính thuộc nhóm chứng có thể do bệnh nhân có tiếp xúc với người bệnh nhưng Vi Sinh 71 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 9 * Phụ bản của Số 1 * 2005 Nghiên cứu Y học hoàn toàn không biết. -Cỡ mẫu nghiên cứu chưa đại diện và chưa đủ để cho kết quả chính xác. Số lượng mẫu ở từng nhóm đối tượng chưa phù hợp. Vì vậy, cần thực hiện thêm một nghiên cứu tiếp theo dựa trên cơ sở của nghiên cứu ban đầu này, để có được các số liệu đầy đủ và chính xác nhất Giá trị tiên đoán âm 100%, nên tất cả trường hợp PCR âm tính đều cho kết quả khẳng định là không nhiễm vi khuẩn lao Giá trị tiên đoán dương chỉ có 60%, nên phản ứng PCR dương tính chưa thể chắc chắn là bệnh nhân bị lao. Tuy nhiên, từ kết quả nghiên cứu này cũng khẳng định được bệnh nhân thuộc nhóm nguy cơ cao, cần phải theo dõi. KẾT LUẬN Qua nghiên cứu “PCR phát hiện vi khuẩn lao trên một số đối tượng khác nhau”, chúng tôi có những kết luận sau đây: -Độ nhạy của phản ứng: 100% -Độ đặc hiệu: 86,35% -Giá trị tiên đoán dương: 60% -Giá trị tiên đoán âm: 100% Tuy độ đặc hiệu chưa cao, nhưng nhóm có phản ứng PCR dương tính cũng thuộc nhóm có nguy cơ cao, cần có kế hoạch chăm sóc sức khỏe. Từ công trình nghiên cứu này, chúng tôi có một số đề xuất như sau: -Trên cơ sở nghiên cứu thăm dò này, nên tiến hành với cỡ mẫu đầy đủ hơn để thu được kết quả chính xác nhất. -Quan tâm đặc biệt đến đối tượng có phản ứng PCR dương tính vì là nhóm có nguy cơ cao, dễ phát bệnh. -Phổ biến kỹ thuật chẩn đoán đến các phòng thí nghiệm vi sinh để giúp nhà lâm sàng có định hướng sớm trong chẩn đoán và điều trị. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1 Thierry D, Chureau C, Aznar C, Luc Guesdon J (1992). The detection of M. tuberculosis in uncultured clinical specimens using the polymerase chain reaction and a non-radioactive DNA probe. 2 Kaplan JE. et al (1998). Opportunistic Infections in Immunodeficient Populations. Emerging Infectious Disease 4 (3): 421-422. Centers for Disease Control. 3 Kolk A.H.J., Kox L.F.F., Van Leeuwen J. and Kuijper (1996). PCR assay for Mycobacterium tuberculosis complex and other Mycobacteria. Department of Biomedical Research, Royal Tropical Institute. Amsterdam. The Netherlands. 4 Memish ZA, Mah MW, Mahmooh SA et al (2000). Clinico – diagnostic experience with tuberculosis lymphadenitis in Saudi Arabia. Clin Microbiol Infect 2000 Mar; 63: 137-41. 5 Vivan J., Alden MJ., Curry JI., Keichii K., Knott CA, Roger L., Wolfe JM., Moore DF. (1993). Detection and identification of M. tuberculosis directly from sputum sediments by amplification of rRNA 6 Nguyễn Ngọc Lan (2001). Nghiên cứu áp dụng kỹ thuật phản ứng chuỗi polymerase (polymerase chain reaction) trong chẩn đoán lao. Luận án Tiến sĩ Y học. TP. Hồ Chí Minh. Chuyên đề Y Học cơ sở 72