Phân tích đồng phân quang học của Atenolol trong viên nén bằng phương pháp sắc ký lỏng (HPLC)

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2018 400 PHÂN TÍCH ĐỒNG PHÂN QUANG HỌC CỦA ATENOLOL TRONG VIÊN NÉN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG (HPLC) Lê Thị Thu Cúc*, Thái Hồng Hạnh*, Lê Khánh Trúc Diễm*, Trần Mỹ Thiên Thanh* TÓM TẮT Mục tiêu: Xây dựng và thẩm định quy trình phân tích đồng phân quang học của atenolol bằng phương pháp sắc ký lỏng (HPLC). Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Đối tượng nghiên cứu là đồng phân (S)-atenolol. Trong quá trình thực nghiệm, các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phân tách đồng phân như cột sắc ký, thành phần và tỉ lệ dung môi sẽ được khảo sát nhằm chọn được điều kiện phân tích thích hợp. Sau khi tìm được điều kiện sắc ký thích hợp, tiến hành thẩm định quy trình phân tích bao gồm khảo sát tính phù hợp của hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến tính, giới hạn phát hiện, độ chính xác và độ đúng. Kết quả: Xây dựng và thẩm định quy trình phân tích đồng phân quang học của atenolol, với các điều kiện sắc ký như sau: cột sắc ký Lux Cellulose-1, pha động là hệ dung môi n-hexan-ethanol-diethylamin (80:20:0,1; tt/tt/tt), detector UV ở bước sóng 220 nm. Độ phân giải giữa hai đồng phân lớn hơn 3,0, Khoảng tuyến tính 25 – 1000 μg /ml. Phương pháp độ chính xác và độ lặp cao với RSD < 2% và độ phục hồi từ 98 – 102%. Kết luận: Bằng phương pháp HPLC, đã xây dựng và thẩm định được quy trình phân tích đồng phân quang học của atenolol. Phương pháp được ứng dụng để kiểm tra các chế phẩm chứa đồng phân quang học của atenolol trên thị trường. Từ khóa: đồng phân atenolol, (S)-atenolol, Lux Cellulose-1 ABSTRACT ENANTIOMERIC SEPARATION OF ATENOLOL IN TABLETS BY HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY METHOD Le Thi Thu Cuc,Thai Hong Hanh, Lê Khanh Truc Diem, Tran My Thien Thanh * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement Vol. 22 - No 3- 2018: 400- 405 Objective: This paper describes validated direct liquid chromatographic chiral methods for enantiomeric separation and quantitative determination of atenolol. Methods: The subject of this study is (S)-atenolol. The aims of our study are: research of chromatographic conditions (column, mobile phase, .) to separate the two isomers of atenolol. The validation of an analytical method is the process by which it is established that the performance characteristics of the method, such as Precision, Accuracy, Specificity, Linearity, Limit of Detection (LOD), meet the requirements for the intended applications. Results: A high performance liquid chromatographic (HPLC) method was developed for the chiral separation of atenolol. The two enantiomers were separated on a Lux Cellulose-1 column. The mobile phase was n-hexane- ethanol-diethylamine (80:20:0.1; v/v/v), UV detection was at 220 nm. The resolution of the enantiomers was more than 3.0, The range of quantification for both enantiomers was 25-1000 μg.mL-1, Relative standard deviation of the method was below 2% (n=6), the recovery range was 98-102%. * Viện Kiểm nghiệm thuốc TP. Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: TS.DS. Lê Thị Thu Cúc, ĐT: 0909337330, Email: thucuc_vkn@yahoo.com.vn Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 3 * 2018 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2018 401 Conclusion A high performance liquid chromatographic (HPLC) procedure for separation of the atenolol enantiomers was established and validated. The method showed applicable to quantitative determination of atenolol enantiomers in pharmaceutical preparations. Keywords: Atenolol enantiomers, (S)-atenolol, Lux Cellulose-1 ĐẶT VẤN ĐỀ Các đồng phân đối quang có thể khác nhau về tính chất dược động học, dược lý học hay độc tính. Không hiếm các trường hợp chỉ một đối quang có hoạt tính trong khi đối quang kia lại gây độc cho cơ thể. Trong hướng dẫn của FDA (Mỹ), MHW (Nhật) hay EMEA (châu Âu) đều nhấn mạnh việc tách riêng các đối quang và đánh giá sự đóng góp của mỗi đối quang tới tác dụng của thuốc. Điều này cho thấy việc tách đồng phân quang học đang trở thành một xu hướng, và thực tế, nó là một trong những vấn đề được quan tâm nghiên cứu hàng đầu trong lĩnh vực kiểm nghiệm dược phẩm (1,2,5). Atenolol là chất thuộc nhóm chẹn beta, do cấu trúc của atenolol có carbon bất đối nên chúng có hai đồng phân đối quang. Hai đối quang của atenolol là (S)-atenolol và (R)- atenolol, trong đó chỉ có dạng (S) là dạng có hoạt tính. Mặt khác, sự hiện diện của dạng (R) còn gây tác dụng phụ. Các biệt dược của atenolol trên thị trường phần lớn là dạng racemic. Tuy nhiên, do dạng đồng phân (S) có hoạt tính mạnh hơn dạng racemic, nên hiện nay cũng đã xuất hiện các chế phẩm dạng đồng phân riêng lẻ trên thị trường. Tiếp theo công trình nghiên cứu về lĩnh vực tách đồng phân quang học, trong bài báo này, chúng tôi giới thiệu kết quả phân tích đồng phân quang học (S)-atenolol bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Đối tượng nghiên cứu Viên nén atenolol STADA (atenolol 50 mg). Viên nén (S)-atenolol 25 mg (Nhà sản xuất: Emcure pharm Ltd. India). Trang thiết bị, hóa chất, dung môi Trang thiết bị Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao SHIMADZU UFLC 20A, Detector Diod Array SPD-20AD. Cột Lux Cellulose-1 (cellulose tris(3,5- dimethylphenyl carbamat) (250 x 4,6 mm; 5 μm). Cột Lux Cellulose-2 (cellulose tris(3-cloro-4- methylphenyl carbamat) (250 x 4,6mm; 5 μm). Cột Lux Amylose-2 (amylose tris(5-cloro-2- methylphenyl carbamat) (250 x 4,6mm; 5 μm). Cân phân tích điện tử Mettler Toledo AT200, bể siêu âm Hwashin, bình định mức, pipet chính xác, ống đong, cốc có mỏ,... Các thiết bị phân tích và dụng cụ phân tích đã được hiệu chuẩn đạt quy định theo GLP và ISO/IEC 17025. Hóa chất, dung môi n-Hexan, 2-propanol (IPA), ethanol (EtOH), diethylamin (DEA): dùng cho HPLC (J.T.Baker). Chất chuẩn Atenolol: Viện Kiểm nghiệm thuốc TPHCM, số lô QT163 010515, hàm lượng 98,47%. (S)-Atenolol: Sigma-Aldrich, số lô 330892, hàm lượng 99,0%. Phương pháp nghiên cứu Thay đổi thành phần và tỉ lệ pha động, nhằm chọn được điều kiện phân tích đáp ứng các yêu cầu với các thông số: hai pic đồng phân phải tách nhau hoàn toàn với độ phân giải Rs > 1,5; đáp ứng đầu dò cao, hệ số bất đối As của pic nằm trong khoảng 0,8 - 1,5, Sau khi tìm được điều kiện phân tích thích hợp, tiến hành thẩm định quy trình phân tích bao gồm: khảo sát tính phù hợp của hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến tính, giới hạn phát hiện, độ chính xác và độ đúng(4). Chuẩn bị mẫu Dung dịch mẫu chuẩn atenolol (500 μg/ml): Cân chính xác khoảng 25 mg atenolol chuẩn, cho vào Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2018 402 bình định mức 50 ml, thêm khoảng 35 ml methanol, siêu âm 5 phút, lắc đều, để nguội, thêm methanol đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc PTFE 0,45 μm. Dung dịch mẫu chuẩn (S)-atenolol (250 μg/ml): Cân chính xác khoảng 5 mg (S)-atenolol chuẩn, cho vào bình định mức 20 ml, thêm khoảng 10 ml methanol, siêu âm 5 phút, lắc đều, để nguội, thêm methanol đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc PTFE 0,45 μm. Dung dịch mẫu thử (S)-atenolol: Cân 20 viên (S)-atenolol, xác định khối lượng trung bình viên. Nghiền 20 viên thành bột mịn, cân lượng bột viên tương ứng với khoảng 25 mg (S)- atenolol, cho vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 50 ml methanol, siêu âm 5 phút, lắc đều, để nguội, thêm methanol vừa đủ đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc PTFE 0,45 μm. Dung dịch mẫu thử atenolol: Cân 20 viên atenolol, xác định khối lượng trung bình viên. Nghiền 20 viên thành bột mịn, cân lượng bột viên tương ứng với khoảng 50 mg atenolol, cho vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 50 ml methanol, siêu âm 5 phút, lắc đều, để nguội, thêm methanol vừa đủ đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc PTFE 0,45 μm. Dung dịch mẫu placebo: chuẩn bị như dung dịch mẫu thử nhưng thay lượng bột thuốc bằng lượng tá dược tương ứng trong mẫu thử (viên nén atenolol). Dung dịch mẫu trắng: Dung môi hòa tan mẫu là methanol. KẾT QUẢ Khảo sát điều kiện sắc ký Bảng 1. Các điều kiện sắc ký khảo sát (3). Pha động Cột sắc ký Điều kiện 1 n-hexan-EtOH (80:20) Cột Lux Amylose-2 Điều kiện 2 n-hexan-EtOH (80:20) Cột Lux Cellulose-2 Điều kiện 3 n-hexan-EtOH (80:20) Cột Lux Cellulose-1 Điều kiện 4 n-hexan-EtOH-DEA (80:20:0,1) Cột Lux Cellulose-2 Điều kiện 5 n-hexan- EtOH-DEA (80:20:0,1) Cột Lux Cellulose-1 Nhận xét: Điều kiện 1, 2, 3 và 4: không phân biệt được các dạng đồng phân. Điều kiện 5: hai pic đồng phân tách hoàn toàn với RS = 3,89 (pic 1 có thời gian lưu 9,92 phút và pic 2 có thời gian lưu 12,80 phút).Như vậy, điều kiện thích hợp để phân tách đồng phân quang học atenolol là: Cột sắc ký Lux Cellulose-1 (250 x 4,6 mm; 5 μm). Pha động n-hexan-EtOH- DEA (80:20:0,1). Tốc độ dòng: 1 ml/phút. Nhiệt độ cột: 30 oC. Thể tích tiêm mẫu: 20 μl. Bước sóng phát hiện: 220 nm (Hình 1). Thẩm định phương pháp Khảo sát tính phù hợp hệ thống Bảng 2. Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống của phương pháp (n=6). Chuẩn (S)-atenolol Chuẩn atenolol Rt (phút) %RSD (Rt) % RSD (S) As Rt (phút) %RS D (Rt) % RSD (S) As Rs Pic 1 9,922 0,09 0,13 1,2 3,9 Pic 2 12,74 2 0,14 0,39 1,5 12,80 9 0,07 0,10 1,3 Kết quả thống kê cho thấy, sau 6 lần sắc ký thông số thời gian lưu (Rt) và diện tích pic (S) của mỗi pic đồng phân có RSD < 2%; giá trị độ phân giải (RS) lớn hơn 1,5 và hệ số đối xứng (AS) nằm trong khoảng 0,8 - 1,8, Vậy phương pháp đạt tính phù hợp hệ thống. Tính đặc hiệu Tiến hành sắc ký mẫu trắng, mẫu đối chiếu và mẫu thử. Kết quả cho thấy mẫu trắng không có pic trùng với pic chất phân tích. Thời gian lưu của pic chính trong mẫu thử tương ứng với thời gian lưu của pic chính trong mẫu chuẩn (S)-atenolol. Khi thêm chuẩn (S)-atenolol vào mẫu chuẩn atenolol thì diện tích pic (S)-atenolol (pic có thời gian lưu khoảng 12,8 phút) tăng cao so với ban đầu. Phổ tử ngoại tại thời gian di chuyển của các pic trong mẫu thử giống phổ tử ngoại của mẫu chuẩn. Độ tinh khiết của các pic lớn hơn 99%. Hai pic của hai dạng đồng phân có phổ UV giống nhau. Vậy phương pháp có tính đặc hiệu. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 3 * 2018 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2018 403 Điều kiện 1 (mẫu chuẩn atenolol) Điều kiện 2 (mẫu chuẩn atenolol) Điều kiện 3 (mẫu chuẩn atenolol) Điều kiện 4 (mẫu chuẩn atenolol) mẫu chuẩn atenolol mẫu chuẩn (S)-atenolol Điều kiện 5 Hình 1. Các sắc ký đồ khảo sát điều kiện sắc ký. Hình 2 Sắc ký đồ của atenolol (mẫu chuẩn atenolol) Hình 3 Sắc ký đồ của chuẩn atenolol + chuẩn (S)- atenolol Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2018 404 Hình 4. Sắc ký đồ của (S)-atenolol (mẫu chuẩn) Hình 5. Sắc ký đồ của (S)-atenolol (mẫu thử) Hình 6. Sắc ký đồ của mẫu trắng(Placebo) Khoảng tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại và giới hạn phát hiện Bảng 3. Phương trình hồi quy, khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện. Mẫu chuẩn atenolol Mẫu chuẩn (S)-atenolol (R)-atenolol (S)-atenolol Phương trình hồi qui y = 36254 x r = 0,9999 y = 6340 x r = 0,9999 y = 36363 x r = 0,9999 Khoảng tuyến tính 25 - 1000 µg/ml Giới hạn phát hiện 0,1 µg/ml 0,1 µg/ml 0,1 µg/ml Nhận xét: kết quả thống kê cho thấy quy trình phân tích có khoảng tuyến tính rộng với hệ số tương quan cao. Độ lặp lại, độ chính xác trung gian và độ đúng Bảng 4. Kết quả khảo sát độ lặp lại và độ chính xác trung gian. Số lần Hàm lượng nhãn (mg) Ngày 1 Ngày 2 Diện tích (S)-atenolol Hàm lượng (%) Diện tích (S)-atenolol Hàm lượng (%) 1 50 8520666 97,98 8546438 98,21 2 8510447 97,93 8524867 98,94 3 8507666 98,10 8526652 98,04 4 8529722 97,71 8557384 97,99 5 8524258 98,12 8630053 97,58 6 8522024 98,05 8567671 97,37 TB 97,98 98,02 RSD (%) (n = 6) 0,15 0,56 RSD (%) (n = 12) 0,39 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 3 * 2018 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2018 405 Bảng 5. Kết quả khảo sát độ đúng. Tỷ lệ chất chuẩn thêm vào (%) Lượng (S)-atenolol có sẵn (µg/ml) Lượng (S)-atenolol thêm vào (µg/ml) Diện tích pic Lượng tìm lại ( µg/ml) Tỷ lệ phục hồi (%) 80 122,54 98,21 8073610 98,13 99,92 122,53 98,21 8068921 98,01 99,80 122,51 98,21 8100476 98,89 100,70 100 122,75 122,76 9016724 123,70 100,76 122,37 122,76 8937105 121,90 99,30 122,61 122,76 9007193 123,58 100,67 120 122,57 147,32 9860928 146,95 99,75 122,42 147,32 9875210 147,49 100,12 122,51 147,32 9879384 147,52 100,13 Trung bình 99,31 RSD% 0,43 Nhận xét: Phương pháp phân tích đạt độ đúng với tỷ lệ phục hồi nằm trong khoảng cho phép 98%-102%. BÀN LUẬN Với sắc ký pha thuận sử dụng pha tĩnh bất đối, dung môi không phân cực như n-hexan chứa một alcol như ethanol hay IPA thường được sử dụng. Vai trò của alcol là cạnh tranh với atenolol để gắn với pha tĩnh bất đối nhờ khả năng tạo liên kết hydro. Để tách các chất có nhóm acid, một lượng nhỏ các acid như DEA cũng được thêm vào pha động để làm giảm thời gian lưu, tăng độ phân giải cũng như giảm hệ số kéo đuôi. Ngoài ra, sự có mặt của DEA sẽ tăng khả năng tách đối quang vì nó có tác dụng ngăn sự kết hợp của các đối quang. KẾT LUẬN Bằng phương pháp HPLC sử dụng pha tĩnh bất đối, chúng tôi đã tiến hành xây dựng và thẩm định quy trình phân tích đồng phân quang học (S)-atenolol, với các điều kiện như sau: cột sắc ký Lux Cellulose-1, chiều dài 250 mm, đường kính trong 4,6 mm, kích thước hạt 5 μm. Pha động là hệ dung môi n-hexan-EtOH-DEA (80:20:0,1, v/v/v), tốc độ dòng 1 ml/phút, nhiệt độ 30 oC, thể tích tiêm mẫu 20 μl, bước sóng phát hiện 220 nm. Quy trình này có tính đặc hiệu, độ chính xác và độ lặp cao. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Alberto C., Luisa P., Alessandro M., Nicola M., Francesco D. (2011), “Recent applications in chiral high performance liquid chromatography: A review”, Analytica Chimica Acta, 706, pp.205- 222, 2. Caner H., Groner E., Levy L., Agranat I. (2004), “Trends in the development of chiral drugs”, Drug Discov. Today, 9(3), 105, 3. Dongmei W., Fang L., Zhen J., Li Y., and Xingjie G.o (2014),” Chiral Recognition Mechanisms of four β-Blockers by HPLC with Amylose Chiral Stationary Phase”, Iran J Pharm Res, 13(2), pp.449-45, 4. ICH Harmonised tripartite guideline (2005), Validation of analytical procedures: text and methodology, pp.1-13, 5. Landoni MF, Soraci A. (2001), “Pharmacology of Chiral Compounds: 2-Arylpropionic Acid Derivatives”, Current Drug Metabolism, 2, 37-51, Ngày nhận bài báo: 03/02/2018 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 02/03/2018 Ngày bài báo được đăng: 20/04/2018