Phản ứng chuỗi polymerase(pcr)

A-PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE(PCR): ĐẠI CƯƠNG: Việc triển khai các ứng dụng của sinh học phân tử thường vấp phải trở ngại về số lượng vật chất di truyền .Các phương pháp tạo dòng in vivo tuy giải quyết được vấn đề về số lượng nhưng đòi hỏi thao tác phức tạp và thời gian dài .Sự ra đời của nhiều phương pháp khuếch đại in vitro có chọn lọc,trong đó nổi tiếng nhất phải kể đến phương pháp PCR,đã đảo lộn nguyên tắc của việc tạo dòng cổ điển ,mở ra những triển vọng ứng dụng to lớn . Bằng cách sử dụng enzyme DNA polymerase và Oligonucleotid tổng hợp nhân tạo các mồi primer, một đoạn DNA bất kỳ có thể được nhân lên nhanh chóng hàng tỷ lần mà không cần đưa vào tế bào vi khuẩn. Đó là kết quả tuyệt vời của PCR. PCR (Polymerase Chain Reaction): phản ứng dây chuyền tổng hợp nhờ polymerase do Karry Mullis và các cộng sự phát minh vào năm 1985. Từ một vi khuẩn có tính chịu nhiệt Thermus Aquaticus (được tìm thấy tại YelloustonePark), sống ở vùng nước nóng, người ta đã phân lập được Taq polymerase cho phép ta khuếch đại một đoạn DNA ở một vùng bất kì trong hệ gen khi trình tự hai đầu đoạn DNA đã biết có tính lập đi lập lại và số lượng tăng lên theo hàm số mũ. Dựa vào trình tự Nu ở hai đầu đoạn, các cặp oligonucleotic được tổng hợp nhân tạo, mỗi oligo tạo liên kết bổ sung với từng sọi đơn.Chúng được sử dụng làm mồi để tổng hợp in vitro nhờ enzyme DNA polymerase. Như vậy, PCR là kỹ thuật xử lý in vitro các chuỗi mã hoá di truyền DNA bằng cách phát triển một cách đồng loạt trên các dây đơn DNA. Toàn bộ tiến trình được hoàn thiện do sự biến chất của DNA cần thiết, sự tác động của primer tại đầu các dây đơn DNA này. Kế đến là sự phát triển của các primer nhờ DNA polymerase. Thông qua phương pháp PCR hàng triệu đoạn DNA đồng nhất có thể được thu thập một cách dễ dàng từ một hỗn hợp các phân tử bao gồm: RNA, protein, polysaccharide, DNA không có chức năng và DNA có chức năng di truyền. Đây là công cụ khá mới của sinh học phân tử, đánh dấu một bước tiến cực kì quan trọng và hiện đang được sử dụng rộng rãi nhất trong thực tiễn cũng như trong nghiên cứu. Vì sao phải dùng kĩ thuật PCR ? Kiểm tra nhanh Áp dụng cho cả nguyên liệu và kiểm soát quá trình Trong số các phương pháp kiểm tra nhanh thì PCR là phương pháp đáp ứng cao các chỉ tiêu quan trọng : Thời gian cho kết quả Độ nhạy Độ đặc hiệu Ngay cả giá thành Đơn giản II.NGUYÊN TẮC CỦA PHƯƠNG PHÁP PCR PCR là kỹ thuật xử lý in vitro các chuỗi mã hoá di truyền DNA, dựa trên cơ sở phản ứng sinh tổng hợp DNA theo 3 trình tự sau: Biến thành dây đơn (denature) Phản ứng của primer gắn vào đầu dây chuỗi mã đối xứng với chuỗi mã trên dây template (gọi là tiến trình annealing) để có phân tử DNA mới. Kéo dài dây mới nhờ primer (extension) Những phản ứng này được thực hiện nhờ polymerase như Taq polymerase và sự thay đổi chu kỳ nhiệt một cách hợp lý, đặc biệt là nhiệt độ cho denature và nhiệt độ cho annealing 1.DNA polymerase: DNA polymerase là một enzyme có chức năng tổng hợp các dây đơn DNA. trong điều kiện cho phép nào đó, tiến trình tổng hợp DNA này có thể được sao chép in vitro Polymerase được phân lập từThermus aquaticus có khả năng là vật thể ổn định về nhiệt độ, đó là Taq polymerase với hai thuận lợi chính: Hồi phục sau khi phục hồi nhiệt không cần kéo dài. Enzyme này hoạt động ở nhiệt độ cao, lúc đó việc tác động của các primer ở đầu dây đơn và sinh tổng hợp DNA sẽ nhanh hơn Cần chú ý Polymerase được sử dụng là những enzyme sống, nhạy cảm về nhiệt độ, phải được thêm vào trong mỗi chu kỳ. Phải có một quy trình hướng dẫn cụ thể trong khi thực hiện từng giai đoạn của chu kỳ PCR. =Phản ứng chuỗi polymerase(PCR) với 3 kỹ thuật:PCR chuẩn,PCR neo,PCRđảo PCR chuẩn: DNA mục tiêu mở dây đôi,sau đó 2 primer tác động ở hai đầu dây đơn,rồi DNA mới tổng hợp nhờ Taq với 4 deoxiribonucleotide PCR neo:chỉ cần một primer,một đuôi dG nhân tạo được gắn vào đầu 3’ của DNA mục tiêu,DNA được khuếch đại nhiều lần nhờ một primer có chuỗi mã đã biết trước,và một primer thứ hai có oligo dC PCR đảo, người ta dùng nó để khuếch đại đoạn phân tử kế cận chuỗi mã DNA đã biết trước,phân tử DNA này được phân cắt và nối lại bởi enzyme để tạo thành một vòng tròn có tính chất monomer, sau đó DNA được khuếch đại nhờ một primer tương đồng với đầu của chuỗi mã đựơc biết trước 2.Thiết kế chu kỳ với nhiệt độ tương thích Nhiệt độ sử dụng trong phản ứng PCR phải được xác định chính xác. Mỗi chu kỳ của PCR có ba nhiẽt độ cần được xác định như sau: =Thời kỳ biến tính DNA, tách dây đôi thành dây đơn, nhiệt độ được thiết kế là 940C, với nhiệt độ này DNA sẽ tạo ra sợi đơn DNA, hoạt động như dây nền (template) cho quá trình tổng hợp DNA mới. = Thời kỳ lai giữa primer và DNA (annealing), nhiệt độ thay đổi 50-600C. Nhiệt độ này tuỳ thuộc vào loại marker mà chúng ta đang sử dụng, với chiều dài cụ thể của oligonucleotide. Chúng ta phải thử từng bước để biết chắc nhiệt độ cần được thiết kế là bao nhiêu. = Thời kỳ kéo dài dây DNA mới được tổng hợp nhờ Taq polymerase (extension),nhiệt độ được thiết kế là 720C. Giai đoạn annealing là quan trọng nhất, bởi vì trong giai đoạn này, sự kiện sự lai DNA-DNA xảy ra. Nếu nhiệt độ quá cao, không lai được DNA; nếu nhiệt độ quá thấp, việc lai DNA sẽ bị nhiều lỗi. Chính vì thế để thiết lập nhiệt độ cho chu kỳ PCR, người ta xác định nhiệt độ nóng chảy Tm với từng nhóm primer riêng biệt. 3.Chu kỳ khuếch đại a Số chu kỳ Thường dùng là 30 chu kỳ cho quá trình khuếch đại PCR. Nếu thêm nhiều chu kỳ thì phản ứng rất chậm và năng suất thu hoạch cho các băng không cao. Nhìn chung số chu kỳ tuỳ thuộc vào phương pháp và đối tượng sử dụng. b.Nhiệt độ cho thời kỳ lai với primer (annealing): tuỳ thuộc vào primer mà chúng ta điều chỉnh nhiệt độ (56-600C) c.Taq polymerase: Taq polymerase có thể 2-4Kb (trên phút), tức 35-70 base trong một giờ. Vì thế 1 Kb,1 phút nhiệt độ 720C sẽ thành công cho quá trình khuếch đại. d.Chú ý với 20 mer với thành phần GC trên 60% thì phải tính toán nhiệt độ trong quá trình sắp xếp polymer. 4. DNA mục tiêu Người ta cần phải có các đoạn DNA mang mật mã đã biết trước ”DNA mục tiêu”. Trong kĩ thuật PCR, người ta sẽ nhận được những kết quả tốt nhất, nếu DNA thật sự thuần khiết. DNA của thực vật thường được ly trích từ mô lá. Số lượng DNA cần cho phản ứng không nhiều lắm, chỉ cần từ 5-10ng DNA thuần khiết, đủ dể cho kết quả theo mong muốn. Người ta cần có ethanol trong lần cuối của qui trình chuẩn bị DNA. Với 10% ethanol, nó vẫn chưa có thể gây ảnh hưởng đến hoạt động của Taq polimerase. Điều ghi nhận quan trọng là: phải có một mM EDTA trong chất đệm TE, trong khi sử dụng để hoà tan DNA.EDTA sẽ gắn với Mg++, để thể tích của DNA mục tiêu không vượt quá 1/15 của thể tích PCR 5.Primer và DNA Trong PCR tiêu chuẩn, người ta cần có một căp mồi. Sự khuếch đại chuyên biệt nào đối với một đoạn DNA cần nghiên cứu, đều phải tuỳ thuộc vào các cặp mồi tương xứng.C ả hai yếu tố: chiều dài primer và thành phần C-G đều có ảnh hưởng quan trọng đối với nhiệt độ trong quá trình tác động ở đầu dây đơn. Nhiệt độ này là: 2x (A+T)+4x (G+C) +5oC. Nếu có 50%G+C, thì chiều dài của primer phải có kích thước tương ứng là 18-20 Nu. Người ta mua các nucleotide ở các công ty hoá chất, có chất lượng tốt, nếu có được bảo quản ở dạng bột đông khô (freeze-dried powder). Sau đó nguời ta phải điểu chỉnh lại độ pH truớc khi sử dụng. III KỸ THUẬT PCR Một qui trình PCR cần thiết để khuếch đại một số lượng lớn chuỗi DNA chuyên biệt gồm 3 giai đoạn, mỗi giai đoạn có 3 bước nhảy liên tiếp. 1.Biến tính (denaturation): Bước đầu tiên trong hệ thống khuếch đại PCR là sự biến tính do nhiệt của DNA khuôn mẫu do sự tăng nhiệt độ trong ống nghiệm đến 95oC. Thêm vào đó, trong ống nghiệm phải chứa một số lượng lớn hai oligonucleotide mồi, một DNA polymerase chịu nhiệt (e.g. Taq DNA polymerase chịu nhiệt được tách biệt từ vi khuẩn Thermus aqaticus), và bốn loại deoxyribonucleotide. Nhiệt độ là nhu cầu tối thiểu trong giai đoạn này. 2.Hồi tính (annealing): Đối với bước thứ hai này, nhiệt độ của hỗn hợp giảm từ từ xuống 550C. Trong suốt giai đoạn này, những base mồi sẽ bắt cặp với mạch gốc theo nguyên tắc bổ sung. 3.Kéo dài (extension) Nhiệt độ tăng đến 75oC, ở nhiệt độ này thuận lợi cho chức năng xúc tác của Taq DNA polymerase. DNA được kích thích tổng hợp theo chiều 3’-OH. =Đối với một qui trình chuẩn thì chu kỳ 25-35 phải thực hiên trong điều kiện: “Denature” 94-960C 15 giây (hoặc lâu hơn) “annealing” 550C(50-560C) 30giây “extention” 720C 1,5 phút Chu kỳ được kết thúc bằng một “extension”ở 720C trong 1,5 phút. Sau đó người ta cho dừng hẳn bằng cách tồn trữ sản phẩm PCR ở 40C. Phức tạp nhất là nhiệt độ trong giai đoạn “annealing”. Chúng ta phải điều chỉnh để có khuếch đại tốt nhất và ghi nhận được đa hình tốt nhất khi điện di trên gel. Tóm lại trong qui trình chuẩn này, chúng ta cần tuân thủ các qui định sau: Phuơng tiện và hóa chất: Máy Thermal cycler (PE 9600 Perkin-Elmer) Mẩu DNA ly trích 100ng/µl Dung dịch stock của dNTP(mỗi dNTP là 5 mM) Taq polymerase (5U/µl Perkin-Elmer) Dung dịch stock của 10xPCR buffer (buffer cuả Perkin-Elmercó 15mM MgCl2, 500mM kCl. 100mM Tris-HCl, pH 8,4, 0,1% gelatin,1% Triston X- 100 Primer Fvà R:10µM Chuẩn bị 25µl dung dịch có thuật ngữ là “cocktail” bao gồm DNA 1µl 10xdung dịch buffer 2,5µ Mỗi primer 1µl Dung dịch stock dNTP 1µl Taq polymerase 0,1µl Thêm nước cất hai lần, sao cho đủ 25µl Chu kỳ nhiệt trong thermal cycler thí dụ tìm đa hình của Sacl, clon BS3, 4kb trong nguời) 940C trong 5 phút, theo sau là 30 chu kỳ 94 0C trong 30 giây 60 0Ctrong 30 giây 72 0C trong 1 phút Giữ mẫu trong 40C Hạn chế: 1. Kích thước của trình tự cần khuếch đại là giới hạn đầu tiên: PCR cho kết quả tốt với những đoạn DNA có độ dài nhỏ hơn 1,5 Kb. Trong vài trường hợp PCR không hoạt động với những đoạn lớn hơn 3Kb. Với những độ dài lớn hơn điều kiện tối ưu cho phản ứng phải được xác định qua thực nghiệm. 2. Mức độ ngoại nhiễm cao: nguồn ngoại nhiễm lớn nhất là các sản phẩm khuếch đại của những lần thao tác trước: việc mở nắp các ống nghiệm sau mỗi lần khuếch đại trong khoảng không gian kín như phòng thí nghiệm khiến các phân tử đã được khuếch đại thoát ra khỏi ống nghiệm bay lơ lửng trong không khí sẽ bám vào tường, dụng cụ, thiết bị. ..dễ dàng nhiễm vào phản ứng tiến hành sau đó. Biện pháp khắc phục: - Các công đoạn thao tác khác nhau: thiết lập phản ứng PCR, phân tích sản phẩm khuếch đại …phải tiến hành ở những địa điểm khác nhau. - Dụng cụ của từng công đoạn, thao tác phải sử dụng riêng biệt khi hút dung dịch phản ứng - Dùng tia tử ngoại để loại bỏ các phẩn tử còn lại từ các lần khuếch đại trước. - Mọi thành phần của phản ứng phải chia thành nhiều lượng nhỏ (đủ với 1,2 lần thao tác) Trước lần phản ứng kế tiếp, thêm vào dung dịch phản ứng enzyme uracylglycosylase, có tác dụng phân huỷ tất cả các DNA mang dUTP nhiễm từ lần trước đồng thời enzyme sẽ bị phân huỷ bởi nhiệt ngay từ lần biến tính đầu tiên. 3. Sự kém trung thực của quá trình tổng hợp bởi Taq polymerase: việc tổng hợp DNA in vitro nhờ Taq polymerase có độ chính xác không cao: 2.10-4.Trong một phản ứng với 30 chu kì, tần suất sai số tổng thể 0,25%. Do đó bất kì một trình tự nào có được từ phương pháp PCR đều cần được xác nhận lại bằng cách xác định trình tự của nó. Taq polymerase biểu hiện tính chính xác khá thấp in vitro, làm xuất hiện các đột biến ngẫu nhiên bên trong vùng khuếch đại, vì thế đoạn được khuếch đại phải được xác định trình tự càng khó nếu kích thước lớn. Ngày nay nhờ sự phát triển của khoa học công nghệ có thể làm đơn giản hoá phản ứng PCR cho phép nó được sử dụng rộng rãi trong hầu hết các phòng thí nghiệm sinh học phân tử như là một routine procedure. IV. THIẾT KẾ CÁC PRIMER Việc chọn lọc primer nào đó là một thử thách cực kỳ quan trọng khi chúng ta muốn sử dụng PCR có hiệu quả và độ trung thực cao. Nhằm đạt được thành công trong việc khuếch đại của PCR, chúng ta phải có một thiết kế chính xác về oligonucleotide primer. Sequence của primer được chọn chính xác kích thước, vị trí của sản phẩm PCR, cũng như nhiệt độ Tm vùng được khuếch đại. Primer được thiết kế đúng có thể giúp chúng ta tránh tạo ra những sản phẩm PCR không chuyên biệt, giống như hiện tượng phân biệt giữa cDNA và DNA của genome trong RNA-PCR. 4.1.Thông số cơ bản để thiết kế primer Mục đích của thiết kế primer là có được một cân bằng giữa hai kết quả: sự chuyên tính và sự hiệu quả của PCR: Sự chuyên tính được xem xét trên cơ sở xuất hiện bao nhiêu lần hiện tượng priming nhầm trên tổng số lần priming (sự lai giữa primer và dây template tại vị trí mục tiêu của nó). Tính hiệu quả của một primer là làm thế nào tiếp cận với lý thuyết về kết quả sản phẩm, trong mỗi chu kỳ PCR, một cặp primer có thể khuếch đại ra một sản phẩm. Mỗi chuỗi mã DNA nào đó đã được cung cấp,người ta có thể phân tích primer trên phần mềm máy tính,để có thể cân bằng giữa hai mục tiêu nói trên. 4.1.1 Chiều dài primer Sự chuyên tính thường được điều khiển bởi chiều dài của primer và nhiệt độ trong quá trình annealing. Oligonucleotid có kích thước 18-25 base có xu thế trở thành squence rất chuyên tính, nếu nhiệt độ annealing của PCR được thiết kế xê xích vài độ so với Tm của primer (nhiệt độ lý thuyết ). Primer có chiều dài càng lớn, sự chia các template để được quấn đôi với primer càng nhỏ. Trong khi khuếch đại theo hàm số mũ, một sự cố nhỏ của quá trình annealing cũng sẽ làm suy giảm kết quả của sản phẩm PCR. =Để tối ưu hoá PCR, người ta sử dụng primer có chiều dài tối thiểu sao cho đảm bảo nhiệt độ melting khoảng 540C, hoặc hơn chút ít, điều này sẽ cung cấp những cơ hội tốt nhất để duy trì sự chuyên tính và mức độ hiệu quả cao. Những oligonucleotide ngắn (15 base hoặc ngắn hơn) được dùng một cách hạn chế trong nhiều qui trình PCR, thí dụ như primer ngẫu nhiên trong mapping các genome đơn giản (Liang và Pardee 1992, Wiliam 1990). Tuỳ thuộc vào kích thước genome của sinh vật, chúng ta sẽ có một độ dài tối thiểu cho hầu hết các ứng dụng PCR là 18 nucleotide. Nếu cDNA thuần khiết được sử dụng, hoặc nếu DNA của genome không có, thì chiều dài có thể giảm xuống, để mức độ rủi ro do hiên tượng tương tác không chuyên tính giữa primer và dây template sẽ giảm. Người ta thường thiết kế primer có độ dài 18-24 mer. Mặt khác, primer càng ngắn, quá trình quấn đôi giữa primer và dây DNA càng nhanh, tạo thành dây đôi ổn định trong tổng hợp DNA. Thông thường, primer có 28-35 mer cần cho việc khuếch đại các sequence có mức độ dị hợp cao =Có hai khả năng áp dụng trong thiết kế chiều dài của primer: Khuếch đại nhhững phần tử có tính đồng dạng (isoform)của protein hoặc một họ protein trong cùng một loài sinh vật, cũng như cloning một gen của loài khác mà sequence của nó rất cần thiết cho nhà nghiên cứu (dveksler và ctv.1993) Khuếch đại những sequence của virut như HIV-1, mà sự biến thiên của sequence, sự có mặt của sequence, sẽ xác nhận sự có mặt của bệnh do virut gây ra. Trong cả hai trường hợp, người ta đều nhờ phần mềm của máy tính để thiết kế primer, nhằm so sánh tất cả các sequence có liên quan và mô tả vùng của DNA mục tiêu với số lượng thấp nhất sự biến thiên của chuỗi mã. Khi chọn lựa primer để khuếch đại DNA từ những loài sinh vật khác nhau, chúng ta nên tránh chuỗi mã ở vùng không giải mã được 5’-3’ của mRNA. Bởi vì nó có thể không có bất cứ một mức độ tương đồng nào (homology) =Vị trí đầu 3’ của primer nên được xác định cẩn thận, vì nó có tính chất quyết định cho sự thành công của PCR. Khi chúng ta xác định được một amino acid, hai base đầu tiên trong codon của nó, hoặc base trong trường hợp nó được mã hoá bằng codon đơn (methionine và tryptophan), thì 2 hoặc 3 base đầu tiên này được dùng như đầu 3’. Những cặp base hoàn chỉnh giữa những đầu 3’ của primer và template cho phép chúng ta có được kết quả mong muốn và giảm thiểu tối đa hiện tượng không tương xứng (mismatches) trong khoảng 5-6 nucleotide tại đầu 3’ của primer Thông thường, sự thêm vào sequence không có liên quan tại đầu 5’ của primer vẫn không làm thay đổi quá trình annealing. Trong một vài trường hợp, khi số lượng base nhiều lên có ý nghĩa, những base này không tương xứng với sequence của dây template, được thêm vào primer. Sự khuếch đại 4-5 chu kỳ sẽ có thể hoàn tất, trong điều kiện nhiệt độ annealing thấp. Đối với những primer ngắn hơn 20 mer, Sugg và ctv (1981) đã đề xuất một công thức tính Tm liên hệ với các base: Td=4(G+C)+2(A+T) Trong khi primer dài hơn, tính toán này chỉ có giá trị gần đúng. Sau này nhờ phương tiện computer, Breslauer và ctv (1986),Freier và ctv(1986)đã thiết kế PCR primer theo chương trình cài đặt sẵn, khá tiện lợi. 4.1.2.N ucleotide cuối cùng của primer Nhiệm vụ của đầu 3’ trong primer là kiểm soát hiện tượng priming nhầm (Kwok và ctv. 1990).nhiệm vụ khác của nó là ngăn ngừa hiện tượng tương đồng (homology) trong cùng một cặp primer, chúng ta phải thận trọng vì primer không phải là sự kiện cái này bổ sung cho cái kia, đặc biệt tại đầu 3’ của nó. nếu không thận trọng trong việc xác định đầu 3’,hiện tượng primer –dimers sẽ xẩy ra,với tính chất bổ sung cho nhau, sản phẩm PCR lúc bấy giờ sẽ là một sự khuếch đại của chính primer, chớ không phải DNA template mà ta mong muốn. trong trường hợp có nhiều cặp primer đưa vào trong cùng một phản ứng (multiplex PCR), Chúng ta cần phải kiểm tra gấp đôi hiện tượng bổ sung cho nhau của tất cả primer. thông thường trong chương trình cài đặt sẵn của computer, không cho phép cặp primer có sự tương đồng về đầu 3’,nhằm giảm cơ hội xuất hiện hiện tượng primer-dimers(Chouvà ctv.1992). 4.1.3. Hàm lương GC và Tm Primer của PCR phải duy trì được hàm lượng GC đến mức có thể được. Những oligonucleotide có 20 base, với 50% G+C,thường có giá trị Tm trong khoảng 56-620C,tạo ra điều kiện để quá trình annealing đạt kết quả tốt. Hàm lượng GC và Tm phải khớp với một cặp primer sẽ được thiết kế. nếu giá trị Tm càng lớn, cơ hội cho priming nhầm càng cao. Do đó khi thiết kế primer, chúng ta phải chú ý đến hàm lượng GC, đôi khi do làm nhiều mẫu, chúng ta sẽ có những kinh nghiệm riêng trong thiết kế primer, nhất là việc chuyển đổi sequence của RFLP sang STS marker. 4.1.4. Chon loc không dưa trên computer Primer phải được chọn lọc từ những vùng được cô tả rất kỹ ở đầu 3’và đầu 5’của một sequence rất chuyên tính nào đó. Phương pháp thiết kế primer đơn giản ở đây là: chọn những vùng có thiếu một nucleotide đơn nào đó.Phương pháp chọn lọc primer như vậy là cách làm giảm cơ hội xẩy ra hiện tượng tương đồng primer-primer.một lần nữa, chúng ta phải thận trọng cân nhắc về chiều dài cặp primer, hàm lượng base,để giá trị Tm của primer xê xích trong vòng 2-30C 4.2. Sử dụng phần mềm để thiết kế primer Công thức đầu tiên của Suggs và ctv(1981)là:20Cx(A+T)+40Cx(G+C)đã trở nên phổ biến nhờ tính đơn giản và tính chính xác của nó. Hai chương trình sử dụng hơi khác nhau một chút về cách tính toán, nhưng cùng cho ra một primer được chọn, nếu chúng ta nhập vào những thông số cơ bản giốnh nhau. . Những sai biệt do phép tính khác nhau dẫn đến thứ tự ưu tiên trong tiêu chuẩn chọn lọc đã và đang được áp dụng. Người ta thực hiện các phương án để dự đoán giá trị Tm trên cơ sở các thông số nhiệt động học. Trong chương trình khác, người ta mô hình hoá nhiệt độ annealing dựa trên công thức được phát triển từ các đoạn phân tử DNA có độ dài hơn 100 nucleotide (MeConaughy và ctv.1969).Công trình nghiên cứu của Rychlik và ctv(1990)cho phép chúng ta mô hình hoá về nhiệt độ annealing tối hảo của một cặp primer. Sau đó, Wu và ctv (1991)đã dựa trên chiều dài primer, hàm lượng GC,để mô hình hoá nhiệt độ tối hảo này. Hầu hết các chương trình đều nhằm tìm một nhiệt độ annealing thích hợp cho PCR. Ngày càng có nhiều chương trình cải tiến với độ chính xác càng cao, đã được nhiều phòng thí nghiệm ứng dụng. Để thiết kế tốt các primer cấn chú ý những điểm sau: Oligo nucleotide không có quá nhiều A hoặc T Tuỳ vào phần mền của chương trình thiết kế trong máy tính Có kinh nghiệm trong việc thiết kế primer Chuỗi mã primer (mã di truyền không quá ngắn) Nhiệt độ trong khi tách và tổng hợp primer phải hợp lý Nếu mã di truyền phải thiết kế là 20 base thì nhiệt độ phải là: Tm=4x(G+C)+2x(A+T) Ví dụ với primer:5’-AGACTCAGAGAGAACCC-3’ Như vậy, chúng ta có 4G,5C,7A và 1T Nhiệt độ Tm=(4*9)+(2*8)=36+16=520C Và kết quả thiết kế là đoạn primer như sau:5’……3’F(viết tắt của chữ forward)và 5’……3’R(viết tắt của chữ reverse) V.CÁC CHỈ TIÊU ẢNH HƯỞNG ĐẾN PCR DNA mẫu Phản ứng khuếch đại tối ưu xảy ra trên DNA thật tinh sạch nhưng nhiều kỹ thuật chẩn đoán bằng PCR vẫn đạt kết quả tốt với DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào. Lượng DNA mẫu sử dụng cũng có khuynh hướng giảm (1µg xuống còn 100 ng) với việc sử dụng các polymerase cho hiệu quả cao. Hơn nữa việc, giảm lượng mẫu ban đầu còn hạn chế được khuếch đại “kí sinh” tạo những sản phẩm phụ không mong muốn. Một ưu điểm khác của phương pháp PCR là cho phép khuếch đại cả những mẫu DNA không được bảo quản tốt, đã bị phân huỷ từng phần như trong các vết máu lâu ngày, tinh dịch đã khô, hoá thạch, tóc, móng tay,của người đã chết …. Enzyme Enzyme được sử dụng đầu tiên là đoạn Klenow của DNA polymerase I. vì đây là không chịu nhiệt nên thao tác phức tạp và hiệu quả thấp ( phải thêm enzyme mới vào phần phản ứng sau mỗi lần biến tính vì enzyme cũ đã bị phân huỷ do nhiệt, nhiệt độ lai thấp khiến sự khuếch đại ký sinh rất cao, …). Phương pháp PCR chuyển sang một bước ngoặt mới cùng với sự phát hiện một DNA polymerase chịu nhiệt được tách chiết từ một vi khuẩn suối nước nóng, Thermus aquaticus. En zym này – Taq polymerase không bị phá huỷ ở nhiệt độ biến tính và xúc tác sự tổng hợp từ đầu đến cuối quá trình phản ứng. Ngày nay, nhiều polymerase chịu nhiệt khác đã được đưa ra thị trường với nhiều chức năng chuyên biệt hay hoàn thiện hơn. Tth polymerase, một enzyme chiết tách từ Thermus thermophilus, có khả năng hoạt động như một enzyme phiên mã ngược khi có mặt RNA khuôn và ion Mn++; nhưng với sự hiện diện của DNA khuôn và ion Mg++, Tth pol lại xúc tác phản ứng khuếch đại bản mẫu là RNA khuôn thông qua sự hình thành cDNA Mồi và nhiệt độ lai Mồi là chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt được một sự khuếch đại đặc trưng và có hiệu quả cao. Việc chọn mồi là giai đoạn quyết định của phương pháp PCR, và phải tuân thủ một số nguyên tắc: Trình tự của mồi được chọn sao cho không thể có sự bắt cặp bổ sung giữa mồi “xuôi” và mồi “ngược”, và cũng không có cấu trúc “kẹp tóc” do sự bắt cặp bổ sung giữa các phần khác nhau của một mồi . Tm của mồi xuôi và mồi ngược không cách biệt quá xa. Thành phần nucleotid của các mồi cân bằng tránh các cặp GC lặp đi lặp lại nhiều lần. Các mồi phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng với trình tự lặp lại trên gen Trình tự nằm giữa mồi xuôi và mồi ngược không quá lớn ; phản ứng PCR sẽ tối ưu trên những trình tự nhỏ hơn 1kb Các phần khác của phản ứng PCR Bốn loại nucleotide thường được sử dụng ở nồng độ là 20-200µM/mỗi loại nucleotide. Nồng độ cao hơn dễ dẫn đến sự khuếch đại “kí sinh”. Sự mất cân bằng trong thành phần các nucleotide lại làm tăng các lỗi sao chép của polymerase Nồng độ ion Mg ++ cũng là một nhân tố ảnh hưởng mạnh đến quá trình PCR. Tuy nhiên không có quy luật chung cho vấn đề này. Nồng độ tối ưu phải được xác định cho từng phản ứng qua nhiều thử nghiệm. Số lượng chu kỳ phản ứng PCR : Trong thực tế, người ta không vượt quá 40 chu kỳ cho một phản ứng PCR. Sở dĩ như vậy là vì phản ứng PCR diễn tiến qua 2 giai đạn, trong giai đoạn đầu số lượng bản sao tăng theo cấp số nhân với tỉ lệ với lượng mẫu ban đầu, sau đó hiệu quả khuếch đại giảm dần vì những nguyên nhân sau: Sự phân huỷ cạn và kiệt các thành phần của phản ứng. sự xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng. Các bản sao vừa được tổng hợp không két hợp với mồi mà bắt cặp với nhau…. Số chu kỳ cho một phản ứng tuỳ thuộc vào số lượng bản mẫu ban đầu. Ví dụ, nếu số lượng bản mẫu là 105 thì cần 25-30 chu kì, nếu số lượng bản mẫu là 102 – 103 thì số chu kì phải là 35-40,… Thiết bị và dụng cụ cho phản ứng PCR: Thực chất một thiết bị dùng để tiến hành phản ứng PCR chỉ cần đáp ứng được yêu cầu thay đổi nhiệt độ thật nhanh và chính xác. Các thiết bị hiện nay đã được cải tiến để tránh tối đa sự bốc hơi nước trong quá trình phản ứng, hay cho phép tiến hành PCR ngay trên mô tế bào, …Tuy nhiên, mỗi kiểu thiết bị có đặc điểm khuếch đại riêng nen mọi thí nghiệm của một nghiên cứu cần được tiến hành trên cùng một loại thiết bị. Hơn nữa, ống nghiệm dùng cho phản ứng của cùng một nghiên cứu phải thuộc cùng một kiểu vì đặc tính truyền nhiệt của các ống này cũng như độ tiếp xúc giữa ống và bộ phận tạo nhiệt của thiết bị có ảnh hưởng lớn đến quá trình khuýech đại. VI.TỐI ƯU HÓA CÁC ĐIỀU KIỆN CHO PHẢN ỨNG PCR 1.Sequence của primer Thông thường người ta cần có primer chuỗi dài cỡ 18 nucleotide trở lên, áp dụng cho genome của những sinh vật thuộc eukaryote, và primer ngắn –khoảng 10 nucleotidecho những DNA được clone hóa như cosmid. Tuy nhiên tùy theo loại primer tương hợp với mục tiêu lựa chọn marker phân tử trong xét nghiệm PCR, người ta thường có những primer của những marker có tính ngẫu nhiên như RAPD rất ngắn (10-16 mer), hoặc STS marker cần primer có độ dài 20-24 mer. Tuy nhiên, chúng ta nên nhớ rằng, DNA không phải là chuỗi mã của những nucleotide một cách ngẫu nhiên, mà nó còn có đặc tính của những họ (gene families), những nguyên tố có tính lập lại,sự lập đoạn đơn giản, hay những chuỗi mã lập lại phức tạp (thí dụ những alpha satellite sequence của nhũng genome người). Tùy theo loài sinh vật và tùy theo cách thể hiện của sequence dây đơn đối lập (templat), người ta sẽ thiết kế chuỗi mã của primer, và kiểm tra chuỗi mã cẩn thận so với số liệu lưu trữ trước đây, nhằm loại trừ các sai sót về kỹ thuật. Gần đây, người ta thường sử dụng phần mềm trong puter để thiết kế ra những primer theo mục tiêu nghiên cứu. 2.Nhiệt độ trong quá trình annealing Suggs và ctv (1981) đã đề nghị một công thức để ước đoán nhiệt độ Td,mà ở nhiệt độ ấy, một nửa các primer sẽ được phản ứng annealing với sequence mục tiêu.công thức được sử dụng trong điều kiện primer có khoảng 20 oligonucleotide: Td=4(G+C)+2(A+T) A,T,G,C là số lượng các base cp1 trong oligonucleotide. Tuy nhiên việc tính toán này chỉ có tính chất tạm thời, chúng ta phải điều chỉnh lại nhiệt độ này để có sự khuếch đại cao nhất và thu nhận tần suất đa hình cao nhất. bằng kinh nghiệm, và thực nghiệm xét nghiệm nhiều lần, chúng ta mới có thể có số liệu đúng về nhiệt độ cho các annealing.số base càng ít, nhiệt độ này càng thấp, và ngược lại. hiện nay có những máy thermal cycler được thiết kế cho phép chung ta đưa vào nhiều nghiệm thức Td để xác định nghiệm thức tối hảo. 3.Phản ứng dung dịch đệm Một trong những ảnh hưởng có tính chất quyết định là nồng độ Mg2+,kể cả về tác dụng chuyên biệt và kết quả PCR.môi trường có tính chất ion như vậy làm cho dung dịch đệm trở nên năng động hơn rất nhiều. do đó nồng độ Mg2+ cao hay thấp đều tạo ra ảnh hưởng rất khác nhau trong phản ứng PCR. nồng độ cao của Mg2+ sẽ làm cho phân tử DNA dây đôi ổn định hơn, và ngăn ngừa sự biến chất hoàn toàn (sự mở dây để cho dây đơn)của sản phẩm trong mỗi chu kỳ, làm cho kết quả PCR ít hơn. Lượng dư thừa Mg2+ còn làm cho hiện tượng annealing giả xẩy ra thêm ổn định hơn, tại những vị trí không đúng của dây đơn,cho ra nhửng sản phẩm không mong muốn với số lượng khá lớn, nhưng mức độ chuyên tính rất thấp (Oste 1989) Ngược lại, nếu nồng độ Mg2+quá thấp (<0,5µM),nó sẽ làm xấu đi quá trình extension (kéo dài chuỗi mã đối lập với dây gốc),trong đó Mg2+đóng vai co factor của Taq polymerase. Một vài ion Mg2+ sẽ được kẹp giữ bởi Dntp trong phản ứng. Do đó, người ta cần phải xác định nồng độ tối ưu của Mg2+ nhằm đảm bảo kết quả số lượng sản phẩm và sự chuyên tính của sản phẩm PCR. trong một vài vùng có tính chất recalcitrant nghĩa là có rất nhiều cặp GC,thì chỉ cần có một khoảng biến thiên rất hẹp về nồng độ Mg2+,đủ cho ra kết quả PCR và sự chuêyn tính mong muốn. Môi trường đệm KCl đã và đang được áp dụng rộng rãi, cũng có thể là buffer rất hữu dụng cho kỹ thuật PCR. Tuy nhiên trong một vài loci, người ta thấy môi trường đệm này rất khó dùng cho khuếch đại sản phẩm, chỉ trừ Mg2+ đã được lựa chọn. PCR của những loci giàu GC cho thấy: mức độ chuyên tính gia tăng khi khuếch đại trong dung dịch đệm NaCl,nhờ sự biến chất hoàn toàn (complete denature) (Holm và ctv 1991) Người ta còn tìm thấy dung dịch đệm ammonium sulpate –dung dịch được sử dụng rất sớm –làm giảm những sản phẩm được phát triển một cách không hoàn toàn trong PCR với Taq. phương pháp này dùng để phát hiện những băng có trọng lựơng phân tử thấp chạy trên acrylamide gel,đối với những sản phẩm PCR được theo dõi nhờ đánh dấu phóng xạ. pH của dung dịch đệm cũng được xem xét trong kỹ thuật PCR. Hầu hết các dung môi phản ứng được đệm trong môi trường 10-50 Mm Tris –HCl ở pH=8,3, nhiệt độ 20oC.tuy nhiên pH sẽ giảm khi nhiệt độ tăng. Theo chu kỳ nhiệt độ của PCR, pH sẽ thay đổi từ 7,8 đến 6,8.với khoảng giá trị như vậy, pH được xem như tạm chấp nhận. 4.Nồng độ deoxynucleotide Người ta đã khuyến cáo rằng mỗi deoxynucleotide được sử dụng là 200µm,lượng thừa đầu tiên của deoxynucleotide tương ứng theo 100 ng DNA của dây đơn (1010 đến 1011),nồng độ của nó phải là một hằng số không đổi (constant).nồng độ ban đầu là 200µM, nồng độ dNTP sau cùng sẽ hình thành một lượng thừa 104,ngay cả khi 50% của nó bị phân hủy trong quá trình diễn biến chu kỳ nhiệt. Điều quan trọng là chúng ta phải giữ cho nồng độ của tất cả các deoxynucleotide bằng nhau, để tránh sự kết gắn vào nhầm lẫn. 5 polymerase chịu nhiệt Nếu DNA polymerase dư thừa, chúng ta sẽ thấy hiện tượng tổng hợp DNA do phản ứng giả của primer trên dây đơn. trong hầu hết các protocol, người ta khuyến cáo nồng độ Taq polymerase nên sử dụng là 0,5 U /25µl,sẽ cung cấp emzyme có nồng độ phân tử thấp nhất cho mọi hợp phần của phản ứng, 1Nm. Sau khi khuếch đại 106-fold ở vùng mục tiêu khởi đầu, 1 Fm, chúng ta sẽ có một số lượng phân tử tương đối với phân tử enzyme . Nồng độ ít này đủ để kiểm soát sự chuyên tính của phản ứng khuếch đại. Chúng ta không nên sử dụng nồng độ cao hơn 2,5nM của enzym 6.Nồng độ các primer Lượng thừa đầu tiên của các primer ứng với dây đơn template (107) là nồng độ primer cần thiết, nó phải là hằng số. 95% các phân tử đầu tiên của primer vẫn còn duy trì sau 30 chu kỳ. trong hầu hết các ứng dụng PCR, hai primer F và R đều phải có nồng độ bằng nhau. Nồng độ sau cùng của mỗi primer là 0,1µM, tương ứng với 2,5 pmol(16,25 ng của 20-mer)trong 20 µl dung dịch cacktail.nồng độ này pahỉ được điều chỉnh 0,5µM, tùy thuộc vào locus nào đó cần được khuếch đại . Những protocol trước đây khuyến cáo primer ở nồng độ 3µM, nhưng với nồng độ cao như vậy không những không cần thiết mà còn tạo ra bất lợi, vì quá thừa primer, dẫn đến sự hình thành hiện tượng primer dimer, và hiện tượng priming. 7.Chất ổn định hoạt động của enzyme Những hoạt chất ổn định hoạt động của enzyme (enzyme stabilizers) cũng được chú ý. Nhiều nhà sản xuất hóa chất đã xem xét gelatin hoặc Triston x-100 là 1 trong những buffer đễ tồn trữ enzyme . Có trường hợp người ta sử dụng cả hai làm dung dịch đệm. Nhằm bảo quản và ổn định enzyme trong quá trình xử lý nhiệt của PCR, mỗi dung dịch đệm trong phản ứng đều chứa gelatin ở nồng độ 0,01% và Triston X-100 ở nồng độ 0,1% (v/v). 8.Số lựợng DNA Phân tử DNA ở đây hiểu theo nghĩa “DNA template” (dây nền). Thí dụ genome của người, DNA có 125 ng/25µl được sử dụng. Điều này tưng ứng với 0,063 attomoles của DNA (#10-9 mol)và ở nồng độ 2,5fM. Khi khuếch đại vùng mục tiêu từ dây đơn DNA, số lượng của template được tính tóan trên cơ sở “mol”. Phép tính này giúp chúng ta xác định số lượng DNA cần phải có, số chu kỳ để tổng hợp ra DNA với số lượng mong muốn. Tính trung thực của việc khuếch đại nhiều ít tùy thuộc vào mức độ sai sót của DNA polymerase. Tính trung thực được hiểu là số copy được tổng hợp nhờ khuếch đại theo chu kỳ PCR sẽ giống hệt như phân tử DNA gốc. Nó còn phụ thuộc vào copy đầu tiên của dây nền. Sai số ngẫu nhiên có trong vài chu kỳ đầu lan rộng ra những chu kỳ sau. Tình trạng này xem xét qua hiện tượng “ckpot”- một kiểu đột biến trên E.coli. Nếu số lượng phân tử khởi đầu ít hơn 100, và tính trung thực của phản ứng polymerase được giữ vững,thì người ta có thể thực hiện những chu kỳ đầu tiên của PCR, kiểm soát được bằng T7 hoặc T4 polymerase. Cho dù những enzyme này không có tính chịu nhiệt giỏi, nhưng nó cũng sẽ bổ sung thêm sau mỗi lần “denature” (mở dây đơn). Nó cho mức độ sai sót thấp hơn Taq polymerase (Keohavong và Thilly 1980). Sau một vài chu kỳ đầu tiên, PCR tự điều chỉnh lại với họat động của Taq polymerase. 9.Tỉ lệ giữa primer:template Một trong những khái niệm quan trọng nhất ccủa PCR là tỉ lệ tối hảo giữa primar và template. Nếu tỉ lệ này quá cao, hiện tượng primer-dimers sẽ xuất hiện, giống hệt như trường hợp mẫu DNA quá loãng. Nếu tỉ lệ này quá nhỏ, kết quả sản phẩm PCR sẽ không nhiều. Hầu hết các trường hợp áp dụng PCR, đều dùng một nồng độ primer không vượt quá giá trị 0.5µM(12.5pmol/25µl coktail), không tính đến nồng độ template DNA, để tránh hiện tượng “primer-dimers”. VII.ỨNG DỤNG 1.Phát hiện virus HIV: Nguyên lý của kĩ thuật xét nghiệm bằng PCR:tổng hợp và nhân bản sao một đoạn DNA đặc hiệu HIV từ một tế bào nhiễm nhờ phát hiện được bằng điện di gel thạch agarose.,cho kết quả nhạy và đặc hiệu. Có thể chẩn đoán sớm nhiễm HIV ở giai đoạn tiềm tàng, phát hiện HIV ở trẻ sơ sinh và bà mẹ bị nhiễm. 2.PCR sản xuất đột biến: dùng PCR để xóa đi hoặc cấy ghép một đột biến vào phân tử DNA mục tiêu; giúp nghiên cứu chức năng tương lai của các protein cuối cùng 3.Trong cloning tái tổ hợp: chỉ cần một vài tế bào đích ban đầu có thể dùng đoạn mồi đặc hiệu để tổng hợp và khuếch đại đoạn gen muốn tìm thành hàng tỉ bản sao giống hệt nhau rồi đưa vào plasmid. lúc này plasmid mang đúng đoạn gen đích không thể lẫn đoạn gen khác. Vì vậy khi chuyển plasmid vào vi khuẩn không cần phải làm kỉ thuật chọn dòng. 4.Nhân bản đoạn DNA mong muốn:từ một số lượng DNA với một cặp mồi đặc hiệu có thể tổng hợp và khuếch đại đoạn DNA đích trong bộ gen phức tạp thành hàng ti73 bản sao các đoạn DNA giống hệt nhau mà không cần phải li trích 5.Phát hiện vi sinh vật gây bệnh: bằng cách khuếch đại đoạn nucleotide đặc trưng của vi sinh vật gây bệnh trong mẫu bệnh phẩm thử nghiệm PCR có thể phát hiện vi sinh vật gây bệnh với độ nhạy cực cao vàcòn phân loại kiểu di truyền của vi sinh vật mà không cần nuôi cấy. Vì phản ứng PCR quá nhạy nên khi áp dụng chẩn đoán cần tránh hiện tượng dương tính giả bằng cách thực hiện phản ứng PCR trong phòng thí nghiệm có tổ chức chặt chẽ, các giai đoạn thí nghiệm thực hiện tại các khu vực riêng sử dụng nhiều vật liệu chỉ dùng một lần kết hợp nhiều phương pháp loại trừ ngoại nhiễm (phương pháp nội tại ) 6.Trong tiến hóa: nghiên cứu tiến hóa dựa trên cấu trúc phân tử của protein:cytochrom,hemoglobin,ribonoclease 7.Phát hiện các khiếm khuyết về gen gây các bệnh di truyền hay ung thư, xác định dấu ấn di truyền. kĩ thuật PCR phát hiện dấu ấn di truyền đã có những đóng góp rất lớn trong khoa học hình sự 8.PCR với việc định loại các mô: là một hứa hẹn đầy triển vọng do cho nhiều thống tin hơn phương pháp miễn dịch học B-REAL- TIME PCR I/.ĐẠI CƯƠNG: Ngày nay nhờ sự phát triển của khoa học công nghệ có thể làm đơn giản hoá phản ứng PCR cho phép nó được sử dụng rộng rãi trong hầu hết các phòng thí nghiệm sinh học phân tử như là một routine procedure. Và dạng cải tiến từ phương pháp PCR là Nested-PCR thực hiện với 2 hay nhiều cặp mồi khuếch đại trình tự có kích thước lớn hơn. Các mồi nested sẽ khuếch đại những đoạn nằm bên trong của sản phẩm PCR ban đầu bằng cách sử dụng sản phẩm PCR đầu tiên này làm khuôn mẫu. Độ đặc hiệu tăng lên nhiều do mồi nested sẽ loại bỏ hầu như các sản phẩm không đặc hiệu của lần PCR đầu tiên. Tuy nhiên nếu sử dụng nhiều mồi, độ nhạy phản ứng tăng lên, phản ứng dễ nhiễm. PCR thì Real –Time PCR nổi bật hơn do có khả năng định lượng chính xác số bản Một dạng cải tiến khác của PCR là phương pháp Real –Time PCR.So với Nested sao ban đầu,đồng thời cho phép rút ngắn thời gian phân tích. Khả năng định lượng được kết hợp trong kỹ thuật Real - time PCR đảm bảo giảm thiểu xác suất dương tính giả đối với kết quả phân tích.Phương pháp này có khả năng phát hiện và định lượng mầm bệnh (virus) ở mức độ một phân tử (copy) trên một mẫu trước khi xuất hiện các biểu hiện sinh lý. Vào năm 1992 – 1993, Higuchi và các cộng sự đã tiên phong phân tích PCR kinetic (PCR động) bằng cách thiết lập hệ thống phát hiện các sản phẩm khuếch đại khi các sản phẩm này được tích lũy. Hệ thống Real - time bao gồm máy luân nhiệt có hệ thống chiếu mẫu bằng tia UV và tín hiệu huỳnh quang được thu nhận qua CCD (charge coupled device) camera. Ethidium bromide được thêm vào trong mỗi hỗn hợp phản ứng Real - time PCR. Khi có sự khuếch đại, số lượng ADN sợi đôi ngày càng tăng, ethidium bromide xen vào ADN mạch đôi, do đó tín hiệu huỳnh quang tăng lên (Weighardt F., 2004). Ngày nay, các nhà khoa học không ngừng cải tiến kỹ thuật Real - Time PCR, đồng thời phát minh ra các chất chỉ thị huỳnh quang có độ phát sáng cao: SYBR Green I, FAM, HEX, Texas Red®, CyTM5,… II/HỆ THỐNG RT-PCR Real - time PCR là phương pháp khuếch đại và đồng thời phát hiện đoạn ADN chuyên biệt thông qua các chất chỉ thị huỳnh quang. Trong phản ứng Real - time PCR, quá trình nhân bản ADN đang diễn ra theo từng chu kỳ nhiệt được theo dõi trực tiếp (Newton C. R. and Graham A., 1997). Real - time PCR gồm hai quá trình diễn ra đồng thời: nhân bản ADN bằng phản ứng PCR và đo độ phát huỳnh quang, độ phát quang này tỷ lệ thuận với số lượng đoạn Dna tạo thành. (Nguyễn Thái Thủy, 2003). Máy vi tính Quang phổ huỳnh quang Máy luân nhiệt Hình 2.8 Hệ thống Real - time PCR Các thiết bị dùng trong Real –time PCR gồm:máy luân nhiệt (PCR) được nối với máy quang phổ huỳnh quang và máy vi tính &Hệ thống này hoạt động theo nguyên tắc sau: nguồn sáng chiếu sáng qua kính lọc kích thích và truyền đến mẫu đã được đặt trên máy luân nhiệt. Ánh sáng kích thích này giúp chất chỉ thị huỳnh quang tương ứng với số ADN đích trong ống phản ứng phát ra ánh sáng. Ánh sáng huỳnh quang này sẽ qua bộ kính lọc phát sáng. Kính lọc này sẽ chọn lọc các ánh sáng có bước sóng thích hợp. Sau đó, ánh sáng sẽ qua bộ phận khuếch đại tín hiệu (intensifier),cuối cùng phát hiện nhờ đầu đọc CCD camera Nguyên tắc hoạt động của hệ thống Real - time PCR KÍNH LOÏC KÍCH THÍCH KÍNH LOÏC PHAÙT SAÙNG TIA SAÙNG LEÄCH III/Nguyên lý định lượng của phương pháp Real-Time PCR: Để định lượng số bản sao ban đầu của mẫu cần xét nghiệm, khi thực hiện định lượng qua Real - time PCR cần chạy kèm với các chuẩn đã biết chính xác số bản sao ban đầu. Khi phản ứng Real - time PCR kết thúc, giá trị chu kỳ ngưỡng của mẫu xét nghiệm và của các chuẩn được xác định ở thời điểm có sự tương quan tuyến tính giữa số chu kỳ và nồng độ huỳnh quang đo được (pha log hay pha cấp số). Tại thời điểm này, đường baseline subtracted (đường đã trừ đi tín hiệu nền) phải cắt tất cả các đường biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang đo được và số chu kỳ. Tại vị trí cắt này, tín hiệu huỳnh quang vượt qua tín hiệu nền rõ rệt. Chu kỳ ngưỡng của mẫu và chuẩn được xác định tại vị trí đó. Đường chuẩn được hình thành dựa vào chu kỳ ngưỡng (đã được xác định ở trên) và nồng độ bản sao của các chuẩn đã biết. Chu kỳ ngưỡng của mẫu xét nghiệm được đối chiếu qua chu kỳ ngưỡng của các chuẩn nằm trên đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa log số bản sao ban đầu và chu kỳ ngưỡng. Kết quả đối chiếu này sẽ cho giá trị log số bản sao ban đầu của mẫu xét nghiệm qua phương trình Y = a.X + b (trục Y: chu kỳ ngưỡng, trục X: log số bản sao ban đầu). Từ giá trị log số bản sao ban đầu này ta sẽ quy đổi ra số bản sao ban đầu của mẫu xét nghiệm. CHU KÌ NGƯỠNG Ct (Treshold Cycle):nơi mà tín hiệu huỳnh quang cao hơn tín hiệu nền một cách thấy rõ.Chu kì ngưỡng tương quan chặt chẽ với số lượng DNA đích ban đầu IV/Phương pháp nhận tín hiệu Real –time khi phản ứng PCR đang diễn ra: Dùng các phẩm nhuộm: phẩm nhuộm khi chèn vào sợi đôi DNA sẽ phát huỳnh quang mạnh hơn khi ở trạng thái tự do: Ethidium bromide-sáng gấp 25 lần; SYBR green-sáng gấp 200 lần … Dùng các đoạn DNA đặc hiệu (probe) có gắn chất phát huỳnh quang chỉ phát sáng khi có bắt cặp với trình tự đích:Beacon,Taqman… Tính đặc hiệu của Real - time PCR tùy thuộc hóa chất dùng để theo dõi phản ứng khuếch đại và dụng cụ để kiểm tra tín hiệu. Các hóa chất khác nhau dùng trong mục đích này (Weighardt F., 2004): 1/Phẩm nhuộm chèn sợi đôi DNA: SYBR Green I chèn vào DNA sợi đôi Lần đầu tiên tiến hành Real-Time PCR, người ta dùng thuốc nhuộm Ethidium bromide, sau đó người ta dùng SYBR green, …Khi mà DNA polymerase kéo dài phân tử thì các phân tử thuốc nhuộm được chèn vào giữa sợi DNA kép và phát quang. SYBR Green I gắn vào DNA mạch đôi và phát tín hiệu huỳnh quang ở bước sóng 530 nm khi được kích thích bằng ánh sáng có bước sóng 490 nm. Mức độ huỳnh quang tương ứng với số DNA mạch đôi trong phản ứng. Đối với SYBR Green I dữ liệu huỳnh quang được thu nhận trong giai đoạn kéo dài. SYBR Green I gắn vào DNA mạch đôi và phát huỳnh quang sáng gấp 50 đến 100 lần so với khi không gắn kết vào DNA. Hạn chế của SYBR Green I trong phát hiện sản phẩm PCR khuếch đại là sự phát hiện DNA không đặc hiệu. Do mọi phân tử DNA đôi hiện diện trong phản ứng đều được định lượng, bao gồm các sản phẩm PCR không đặc hiệu và primer – dimer. 2/ Molecular Beacons probe: Molecular Beacons probe được đánh dấu fluorophore (F-chất chỉ thị huỳnh quang) ở cuối đầu 5’và một phân tử quencher (Q-chất hấp thụ) ở cuối đầu 3’. Molecular Beacons probe gồm: trình tự probe bổ sung với DNA đích (loop) và hai trình tự bên thân probe (stem) với khoảng 5 nucleotide hay nhiều hơn. Trình tự hai bên thân probe (stem) không bổ sung với ADN đích mà bổ sung lẫn nhau. Khi trình tự hai bên thân probe bắt cặp với nhau, Molecular Beacons probe có dạng cấu trúc kẹp tóc. Ở dạng này, Molecular Beacons probe mang fluorophore và quencher ở khoảng cách gần, giúp quencher hấp thụ huỳnh quang từ fluorophore. Khi Molecular Beacons probe gắn vào DNA đích, đầu 5’ và 3’ tách riêng biệt, tín hiệu huỳnh quang được phát ra tương ứng với số DNA đích tạo thành. Ở bước biến tính (950C), Molecular Beacons probe tách nhau hoàn toàn, mở vòng kẹp tóc, tín hiệu huỳnh quang tăng cao. Khi nhiệt độ giảm xuống ở giai đoạn bắt cặp, Molecular Beacons probe gắn kết với trình tự DNA đích. Các Molecular Beacons probe không gắn bổ sung lên trình tự DNA đích sẽ tự bắt cặp lại trở về cấu trúc kẹp tóc ban đầu. Do vậy, tín hiệu huỳnh quang ghi nhận được ở giai đoạn này hoàn toàn tương ứng với lượng DNA đích. Đối với Molecular Beacons probe, dữ liệu huỳnh quang được thu nhận trong giai đoạn bắt cặp. Hình 2. 11 Nguyên tắc của Molecular Beacons probe Khi probe tự do tồn tại dưới cấu trúc này thì tín hiệu huỳnh quang từ F sẽ bị Q hấp thu = KHÔNG PHÁT HUỲNH QUANG Ghi nhận tín hiệu huỳnh quang ở 550C PROBE:mẫu dò probe là bất cứ cái gì mình đã biết trước về nó và dùng nó để dò tìm những cái có thể tương tác một cách có ý nghĩa với nó (probe). Ví dụ: một oligo,một đoạn cDNA đã biết trình tự và được gắn huỳnh quang hay chất phóng xạ sẽ được dùng làm probe để đi dò tìm và phát hiện những đoạn gen khác nếu có sự tương tác do có trình tự bổ sung với trình tự của probe. 3/Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET probe):có kiểu thiết kế ngược với Beacon FRET dựa vào sự truyền năng lượng từ fluorophore cho sang fluorophore nhận. CácđiềukiệnđốivớiFRET: - Các phân tử cho và nhận phải ở gần nhau (cụ thể 10 – 100 A0). - Phổ hấp thụ của vật nhận phải bao phủ phổ phát quang của vật cho. - Hướng chuyển đổi giữa vật cho và vật nhận phải đối diện nhau. Hệ thống FRET dựa vào hai chất chỉ thị huỳnh quang, hai chất này khi ở gần nhau sẽ tạo ra tín hiệu huỳnh quang chuyên biệt. Một chất đánh dấu huỳnh quang được kích thích bởi nguồn sáng và chuyển năng lượng cho chất đánh dấu huỳnh quang thứ hai. Chất đánh dấu huỳnh quang thứ hai này sẽ phát ra ánh sáng ở bước sóng khác để phát hiện. Probe lai được thiết kế ở dạng một cặp – một probe đánh dấu với màu cho (3’ – Fluorescine), probe còn lại được đánh dấu với màu nhận (5’ – Red 640 hay 5’ – Red 705). Khi hai probe bắt cặp với đoạn DNA đích thường chúng được tách riêng ra và bắt cặp vào ở vị trí cách nhau 1 - 5 nucleotide, kết quả sẽ có hiện tượng truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (FRET) giữa hai chất chỉ thị huỳnh quang. Hiện tượng truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang giữa đầu 3’ đánh dấu của probe thứ nhất và đầu 5’ của probe thứ hai nằm kế cận tạo ra tín hiệu huỳnh quang. Nhờ đó tín hiệu huỳnh quang được ghi nhận tương ứng với số sản phẩm đích. Tín hiệu này được đo bởi thiết bị đo huỳnh quang 4/TaqMan probe: được dùng phổ biến nhất trong các tài liệu về Real - time PCR. Probe oligonucleotide gắn vào đoạn bên trong DNA đích. Probe này được đánh dấu ở đầu 5’ bằng chất nhuộm chỉ thị huỳnh quang – fluorescent reporter dye (gọi là reporter) và chất hấp thụ – quencher ở đầu 3’. Reporter và quencher có phổ kích thích và phát quang trùng nhau. Nhờ đó tín hiệu huỳnh quang được hấp thu. Khi DNA đích tích lũy, probe gắn vào DNA đích nhưng chưa phát quang. Khi mạch bổ sung với mạch khuôn mà probe bắt cặp được kéo dài, Taq DNA polymerase tiến tới đầu 5’ của probe. Hoạt tính 5’à3’ exonuclease của Taq 4N polymerase sẽ phân cắt đầu 5’ đã được đánh dấu huỳnh quang của probe. Do đó chất chỉ thị huỳnh quang - reporter được phóng thích ra khỏi sự bắt cặp của chất hấp thụ – quencher và tín hiệu huỳnh quang tăng lên. Mức độ huỳnh quang tương ứng với số DNA chuyên biệt mong đợi. Khác với SYBR Green I, primer dimer và các sản phẩm DNA khuếch đại không đặc hiệu sẽ không cho tín hiệu huỳnh quang Như vậy, tín hiệu huỳnh quang được ghi nhận trong giai đoạn kéo dài. Độ mạnh tín hiệu huỳnh quang tích lũy tăng dần. Tuy nhiên TaqMan probe cần phải đảm bảo - Chất phát huỳnh quang được chọn làm reporter phải có phổ phát sáng tách biệt với quencher. - Reporter phát sáng trong khoảng kích thích của quencher. - Quencher phải nằm gần reporter để hấp thụ hiệu quả. dùng TaqMan probe để bắt cặp với đoạn đặc hiệu 100 bp cần khuếch đại nhằm phát hiện, TaqMan probe được đánh dấu ở đầu 5’ bằng chất chỉ thị huỳnh quang FAM (đóng vai trò reporter) và 3’ TAMRA (đóng vai trò quencher). TaqMan probe hoạt động theo nguyên tắc cụ thể ở Hình 2.13 như sau: CÁC GIẢI PHÁP REAL –TIME PCR: Theo dõi phản ứng PCR đang xảy ra Định lượng nồng độ DNA mẫu trước phản ứng bằng cách so sánh chu kì Ct mẫu với Ct của các chuẩn đã biết trước nồng độ.Số lượng DNA đích ban đầu càng nhiều thì thời điểm (Ct) phát hiện tín hiệu sản phẩm khuếch đại càng sớm. Dùng Melt Curve để xác định đặc tính khuếch đại:xem trong sản phẩm khuếch đại có chứa đoạn gen hay không hoặc có khuếch đại đặc hiệu hay không Phân tích End-point, xác định dương tính hay âm tính V/Ứng dụng: Real - time PCR cũng được ứng dụng vào trong các lĩnh vực tương tự như PCR truyền thống. Nhờ khả năng thu nhận tín hiệu huỳnh quang tương ứng với số DNA đích ở pha cấp số, Real - time PCR được mở rộng thêm nhiều ứng dụng mới và hiệu quả hơn PCR truyền thống (Applied Biosystems, 2004): Định lượng hàm lượng virus, mức độ nhiễm virus,vi khuẩn:chẩn đoán viêm gan siêu vi B, phát hiện nhanh vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm: Virio parahaemolyticus và Vibrio vulnificus gây bùng nổ ngộ độc thực phẩm,đặc biệt là thủy sản. Nghiên cứu biểu hiện gen: +Cho kết quả không những gen nào đang hoạt động mà còn định lượng mức độ biểu hiệncủa gen đó +Tiếp cận phổ biến nhất là phối hợp với phân tích microarray khi các nhà nghiên cứu muốn định lượng chính xác biểu hiện của các gen quan tâm hoặc khảo sát mô hình biểu hiện của nhiều gan thay đổi như thế nào liên quan đến một điều kiện thí nghiệm Phát hiện GMO (Genetically modified organ isms):sinh vật biến đổi gen-là sinh vật sống có bộ gen được chèn một hoặc nhiều đoạn DNA(DNA chèn) làm bộ gen của sinh vật bị biến đổi, nhằm làm tăng itnh1 ưu việt có chọn lọc. Nguyên nhân phải kiểm tra GMO: công nghệ sinh học phát triển, ngày càng nhiều thực phẩm có nguyên liệu là GMO; quan điểm xã hội chưa quen;ích lợi và tác hại chưa xác định rõ:mất cân bằng tự nhiên Real –Time PCR là phương pháp chuẩn để kiểm tra GMO ở châu Âu Phương pháp miễn dịch Phương pháp PCR Dựa trên protein Nguyên liệu Test định tính Không đủ nhạy và đặc hiệu Không mắc tiền Dựa trên DNA/cDNA Nguyên liệu và thành phẩm Test định lượng(Real Time PCR) Rất nhạy,đặc hiệu và chính xác Mắc tiền Chẩn đoán phân tử Phân biệt Allelic/SNP Ứng dụng hiệu quả trong trị liệu thuốc. Đối với tác nhân gây bệnh là virus, Real - time PCR đóng vai trò rất quan trọng trong phát hiện và định lượng tác nhân gây bệnh này. Đặc biệt Real-Time PCR có vai trò trong chẩn đoán viêm gan siêu vi: Phát hiện và định lượng HBV để chỉ định điều trị đặc hiệu và theo dõi điều trị Phát hiện và định lượng HCV để chỉ định điều trị đặc hiệu và theo dõi điều trị Vì sao phải sử dụng REAL TIME PCR ? Đây là phương pháp PCR định lượng chính xác nhất Độ nhạy cao nhất Độ đặc hiệu Có thể nhiều hơn một loại gen cùng một lúc Có thể dùng melt curve để xác định đặc tính của sản phẩm khuếch đại Toàn bộ qui trình nhân bản và phát hiện diễn ra trong tube kín:rút ngắn thời gian, hạn chế nhiễm chéo VI/Ưu nhược điểm: định lượng chính xác số DNA tham gia phản ứng, quan sát trực tiếp tiến trình khuếch đại đang diễn ra theo từng chu kỳ khi phản ứng Real - time PCR xảy ra. Ngoài ra, Real - time PCR còn thể hiện một số ưu điểm nổi bật: - Không cần điện di sau khi thực hiện phản ứng Real - time PCR. - Quy trình đơn giản, tiến trình thực hiện nhanh, rút ngắn thời gian cho kết quả.,có thể định lượng nhiều hơn một loại gen cùng một lúc. - Độ nhạy cao. - Độ đặc hiệu cao. - Ống phản ứng PCR luôn luôn đóng, tránh nguy cơ ngoại nhiễm Tuy nhiên Real - time PCR đòi hỏi phòng thí nghiệm phải có trang thiết bị máy hiện đại, giá thành khá cao.