Phân lập, xác định đặc tính và nhận diện các vi khuẩn nội sinh cây mía (Saccharum Officinarum L.) trồng ở tỉnh Tây Ninh

TẠP CHÍ KHOA HỌC ĐẠI HỌC SÀI GÒN Số 12 (37) - Tháng 2/2016 108 Phân lập, xác định đặc tính và nhận diện các vi khuẩn nội sinh cây mía (Saccharum Officinarum L.) trồng ở tỉnh Tây Ninh Isolation, characterization and identification of endophytic bacteria in sugarcane (Saccharum Officinarum L.) cultivated on soils of Tay Ninh province SV. Nguyễn Thị Thu Hằng (1) ThS. Đặng Thị Ngọc Thanh (2) (1), (2)Trường Đại học Sài Gịn St. Nguyen Thi Thu Hang (1) M.S. Dang Thi Ngoc Thanh (2) (1), (2) Sai Gon University Tĩm tắt T ười a u rễ à ười a u h n c y a r ng ại a huy n h u Thành Tr ng àng à T n i n c a nh T y Ninh h n ư c y ư i ịng i hu n n i inh r n i rường G h ng ạ . h n n c c ịng i hu n hu ư c c hu n ạc ạng rịn a nguy n n i ch hư c – . Đa c c à c ạng u ng n à h n ng chuy n ng. T c c c ịng hu ư c c h n ng c ịnh ạ hịa an n h an à inh ng h . ịng i hu n HT h hi n c a ặc nh n u r n n n ư c uy n chọn nh n i n ằng hư ng h inh học h n ử. K u gi i r nh ự h n g n h a 16S r N à nh i c ở ữ i u c a N ằng c ng cụ a n ch h y ịng HT c ự ư ng ng 96% i a ry r uca n i ài i hu n c h n ng húc y ng rưởng hực ư c c . Từ khĩa: cây mía, cố định đạm, hịa tan lân, vi khuẩn thúc đẩy tăng trưởng thực vật, tổng hợp IAA, vi khuẩn nội sinh Abstract Endophytic bacteria in sugarcane plant cultivated on soils of Tay Ninh province were isolated and characterized. Sugarcane materials were collected from three districts of this province including Chau Thanh, Trang Bang, and Tan Bien. There were 75 bacterial isolates that were isolated in N free medium LGI. The majority of their colonies are round-shaped, climy, smooth, colourless or milk-color, with size about 0.5-5.0 mm. Cells often have short rod-shape and most of them have motility. All of them have ability of nitrogen fixation, and phosphate solubilization together with IAA biosynthesis. The best isolate HTR8 was selected to sequencing 16S rRNA gene fragment. This isolate showed a high degree of similarity (96%) to reference strain Labrys portucalensis train F11 of the GenBank of NCBI, and one potential Plant Growth Promoting Bacteria has recently been reported. Keywords: endophytic bacteria, IAA biosynthesis, nitrogen fixation, phosphate solubilization, Plant Growth Promoting Bacteria... 109 1. Đặt vấn đề Đường giữ vai trị quan trọng trong kh u ph n n hằng ngày c a c n người. Đường ư c n u a nguy n i u hi n chi h n 6 % ng s n ư ng ường thơ c a tồn th gi i. Vi t Nam, cây mía ư c tr ng ở nhiều ịa hư ng. Tr ng Tây Ninh là t nh cĩ di n tích tr ng mía l n nh t khu vực Đ ng Na . Tuy nhiên, t n 2 1 n n 2 13 i n tích tr ng mía c a t nh này gi m t 25,5 nghìn ha xu ng cịn 22,3 nghìn ha (T ng cục th ng kê Vi t Nam, 2015). M t trong những cách hường ư c sử dụng uy r n ng u t và s n ư ng à ng cường bĩn phân hĩa học ch c y. ư ng h n ạm hĩa học hường ư c n ng n c c nư c sử dụng là 2 g N/ha/n h ặc th ch n n 400 - g N/ha/n (H ang Minh Ta và Cao Ngoc Diep, 2014). Bĩn phân khơng c n i, h p lý sẽ gây tình trạng v a th a v a thi u inh ưỡng cho cây tr ng, gây hi n ư ng chai cứng, gi phì, và thay i tính ch t v t lý, hĩa học và sinh học c a t tr ng ng thời cịn gây nh hưởng x u n i rường và sức khỏ c n người ( hạ V n T n à Trư ng H T c, 2004). Do v y ngày nay u hư ng tìm ki m các ch ng vi khu n c ch r ng cĩ các vi khu n n i sinh, nhằm ứng dụng như c c ch ph m giúp b sung hoặc thay th m t ph n phân bĩn hĩa học cho cây tr ng ư c chú trọng. Vi khu n n i sinh tr i qua ph n l n ịng ời trong cây ch . Chúng t p trung bên trong t bào, kho ng gian bào hay h th ng mạch mà khơng gây b nh hoặc b t kỳ h u qu tiêu cực nà i v i cây ch (Cao Ngọc Đi p, 2011). Nhiều lồi vi khu n n i inh ã ư c phân l p t c y a như Gluconacetobacter diazotrophicus, Herbaspirillum sp., Pantoea sp., Burkholderia vietnamiensis, B. unamae, B. silvatlantica . c i hu n này cĩ kh n ng húc y ng rưởng thực v t thơng ua c c c ch trực ti p hay gián ti như c ịnh ạm, hịa tan lân, t ng h p IAA, v.v... (Hoang Minh Tam và Cao Ngoc Diep, 2014) Nghiên cứu này nhằm tìm ki m và ư c u nh n di n các dịng vi khu n n i inh c y a c c c ặc tính t . Đ y à c c dịng vi khu n b n ịa cĩ tiề n ng ứng dụng trong s n xu t phân bĩn vi sinh chuyên dùng cho cây mía c a ịa hư ng. 2. Vật liệ 2.1. Khử trùng mẫu và phân lập vi khuẩn c u thân và rễ c a cây mía (Saccharum officinarum L.) r ng giai ạn v a tr cờ ư c thu th p ở các ru ng mía tại 13 xã thu c 3 huy n Châu Thành, Tr ng Bàng và huy n Tân Biên c a t nh Tây Ninh. M u ư c ti n hành khử trùng qua các giai ạn như c a Hoang Minh Tam và Cao Ngoc Diep (2014) v i sự ng n ng c n n 96º cũng như ng hời gian khử m u và xác nh n hi u qu khử trùng qua ki ra nư c rửa cu i r n i rường TYGA (Tryptone Yeast Glucose Agar). M u sau khi khử trùng bề mặ hành c ng ư c ti n hành thu l y dịch chi t và ch ng vào i rường LGI (Cavalcante và Dưbereiner, 1988) kh ng ạ n ặc. Sau 24 – 48 giờ , sự xu t hi n c a màng mỏng (pellicle) cách bề mặ i rường 1 – 4 mm chứng tỏ cĩ sự hi n di n c a vi khu n n i sinh. C y ria l p dịch này ang i rường G ặc và ti p tục c y chuy n ch n hi hu ư c các khu n lạc th t sự thu n nh ưu rữ, b o qu n như c c ịng h n p (isolates) theo mơ t c a Cao Ngọc Đi p (2011). 2.2. Xác định đặc tính khuẩn lạc và tế bào Mơ t ặc i m hình thái khu n lạc và 110 t bào theo Cao Ngọc Đi p (2011) và Tr n inh Thư c và ctv. (2001). X c ịnh Gram c a c c ịng hu ư c bằng hư ng h nhu m Gram theo Nguyễn Đức ư ng và ctv. (2003) k t h p v i ki m tra nhanh bằng hư ng h “KOH S ring T ” (von Graevenitz và Bucher, 1983). 2.3. Khảo nghiệm khả năng cố định đạm, hịa tan lân và tổng hợp IAA Các dịng mọc r n i rường phân l à G h ng ạ ư c c y chuy n ang i rường NBRIP chứa orthophosphate khĩ tan. Dịng nào phát tri n ư c trên c hai loại i rường này chứng tỏ cĩ kh n ng c ịnh ạm và hịa tan lân. Các dịng này ti p tục ư c nh giá kh n ng ng h p NH4 + trong mơi rường ur ’ ( ar à c 2 ) h ng ạm lỏng, kh n ng hịa an n h an r ng i rường NBRIP (Nautiyal, 1999) lỏng ng thời c ịnh kh n ng inh r ng i rường LGI lỏng cĩ b sung 100 mg tryptophan/L h c c hư ng pháp dựa trên ph n ứng màu k t h m uang như c a Hoang Minh Tam và Cao Ngoc Diep (2014). 2.4. Định danh dịng cĩ khả năng cố định đạm, hịa tan lân và tổng hợp IAA tốt nhất Chọn dịng vi khu n c ặc tính t t nh ịnh danh bằng gi i trình tự m t chiều g n 16S rRNA v i m i ng (universal primer) 27F (gửi m u cho Cơng ty Nam Khoa, Tp. H Chí Minh). 2.5. Phương pháp xử lý số liệu Dựa à hư ng r nh ư c chu n và trị s O ư c c ịnh ư ng NH4 + , P2O5 ( ư ng ư ng) à c r ng u. Tính tốn và xử lý th ng kê bằng Microsoft Excel 2010 và SPSS 16.0. Sử dụng chư ng r nh a n c a N so sánh trình tự 16S r N gi i v i các trình tự c r ng c ở dữ li u c a GenBank. Tìm dịng cĩ ch s ư ng ng cao, t uy n n ài c a dịng vi khu n uy n chọn. 3. Kết quả và thảo luận 3.1. Phân lập vi khuẩn nội sinh Vi khu n n i sinh cĩ trong dịch chi t các m u c y a hử trùng bề mặt phát tri n trong c i rường LGI bán ặc tạo thành màng mỏng như c a Perin và ctv. (2006), Nguyễn Thị Thu Hà và ctv. (2009) (Hình 1). Sau hi ư c c y chuy n ang i rường G h ng ạm ặc và làm thu n, các dịng vi khu n ư c ti p tục c y ché ang i rường NBRIP ặc chứa orthophosphate. K t qu hu ư c là 75 dịng vi khu n cĩ cùng lúc hai kh n ng c ịnh ạ à hịa an n.Tr ng cĩ 46 dịng cĩ ngu n g c t rễ mía (61,33%) và 29 dịng cĩ ngu n g c t (38,67%). Nhiều tác gi khác khi nghiên cứu vi khu n n i inh cũng nh n th y s dịng vi khu n n i sinh phân l ư c t rễ hường nhiều h n i phân l p t thân c y iều này ng h m t trong những gi thuy t về ngu n g c vùng rễ (rhizophere) c a vi khu n n i sinh (Rosenblueth và Martínez-Romero, 2006). Hình 1. Vi khuẩn nội sinh phát triển trên mơi trường LGI bán đặc (B) và đối chứng âm gồm dịch chiết từ mẫu mơ mía đã hấp tiệt trùng (A) 111 3.2. Đặc tính khuẩn lạc và tế bào Về hình thái khu n lạc a các dịng vi khu n phân l ư c cĩ dạng trịn (90,67%), s cịn lại cĩ dạng h ng ều (9,33%). Khu n lạc cĩ màu tr ng ục chi m 38,67%, màu tr ng trong chi m 25,33%, màu tr ng ngà chi m 28% và màu là vàng nhạt chi m 8%. Đa các dịng thu ư c tạo khu n lạc cĩ dạng bìa nguyên (92%) à n imơ (96%), cịn lại là dạng a r ng cưa ( %) à n i lài (4%). Đường kính khu n lạc c a các dịng thu ư c nằm trong kho ng t 0,5 n 5 mm (Hình 2). Hình 2. Hình thái khuẩn lạccủa một số dịng vi khuẩn nội sinh Qua uan ư c ư i kính hi n vi quang học, nh n th y ch y u các dịng cĩ t bào hình que ng n, nhỏ và t t c ều cĩ kh n ng chuy n ng. Qua k t qu ki m tra Gram cho th y các dịng Gram (-) chi m 56% và Gram (+) chi m 44% (Hình 3). K t qu này ư ng ự như c c t qu nghiên cứu vi khu n n i sinh trong m t s cây m t lá m h c như h (Nguyễn Thị Thu Hà và ctv., 2009), các loại cỏ ch n nuơi (Cao Ngọc Đi p và Nguyễn Ái Chi, 2009), ngơ (Dang Thi Ngoc Thanh và Cao Ngoc Diep, 2014) và vi khu n n i sinh cây mía tr ng ở t nh Đ ng Nai (Hoang Minh Tam và Cao Ngoc Diep, 2014). Hình 3. Kết quả nhuộm Gram của một số dịng vi khuẩn nội sinh 3.3. Khả năng cố định đạm, hịa tan lân và tổng hợp IAA B ng 1 au y r nh ày ề ngu n g c và kh n ng c ịnh ạm, hịa tan lân và sinh t ng h p IAA c a 10 dịng t t nh t trong s 75 dịng vi khu n n i sinh cây mía hân l ư c. Bảng 1. Kết quả định lượng sự cố định đạm, hịa tan lân và tổng hợp IAA của 10 dịng vi khuẩn nổi trội STT Dịng vi khuẩn Nguồn gốc NH4+ (mg/L)* P2O5 (mg/L)* IAA (mg/L)* 1 CT4 Th n n - Châu Thành 1,507 e 57,892 a 18,212 b 2 DR2 Rễ, H o Đức - Châu Thành 1,248 f 40,687 c 9,019 f 3 KT1 Th n Đ ng Khởi - Châu Thành 1,625 d 42,458 c 5,562 gh 112 4 KT2 Th n Đ ng Khởi - Châu Thành 1,059 g 30,170 d 17,450 c 5 LT2 Thân, Thành Long - Châu Thành 1,465 c 22,887 e 10,307 d 6 TVT1 Thân, Trà Vong - Tân Biên 2,079 b 46,639 b 6,304 g 7 TVT4 Thân, Trà Vong - Tân Biên 1,197 fg 41,625 c 5,296 h 8 TDT8 Thân, Thạnh Đ ng - Tân Biên 1,207 fg 26,870 d 5,929 gh 9 GBR5 Rễ, Gia Bình - Tr ng Bàng 0,254 h 61,315 a 10,413 e 10 HTR8 Rễ Hưng Thu n - Tr ng Bàng 2,654 a 58,417 a 18,836 a 11 Đ i chứng 0,000 i 0,000 f 0,000 i CV (%) 6,391 5,911 5,050 *Số liệu trình bày trong bảng là bình quân của 4 đợt đo mẫu với 3 lần lặp: 2, 4, 6, 8 ngày sau khi cấy đối với NH4 + và IAA; 5, 10, 15, 20 ngày sau khi chủng đối với P2O5. Những số (trong cùng một cột) được theo sau bởi cùng chữ cái khơng cĩ sự khác biệt ý nghĩa ở mức 5%. Qua nh n th y ư ng ạm c ịnh c a 10 dịng t t nh a ng t 0,254 – 2,654 mg/L NH4 + ư ng lân hịa tan trong kho ng 22,87 – 61,315 mg/ L P2O5 và ư ng ạt t 296 – 1 36 g/ . Những ịng ch u ịnh ư ng ca ề c a ch i u g c HT TVT1 T à G (H nh ). c t qu ịnh ư ng hu ư c ư ng ự như u nghi n cứu c a m t s tác gi ti n hành trên i ư ng vi khu n n i sinh cây mía (Ngơ H ng Thanh và ctv., 2014; Hồng Minh Tâm và Cao Ngọc Đi p, 2014; Hoang Minh Tam và Cao Ngoc Diep, 2014) và m t s cây tr ng h c như à u nành (Glycine max .) à ng (Zea mays L.) (Cassán và ctv., 2009; Szilagyi-Zecchin và ctv., 2014). Th ng ua c c c ch c ịnh ạm, hịa tan phosphate và t ng h nhiều i khu n n i inh h hi n h n ng húc y ng rưởng thực v ở c c ài Pachycereus pringlei, Chlorella vulgaris, . ư c thơng báo (Puente và ctv., 2009; de-Bashan và ctv., 2008, Ryan và ctv., 2008;). Hình 4. Phản ứng màu với thuốc thử của một số dịng vi khuẩn nổi trội khi đo lượng lân hịa tan vào 5 DAI (day after inoculation) 113 3.4. Kết quả giải trình tự một phần đoạn gen 16S rRNA của dịng vi khuẩn HTR8 Dịng HTR8 cĩ ngu n g c t rễ cây mía tr ng tại Hưng Thu n, huy n Tr ng Bàng th hi n t t c 3 ặc nh n u r n ư c tuy n chọn ti p tục nh n di n bằng hư ng h inh học phân tử. K t qu gi i trình tự m t ph n ạn gen 16S rRNA à ị ịng ư ng ng c r ng c ở dữ li u c a NCBI cho th y dịng HTR8 cĩ sự ư ng ng 96% v i ch ng vi khu n Labrys portucalensis F11 (Hình 5). Labrys portucalensis là m t Proteobacteria cĩ hình que và thu c nhĩm Gram âm phù h p v i k t qu kh o sát hình thái và nhu m Gram c a dịng HTR8. Hình 5. Kết quả dị tìm dịng tương đồng trình tự một phần gen 16S rRNA của dịng HTR8 Nhiều lồi m i trong chi Labrys ư c phân l p t rễ cây tr ng ở nhiều nư c (Islam và ctv., 2007; Nguyen và ctv., 2015). M i y Inui-Kishi và ctv. (2012) ề c p về kh n ng hịa an h ha và t ng h p IAA khá t t c a m t dịng trong t ng s 60 dịng vi khu n à nh c gi ư c phân l p t vùng rễ cây mía tr ng tại Brazil ịng này ư ng ng r nh ự 16S r N v i i hu n Labrys portucalensis. 4. Kết luận Cĩ 75 dịng vi khu n n i sinh phân l p ư c t rễ và thân cây mía tr ng tại t nh T y Ninh. Tr ng ịng i hu n HTR8 c ư ng ạm c ịnh ư ng lân hịa tan và ư ng IAA sinh ra cao nh . n cứ vào các k t qu gi i trình tự ạn gen 16S rRNA và ị ịng ư ng ng, cĩ th xem HTR8 như i hu n Labrys portucalensis(gi ịnh). Dịng vi khu n này cĩ tiề n ng ứng dụng như t vi khu n ch h ch ng rưởng thực v t cho cây mía. TÀI LIỆU THAM KHẢO A. Tài liệu tham khảo tiếng Việt 1. Cao Ngọc Đi p và Nguyễn Ái Chi (2009), “Phân l à ặc tính vi khu n n i sinh cây khĩm (Ananas comosus L.) tr ng r n t phèn huy n B n Lức, t nh Long An” Tuyển tập hội nghị Cơng nghệ sinh học phía Nam năm 2009, tại thành ph H Chí Minh t ngày 23-2 h ng 1 n 2 9. 2. Cao Ngọc Đi p (2011), Sách chuyên khảo Vi khuẩn nội sinh thực vật, Nxb Đại Học C n Th n Th . 3. Nguyễn Thị Thu Hà, Hà Thanh Tồn và Cao Ngọc Đi p (2009), “Phân l à ặc tính c a vi khu n n i sinh ở m t s loại cỏ ch n nu i” Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 7(2): 241-250. 4. Nguyễn Đức ư ng, Phan Thị Huyền à Nguyễn Ánh Tuy t (2003), Thí nghiệm cơng nghệ sinh học (t p 2): Thí nghiệm vi sinh vật học, Nxb Đại học Qu c gia, Tp. H Chí Minh. 5. Hồng Minh Tâm và Cao Ngọc Đi p (2014), “X c ịnh ặc tính và nh n di n vi khu n n i sinh Gluconacetobacter diazotrophicus trong cây mía ở hai t nh B n Tre và Long An” Tạp chí Nơng nghiệp và Phát triển nơng thơn 24: 68-74. 6. Ngơ H ng Thanh, Hồng Minh Tâm và Cao Ngọc Đi p (2014), “X c ịnh tính vi khu n n i sinh trong cây mía tr ng ở t nh B n Tre và Long An” Tạp chí Nơng nghiệp và Phát triển Nơng thơn. 2:41-48. 114 7. Tr n inh Thư c Nguyễn Đức H àng han Thị hư ng Trang à hạ Thị H ng Tư i (2001), Thực tập vi sinh vật học, Nxb Ðại học Qu c gia, Tp. H Chí Minh. 8. hạ V n T n à Trư ng H T c (2 ), hân n vi sinh trong n ng nghiệp N N ng nghi Hà N i. 9. T ng cục th ng kê Vi t Nam (2015), (https:// www.gso.gov.vn/Default.aspx?tabid=217) B. Tài liệu tham khảo tiếng Anh 10. Cassán F., Perrig D., Sgroy V., Masciarelli O., Penna C., and Luna V. (2009), “Azospirillum brasilense Az39 and Bradyrhizobium japonicum E109, inoculated singly or in combination, promote seed germination and early seedling growth in corn (Zea mays L.) and soy bean (Glycine max .)” Eur. J. Soil Biol, 45:28-35. 11. Cavalcante V.A., and Dưbereiner J. (1988), “ n w aci -tolerant nitrogen-fixing ac riu a cia wi h ugarcan ” Plan and Soil 108: 23-31. 12. Dang Thi Ngoc Thanh and Cao Ngoc Diep (2 1 ) “ a i n charac riza i n an identification of endophytic bacteria inmaize (Zea mays L.) cultivated on acrisols of the Southea f Vi na ” American Journal of Life Sciences. 2(4): 224-233. (Published online: Aug. 30, 2014. DOI: 0.11648/j.ajls. 20140204.16). 13. De-Bashan L.E., Antoun H., and Bashan Y. (2 ) “ n n f in -3-acetic acid produced by the growth-promoting bacterium Azospirillum ” in r ing growth of Chlorella vulgaris. J. Phycol.44: 938-947. 14. Hoang Minh Tam and Cao Ngoc Diep (2014), “ a i n charac riza i n an i n ification of endophytic bacteria in sugarcane (Saccharum spp. L.) cultivated on soils of the ng Nai r inc S u h a f Vi na ” American Journal of Life Sciences. 2(6): 361- 368. (Published online: Dec. 18, 2014. DOI: 10.11648/j.ajls.20140206.16) 15. Inui-Kishi R.N., Kishi L.T., Picch S.C., Barbosa J.C., Lemos M.T.O., Marcondes J., and de Macedo Lemos E.G. (2012), “ h h ru u i izing an production activities inplant growth promoting rhizobacteria from brazilian soils un r ugarcan cu i a i n” ARPN Journal of Engineering and Applied Sciences 7(11): 1446- 1454. 16. Islam M.S., Kawasaki H., Nakagawa Y. , Hattori T., Seki T. (2007), Labrys okinawensis sp. nov. and Labrys miyagiensis sp. nov., budding bacteria isolated from rhizosphere habitats in Japan, and emended descriptions of the genus Labrys and Labrys monachus. Int J Syst Evol Microbiol, 57: 552-557. 17. Nautiyal C.S. (1999), “ n ffici n microbiological growth medium for screening phosphate solubilizing icr rgani ” FEMS Microbiology Letters. 170: 265-270. 18. Nguyen N.L., Kim Y.J., Hoang V.A., Kang J.P., Wang C., Zhang J., Kang C.H., and Yang D.C. (2015), Labrys soli sp. nov., isolated from the rhizosphere of Korean ginseng. Int J Syst Evol Microbiol. (Published online:Aug 5. DOI: 10.1099/ijsem.0.000512) 19. Park M., Kim C., Yang J., Lee H., Shin W., Ki S. an Sa T. (2 ) “ a i n an characterization of diazotrophic growth promoting bacteria from rhizosphere of agricu ura cr f K r a” Microbiological Research. 160: 127-133. 20. Perin L., Martínez-Aguilar L., Castro- González R., Estrada-de los Santos P., Cabellos-Avelar T., Guedes H.V., Reis V.M., and Caballero-Mellado J. (2006), “ iaz r hic Burkholderia species associated with field-grown maize and ugarcan ” Appl. Environ. Microbiol. 72: 3103-3110. 21. Puentea M.E., Li C.Y., Bashan Y. (2009), “En hy ic ac ria in cac i can improve the development of cactus see ing ” Environmental and Experimental Botany. 66: 402-408. 115 22. Rosenblueth M., and Martínez-Romero E. (2 6) “ ac ria n hy an h ir in rac i n wi h h ” Molecular Plant- Microbe Interactions.19:827-837. 23. Ryan R.P., Germanie K., Franks A., Ryan D.J., and Dowling D.N. (2008), “ ac ria n hy : r c n n an a ica i n ” FEMS Microbiol. Lett. 278:1-9. 24. Szilagyi-Zecchin V.J., Ikeda A.C., Hungria M. , Adamoski D., Kava-Cordeiro V., Glienke C., and Galli-Terasawa L.V. (2014), “Identification and characterization of endophytic bacteria from corn (Zea mays L.) roots with biotechnological potential in agriculture” AMB Express 4(26). (Published online: 7 May, DOI: 10.1186/ s13568-014-0026-y). 25. Von Gravenitz A., and Bucher C. (1983), Accuracy of the KOH and Vancomycin Tests in Determining the Gram Reaction of Non- En r ac ria ” J Clin Microbiol. 16(4):983-985. Ngày nh n bài: 12/01/2016 Biên t p xong: 15/02/2016 Duy t ng: 2 / 2/2016