Phân lập và tuyển chọn những chủng vi khuẩn lactic có tiềm năng probiotic - Phan Thị Thanh Diễm

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN NHỮNG CHỦNG VI KHUẨN LACTIC CÓ TIỀM NĂNG PROBIOTIC Phan Thị Thanh Diễm1 Tóm tắt: Vi khuẩn lactic có vai trò rất quan trọng trong cuộc sống của chúng ta. Chúng tạo ra các thực phẩm lên men và bảo quản thực phẩm khỏi bị hư hỏng. Ngoài ra chúng còn tạo ra các chế phẩm probiotic đáp ứng nhu cầu sức khỏe của con người. Từ các nguồn thực phẩm lên men khác nhau chúng tôi đã phân lập và tuyển chọn được bốn chủng vi khuẩn có khả năng sinh lactic acid cao đó là L1, L2, L4 và L6. Tiếp tục kiểm tra tiềm năng probiotic của các chủng trên cho thấy cả 4 chủng đều có khả năng đối kháng mạnh với E. coli và có khả năng sống sót trong điều kiện pH thấp. Trong đó L1 là chủng có tiềm năng probiotic cao nhất. Từ khóa: Vi khuẩn lactic, Probiotic. 1. Mở đầu Cùng với nhiều lĩnh vực khoa học phục vụ lợi ích của con người, cuộc cách mạng khoa học kỹ thuật đưa con người bước vào nền văn minh hiện đại. Khi những nhu cầu về vật chất được đáp ứng, con người ngày càng quan tâm đến sức khỏe của mình hơn. Vì vậy, con người đã và luôn đi tìm một sản phẩm hoàn thiện vừa chăm sóc và bảo vệ sức khỏe, vừa có thể là dược phẩm để trị liệu một số bệnh của thời đại. Probiotic là sản phẩm đáp ứng được các yêu cầu đó. Dù ngàn năm trước con người đã biết sử dụng probiotic như một thực phẩm bảo vệ sức khỏe nhưng vào những năm gần đây probiotic mới được đánh giá cao và nghiên cứu sâu hơn. Các nhà khoa học đã tìm ra hầu hết vi khuẩn lactic được sử dụng phổ biến trong những sản phẩm lên men thông thường để tạo ra các chế phẩm probiotic chất lượng phục vụ cho con người như: sữa uống Yakult, men vi sinh sống hỗ trợ điều trị bệnh rối loạn tiêu hóa Về mức độ an toàn thì probiotic luôn đứng ở vị trí đầu so với các phương thức khác, vì tác động của probiotic xuất phát từ cơ chế điều hòa tự nhiên, không gây nên bất cứ một sản phẩm phụ có hại nào hay một tác động xấu nào đến cơ thể sinh vật chủ. Tuy nhiên, để có được một chế phẩm probiotic thỏa mãn tất cả những yêu cầu được đặt ra với hoạt tính cao cần thiết, nhất định phải nói đến quá trình chọn lọc các chủng vi khuẩn có tiềm năng probiotic. Đây là bước cực kỳ quan trọng, bởi vì nó được xem là yếu tố quyết định vai trò, tác dụng của chế phẩm probiotic lên đối tượng cần quan tâm. Một chủng vi khuẩn có được xem là có khả năng sinh probiotic hay không phụ thuộc vào kết quả của khâu tuyển chọn này. Bài báo này trình bày một số kết quả phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có tiềm năng probiotic. 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1 . Vật liệu 1 . ThS. Khoa Lý-Hóa-Sinh, trường Đại học Quảng Nam - Các chủng vi khuẩn lactic từ các nguồn thực phẩm lên men như yaourt, dưa cải chua, men tiêu hóa sống có trên thị trường. - Môi trường phân lập, nuôi cấy, giữ giống và nghiên cứu các đặc tính của vi khuẩn lactic- Môi trường MRS: peptone: 10 g; cao thịt: 10 g; cao nấm men: 5 g; glucose: 10 g; Tween: 1ml; K2HPO4: 2 g; natrium acetate: 5 g; ammonium citrate: 2 g; MgSO4: 0,2 g; MnSO 4: 0,2 g; agar: 20g; nước cất thêm đủ: 1000 ml - Môi trường sơ chọn giống carbonate-agar: cao nấm men: 5 g; glucose: 20 g; CaCO3: 10 g; agar: 20g; nước cất: 1000 ml. - Môi trường lên men: glucose: 10 g; peptone: 10 g; cao thịt: 1 g; NaCl: 5 g; nước cất thêm đủ 1000 ml; pH: 7,4. - Môi trường nuôi cấy và giữ giống vi sinh vật kiểm định: cao thịt: 5 g; peptone: 5 g; NaCl: 5 g; agar: 20 g, nước cất thêm đủ 1000 ml. - Các hóa chất được mua từ Đức (Merck), Trung Quốc. 2.2 . Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp pha loãng và phân lập Dịch lên men được pha loãng bằng nước cất vô trùng theo sơ đồ ở Hình 1. Hình 1. Sơ đồ mô tả phương pháp pha loãng Dùng pipet vô trùng hút 0,1 ml dịch lên men ở các độ pha loãng khác nhau từ 10-1 đến 10-8, nhỏ lên môi trường MRS-agar pH=5,5; trong điều kiện kỵ khí và nhiệt độ nuôi ủ ở 370C. Sau 24- 48 giờ những khuẩn lạc phát triển trên môi trường đặc trưng về màu sắc, hình dạng và kích thước. 2.2.2. Chọn giống có khả năng sinh lactic acid bằng cách thử khả năng phân giải CaCO3 Sau khi phân lập trên môi trường MRS-agar, chọn những khuẩn lạc riêng lẻ, cấy ria trên môi trường carbonate-agar, nuôi cấy ở nhiệt độ phòng trong điều kiện kỵ khí. Sau 72 giờ chọn các chủng sinh lactic acid nhờ vào vòng trong suốt xuất hiện quanh khuẩn lạc. Vòng trong suốt càng lớn chứng tỏ lượng axít sinh ra càng nhiều. 2.2.3. Chọn giống có khả năng sinh lactic acid bằng thuốc thử Uphenmen Dùng que cấy vô trùng lấy các chủng vi khuẩn đã thuần khiết cấy vào bình tam giác chứa 20 ml môi trường MRS dịch thể, nuôi cấy tĩnh ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày. Sau đó dịch nuôi cấy được ly tâm 6000 vòng/phút trong 5 phút lấy dịch nuôi cấy để loại bỏ tế bào vi khuẩn, thu lấy dịch trong. Lấy 3 ml dịch cho vào ống nghiệm đã chứa sẵn 2 ml thuốc thử Uphenmen, quan sát sự đổi màu của thuốc thử. Tiến hành đồng thời 2 thí nghiệm đối chứng: - Đối chứng 1: 3 ml lactic acid 2% + 2 ml thuốc thử - Đối chứng 2: 3 ml MRS dịch thể không cấy vi khuẩn + 2 ml thuốc thử Quan sát sự đổi màu ở các ống nghiệm để xác định chủng vi khuẩn tạo ra lactic acid nhiều nhất. 2.2.4. Khảo sát đặc điểm nuôi cấy và hình thái khuẩn lạc của chủng tuyển chọn Cấy vi khuẩn phân lập được lên bề mặt môi trường MRS-agar sao cho tạo được những khuẩn lạc tách rời. Nuôi cấy ở nhiệt độ phòng, sau 72 giờ quan sát và mô tả đặc điểm của khuẩn lạc. Quan sát tế bào vi khuẩn lactic dưới kính hiển vi vật kính 40X, mô tả sơ bộ hình thái tế bào của các chủng nghiên cứu. 2.2.5. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có tiềm năng probiotic Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có đặc tính probiotic bằng cách tiến hành các thí nghiệm: kiểm tra khả năng sống sót trong pH thấp, kiểm tra khả năng đối kháng với vi sinh vật kiểm định, tạo chất kháng khuẩn. 2.2.5.1. Kiểm tra khả năng sống sót trong pH thấp Chuẩn bị môi trường MRS đã điều chỉnh pH từ 2, 3, 4 và 5 bổ sung 1 ml dịch vi khuẩn đã hoạt hóa, ủ kị khí ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ. Sau đó dịch nuôi cấy được ly tâm 4000 vòng trong 15 phút, thu lấy sinh khối, hòa với nước muối sinh lý và bổ sung đủ thể tích ban đầu đem ly tâm. Tiến hành đo mật độ quang ở bước sóng 610 nm. Ống đối chứng làm tương tự nhưng không chỉnh pH. 2.2.5.2. Kiểm tra khả năng đối kháng với vi sinh vật kiểm định bằng phương pháp khoan lỗ thạch. Các chủng vi khuẩn lactic đã tuyển chọn nuôi cấy trên môi trường MRS dịch thể ở 370C, sau 48 giờ ly tâm 5000 vòng/7 phút thu được dịch trong suốt. Vi sinh vật kiểm định nuôi trên môi trường MPA ở 300C, sau đó dùng khoan khoan lỗ thạch có đường kính d=10 mm. Hút 10 µl dịch trong suốt cho vào lỗ thạch đã khoan đặt trong tủ lạnh 40C, sau 12-24 giờ chuyển sang nuôi trong tủ ấm ở 300C trong 24 giờ. Kiểm tra vòng vô khuẩn. 3. Kết quả 3.1. Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic 3.1.1. Phân lập Từ các nguồn yaourt, nước dưa cải chua, sữa proby (men tiêu hóa sống) chúng tôi đã tiến hành phân lập trên môi trường MRS-agar và đã làm thuần được 7 chủng vi khuẩn có đặc tính probiotic ký hiệu từ L1-L7. Kết quả phân lập được trình bày ở Bảng 1. Bảng 1. Kết quả phân lập các chủng vi khuẩn lactic STT Nguồn phân lập Ký hiệu chủng 1 Yaourt L1 2 L2 3 Sữa chua proby L3 4 L4 5 L5 6 Dưa cải chua L6 7 L7 Để phân biệt được các chủng trên chúng tôi dựa vào sự khác nhau về hình dạng, màu sắc, kích thước của khuẩn lạc và hình thái của tế bào vi khuẩn. 3.1.2. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng sinh acid lactic Mục đích của thí nghiệm là tuyển chọn các chủng có khả năng sinh acid lactic, do đó chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng phân giải CaCO3, khảo sát đặc điểm nuôi cấy và hình thái khuẩn lạc của chủng tuyển chọn, khảo sát bằng phản ứng tạo acetaldehyt và thử phản ứng với thuốc thử Uphenmen để chọn ra các chủng có khả năng sinh axít mạnh. 3.1.2.1. Khả năng phân giải CaCO3 Với 7 chủng phân lập được và đã thuần khiết, chúng tôi tiến hành nuôi cấy trên môi trường thạch đĩa carbonate-agar. Sau 72 giờ nuôi cấy, nhận thấy rằng tất cả các chủng đều xuất hiện vòng phân giải trong suốt xung quanh khối tế bào vi khuẩn. Qua đó, ta thấy trong quá trình sinh trưởng phát triển chúng đã tạo ra acid lactic, mức độ sinh ra acid lactic của mỗi chủng là khác nhau. Kết quả thu nhận được trình bày ở Bảng 2. Bảng 2. Khả năng làm tan CaCO3 của 7 chủng vi khuẩn tuyển chọn STT Nguồn phân lập Ký hiệu chủng Khả năng sinh acid lactic (D-d mm) 1 Yaourt L1 12 2 L2 10 3 Sữa chua proby L3 8 4 L4 11 5 L5 6 6 Dưa cải chua L6 10 7 L7 9 Qua Bảng 2 nhận thấy khả năng phân giải CaCO3 của chủng L1, L2, L4, L6 cao hơn các chủng L3, L5, L7. Chứng tỏ các chủng L1, L2, L4, L6 sinh ra lượng acid lactic nhiều hơn trong quá trình sinh trưởng. Hình 2. Khả năng làm tan CaCO3 của các chủng L1, L2 Hình 3. Khả năng làm tan CaCO3 của các chủng L4, L6 3.1.2.2. Khảo sát khả năng sinh lactic acid của các chủng phân lập được bằng thuốc thử Uphemen Chúng tôi đã tiến hành định tính dịch nuôi cấy các chủng vi khuẩn bằng thuốc thử Uphenmen để chọn ra các chủng có khả năng sinh axit cao. Các chủng vi khuẩn được nuôi trên 2 môi trường khác nhau để thử với thuốc thử Uphenmen. Kết quả cho thấy: 7 chủng trên 2 môi trường đều có phản ứng dương tính khi thử với thuốc thử Uphenmen, những ống nghiệm có nuôi vi khuẩn đều chuyển màu khác nhau với màu môi trường không nuôi cấy vi khuẩn. Trong đó, các chủng L1, L2, L4, L6 chuyển sang màu vàng gần giống với màu của ống nghiệm đối chứng là lactic acid. Cả 2 môi trường đều có chung một kết quả, chúng tỏ 4 chủng L1, L2, L4, L6 đều sinh ra lượng lactic acid nhiều hơn 3 chủng còn lại L3, L5, L7. Chúng tôi chọn 4 chủng vi khuẩn L1, L2, L4, L6 cho các nghiên cứu tiếp theo. 3.1.3 . Đặc điểm nuôi cấy và hình thái khuẩn lạc của chủng tuyển chọn Ở các loài vi sinh vật phát triển trên bề mặt các môi trường thạch khác nhau sẽ hình thành các hình dạng khuẩn lạc đặc trưng cho loài đó. Vì vậy, miêu tả các hình dạng khuẩn lạc là việc cần thiết với công tác định danh các loài vi sinh vật nghiên cứu. Các chủng vi khuẩn lactic tuyển chọn: L1, L2, L4, L6 được nuôi trên môi trường MRS đặc ở nhiệt độ phòng trong 24-48 giờ. Kết quả quan sát đặc điểm khuẩn lạc và hình thái tế bào được trình bày ở Bảng 3. Bảng 3. Đặc điểm khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn lactic tuyển chọn Chủng Đường kính vòng phân giải (mm) Đặc điểm khuẩn lạc Hình thái tế bào L1 2,0-2,5 Trắng đục, bóng, nhô cao, dễ tạo huyền phù trong nước Hình que ngắn L2 1,5-2,0 Trắng sữa, hơi dẻo, mép trơn bóng, nhô cao, dễ tạo huyền phù trong nước Hình cầu L4 2,0-2,5 Trắng vàng, bóng, không nhô cao, dễ tạo huyền phù trong nước Hình que ngắn L6 1,5-2,0 Vàng nhạt, nhô cao, khó tạo huyền phù trong nước. Hình que dài 3.2 . Tuyển chọn các chủng có đặc tính probiotic 3.2.1 . Kiểm tra khả năng đối kháng với sinh vật kiểm định Chúng tôi tiến hành kiểm tra khả năng ức chế vi sinh vật kiểm định là E. coli với 4 chủng vi khuẩn lactic là L1, L2, L4, L6 để xác định hoạt tính kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn lactic. Kết quả cho thấy 4 chủng vi khuẩn lactic này đều có khả năng ức chế vi sinh vật kiểm định E. coli. Điều này khẳng định rằng các vi khuẩn lactic trong quá trình sinh trưởng đã sinh ra nhiều chất có tác dụng ức chế đối với các vi sinh vật gây bệnh. Các chất có tác dụng ức chế đó ngoài lactic acid còn có thể là acetaldehyte, hydroperoxide, ethanol, diacetyl, CO2, bacteriocin... Kết quả thu nhận được trình bày ở Bảng 4. Bảng 4. Khả năng ức chế vi sinh vật kiểm định E. coli STT Kí hiệu chủng Đường kính vòng vô khuẩn (D-d) (mm) 1 L1 20 2 L2 22 3 L4 18 4 L6 17 Trong 4 chủng thí nghiệm trên vi sinh vật kiểm định thì chủng L2 có hoạt tính ức chế đối với vi sinh vật kiểm định mạnh nhất, đường kính vòng vô khuẩn L2 là 22 mm. 3.2.2. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh trưởng trong điều kiện pH thấp Kết quả khảo sát pH môi trường sau 48 giờ nuôi cấy các chủng vi khuẩn lactic ở nhiệt độ 370C được trình bày ở Bảng 5. Bảng 5. Kết quả khảo sát pH môi trường sau 48 giờ nuôi cấy các chủng vi khuẩn STT Kí hiệu chủng pH của môi trường sau 48 giờ nuôi cấy 1 L1 5 , 55 2 L2 5 , 69 4 L4 5 , 92 6 L6 5 , 68 Tuyển chọn chủng probiotic là phải có khả năng tồn tại trong đường tiêu hóa của con người cũng như vật nuôi, để hỗ trợ các chức năng về tiêu hóa và miễn dịch. Điều này có nghĩa là các vi sinh vật này phải kháng được acid từ dịch dạ dày và dịch mật, để tiến đến ruột non. Như vậy khả năng sống sót trong môi trường acid là tiêu chí quan trọng để lựa chọn chủng có tiềm năng probiotic. Qua Bảng 5 ta thấy chủng L1 có khả năng sống sót trong điều kiện pH thấp nhất, có thể kết luận chủng này có tiềm năng probiotic cao hơn các chủng còn lại. 4 . Kết luận - Từ các nguồn yaourt, nước dưa cải chua, sữa chua proby... đã phân lập và tuyển chọn được 7 chủng vi khuẩn sinh acid lactic, trong đó bốn chủng L1, L2, L4 và L6 có khả năng tạo lactic acid cao và đều đối kháng mạnh với E. coli. - L1 là chủng có tiềm năng probiotic cao nhất. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Ngô Thị Phương Dung, Huỳnh Thị Yến Ly và Huỳnh Xuân Phong (2011), “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả năng sinh chất kháng khuẩn”, Tạp chí Khoa học, 19a: 176- 184. [2] Nguyễn Văn Duy (2005), “Tuyển chọn và nghiên cứu các vi khuẩn rừng ngập mặn để ứng dụng tạo chế phẩm probiotic phòng bệnh do vibrio gây nên trên tôm nước lợ”, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội. [3] Nguyễn Thành Đạt, Mai Lệ Hằng (2000), Giáo trình Vi sinh vật, Nxb Trường Đại học Sư phạm Hà Nội. [4] Nguyễn Thành Đạt, Nguyễn Duy Thảo, Vương Trọng Hào (1990), Thực hành Vi sinh học, Nxb Giáo dục. [5] Đào Thị Lương, Nguyễn Thị Anh Đào, Nguyễn Thị Kim Quy (2010), “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic dùng trong chế biến và bảo quản thức ăn cho gia súc nhai lại”, Chuyên san Công nghệ sinh học, số 6: 1-6. Title: CLASSIFICATION AND SELECTION OF PROBIOTIC POTENTIAL OF LACTIC ACID BACTERIA PHAN THI THANH DIEM Quang Nam University Abstract: Lactic acid bacteria play a very important role in our life. They make fermented foods and preserve food from damage. They also produce probiotics that meet the demand of human’s health. From the different fermented food sources, we classified and selected four strain L1, L2, L3, L4 that are capable of producing high level of lactic acid. The result of testing potential probiotic has showed that all four strains were highly resistant to E. coli and could survive in low pH conditions. Of which L1 is the most potent probiotic strain. Keywords: Lactic acid bacteria, Probiotic