Phân lập và thiết kế vector phục vụ công tác chọn tạo giống cây trồng biến đổi gen có khả năng chống chịu với điều kiện bất thuận

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM 258 PHÂN LẬP VÀ THIẾT KẾ VECTOR PHỤC VỤ CÔNG TÁC CHỌN TẠO GIỐNG CÂY TRỒNG BIẾN ĐỔI GEN CÓ KHẢ NĂNG CHỐNG CHỊU VỚI ĐIỀU KIỆN BẤT THUẬN Nguyễn Anh Vũ, Lương Thanh Quang, Nguyễn Hữu Kiên, Bùi Thúy Hiền, Dương Tuấn Bảo, Nguyễn Minh Ngọc, Nguyễn Trung Anh, Đỗ Như Quỳnh, Trần Quốc Bảo, Vũ Hoàng Nam, Trần Thu Cúc, Phạm Thị Lý Thu, Lê Huy Hàm, Nguyễn Văn Đồng Viện Di truyền Nông nghiệp SUMMARY Gene isolation and construction of expression vector as material for creating stress-tolerant transgenic crop plants Among abiotic stress factors, drought causes most damage to crop yield world wide. In the wake of increasing frequency and scale of drought due to global warming, creating drought tolerant crop plants is not only in the interest of Vietnam but also the world. In our research, we isolated from soybean (Glycine max) 3 genes potentially involved in drought tolerance including: GmMYB, GmGLP and GmCHS7. These genes were placed under 35S promoter’s control in the binary vector pZY101-Asc carrying ammonium glufosinate resistant bar gene as the selection marker. Agrobacteium tumefaciens strains transformed with these vectors were used to create transgenic soybean lines resulting in some promising initial results. Keywords: Agrobacterium tumefaciens, drought tolerant, glufosinate, GmGLP1, GmMyb, GmCHS7, soybean, transgenic I. ĐẶT VẤN ĐỀ* Hạn hán - tình trạng lượng nước tự nhiên thấp hơn mức trung bình trong một thời gian dài trên diện rộng và mang tính khu vực, là một trong các yếu tố phi sinh học có ảnh hưởng lớn nhất đến năng suất cây trồng trên toàn thế giới [1]. Một số mô hình dự đoán biến đổi khí hậu cho thấy hạn hán sẽ xảy ra thường xuyên hơn trong tương lai do những tác động dài hạn của hiện tượng ấm lên toàn cầu [2, 3]. Kết quả là diện tích đất canh tác ngày càng bị thu hẹp. Trước những thách thức nêu trên, việc nghiên cứu phát triển những giống cây trồng mới có khả năng thích ứng, chống chịu các điều kiện bất thuận đang là một trong những mục tiêu hàng đầu của các nhà khoa học. Tình trạng thiếu nước dẫn đến một loạt các thay đổi về hình thái, sinh lý, hóa sinh cũng như ở cấp phân tử gây ảnh hưởng xấu tới sự phát triển và năng suất cây trồng [4]. Tương tự như stress mặn, stress hạn phá vỡ sự cân bằng nội Người phản biện: GS.TSKH. Trần Duy Quý. môi và phân bố ion trong tế bào [5, 6]. Cây trồng phản ứng với các stress hạn và mặn thông qua các con đường truyền tin và phản ứng tế bào như sản xuất protein stress, tăng cường các chất chống oxi hóa và tích lũy các chất tan tương thích [7, 8, 9]. Cơ chế phản ứng của tế bào thực vật với điều kiện hạn được thể hiện trong hình 1. Các gen phản ứng với stress hạn có thể chia thành 2 nhóm chính. Nhóm 1 mã hóa cho các protein chức năng tham gia các phản ứng cuối trong chuỗi đáp ứng stress bao gồm gen điều hòa áp suất thẩm thấu [10], các protein chống oxi hóa [11], aquaporin [12], protein phổ biến trong thời kì hình thành phôi muộn (LEA) [13], các protein vận chuyển [14]. Nhóm 2 mã hóa các protein điều khiển bao gồm các yếu tố phiên mã và các protein kinase truyền tin. Một số yếu tố phiên mã liên quan đến khả năng chịu mặn và chịu hạn thường gặp bao gồm WRKY [15,16], bZIP [15], MYB [17,18], DREB [19], NCED [20] và AP2/ERF [21]. Các protein kinase truyền tin bao gồm: Protein kinase phụ thuộc Ca2+ [22], MAPK [23], RPK [24], PIK [25] và protein kinase serine/threonine [26]. Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất 259 Hình 1. Cơ chế phản ứng của thực vật với điều kiện hạn Trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn phân lập và thiết kế vector tăng cường biểu hiện 3 gen: GmMYB, GmCHS7 và GmGLP1.GmMYB (XM_003549497) ban đầu được xếp vào nhóm MYB, tuy nhiên với trình tự mang vùng WRKY, gen này được xếp lại vào nhóm các yếu tố phiên mã WRKY mã hóa cho protein WRKY24. Nghiên cứu gần đây cho thấy WRKY nằm trong số các yếu tố phiên mã tăng cường biểu hiện trong điều kiện mặn và có nhiều khả năng giúp nâng cao khả năng chịu mặn của đậu tương [27]. GmGLP1 (EU916269) là một trong các gen mã hóa protein giống germin (germin-like protein) tìm thấy trong hạt nảy mầm. Tất cả các protein VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM 260 germin đều mang motif germin tạo thành cấu trúc lõi thùng beta tham gia vào gắn kết với kim loại [28]. Mặc dù còn nhiều germin chưa được xác định chức năng, các phân tích chức năng tương đồng cho thấy germin tham gia vào nhiều quá trình quan trọng khác nhau như phát triển, điều hòa áp suất thẩm thấu, dao động quang chu kỳ và phòng vệ [29]. Một báo cáo gần đây cho thấy tăng cường biểu hiện germin tách từ đậu tương giúp tăng khả năng chịu mặn của cây thuốc lá chuyển gen [30]. Cuối cùng, GmCHS7(XM_003517481) là một trong các gen thuộc nhóm đa gen mã hóa chalcone synthase tham gia sinh tổng hợp flavonoid/isoflavonoid. Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy chalcone synthase tham gia vào phản ứng phòng vệ của thực vật chống lại các tác nhân sinh học gây bệnh [31]. Một số nghiên cứu lại cho thấy GmCHS7 biểu hiện mạnh ở rễ và có nhiều khả năng tham gia vào quá trình hình thành nốt sần rễ cây họ Đậu [32]. II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu Vật liệu thực vật: Giống đậu tương DT2008, DT84,Williams 82 và ĐT22. Các hóa chất, vật tư tiêu hao cơ bản phục vụ tách chiết và clone gen. Các plasmid pGEMT-easy, pRTL2 và pZY101-Asc. 2.1. Phương pháp nghiên cứu *Tách chiết gen GmMYB, GmGLP1 và GmCHS7 Ba dòng đậu tương DT2008, DT84 và Williams 82 đã được cho nảy mầm trong xô nhựa chứa đất giá thể. Mỗi dòng gieo 100 hạt kích thước lớn, vỏ trơn đều, không rạn nứt hay bị tổn thương, không có dấu hiệu bị mọt. Các thí nghiệm được tưới nước đầy đủ hàng ngày, mỗi xô 100 ml nước. Sau ba tuần, ngừng tưới nước trong 3 ngày. Sau đó xử lý hạn nhân tạo bằng cách tưới 200 ml dung dịch sorbitol 7% (w/v). 15 mẫu lá đã thu được từ 3 giống tại 5 thời điểm: Ngay trước khi xử lý hạn, sau xử lý hạn 1h, 5h, 12h và 24h. Với mỗi mẫu lá, chúng tôi đã thu lá từ 20 cây khác nhau của cùng một điều kiện (giống và thời điểm). Mẫu được xử lý lạnh sâu bằng cách ngâm trong ni tơ lỏng (-196oC) để làm ngưng toàn bộ các phản ứng sinh hóa trong mẫu, ngăn chăn sự phân hủy ARN thông tin. Mẫu lá được nghiền nhỏ thành bột mịn trong nitơ lỏng và được dùng để tách ARN theo quy trình sử dụng bộ kit SV Total RNA isolation (Promega). ARN tổng số từ các mẫu được dùng để tổng hợp thư viện cDNA sử dụng enzyme reverse transcriptase. Tổng hợp mạch cDNA đầu tiên bằng cách ủ hỗn hợp ARN tổng số (tối đa 5 g) (4 l), mồi oligo (dT)20 50 M (1 l), dNTP 10 mM (1 l) và nước cất đã qua xử lý DEPC (4 l) trong 5 phút ở 65oC, chuyển sang giữ trên đá trong 2 phút. Sau đó trộn với hỗn hợp Tổng hợp cDNA bao gồm: Dịch đệm 10x (2 l), MgCl2 25 mM (4 l), DTT 0,1 M (2 l), RnaseOUT 40 U/l (1 l), superScript III RT 200U/l (1 l) vả ủ trong 50 phút ở 50oC. Sau đó ủ 5 phút ở 80oC để ngưng phản ứng phiên mã ngược, làm lạnh ống nghiệm trên đá, ly tâm nhanh để thu mẫu, sau đó thêm 1 µl RnaseH và ủ ở 37oC trong 20 phút để phân hủy ARN. Các gen quan tâm được PCR từ thư viện cDNA với các cặp mồi đặc hiệu: + GmMYB Forward: GTGAGCACAGTCATGATC và GmMYB Reverse: TCAGCAAGGCTTAATTTC; + GmGLP1 Forward: ATGAAGCTCACAGGTTTCCTG và GmGLP1 Reverse: TTATTTCTTAGGAGCAAGCCTAGAC; + GmCHS7 Forward: ATGGTTAGCGTAGCTGAGAT và GmCHS7 Reverse: TCAGATGGCCACACTATGC. Thành phần phản ứng bao gồm: Dung dịch đệm 10X (5 l), dNTP 10 mM (5 l), mồi xuôi (5 l), mồi ngược (5 l), Pfu DNA polymerase (1,25 l), cDNA (1 l), H2O (27,75 l)với chu trình nhiệt: Biến tính ở 95oCtrong 3 phút; 40 chu kỳ 95oC trong 30 giây, 55oC trong 30 giây và 72oC trong 1 phút; sau đó kéo dài mạch lần cuối ở 72oC trong 7 phút. Sản phẩm PCR sau khi đã kiểm tra điện di được tinh sạch bằng bộ Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất 261 kit GenCatch PCR Purification (Epoch Life Science), tạo đầu dính với Taq polymerase, gắn vào vector nhân dòng pGEMT-easy và đưa và E. coli DH5 bằng phương pháp sốc nhiệt. Các gen quan tâm tiếp tục được PCR với cặp mồi đặc hiệu mang trình tự giới hạn để cắt giới hạn và chuyển vào cassette biểu hiện gen dưới sự kiểm soát của promoter 35S trong vector pRTL2. Trình tự của các cặp mồi đặc hiệu: + GmMyb-KpnI: GC GGTACC ATGGCCCAGCGCCGCA và GmMyb-BamHI: GC GGATCC TCAGCAAGGCTTAATTTCAAAACCTA + GmGLP1-XmaI: GC CCCGGG ATGAAGCTCACAGGTTTCCTG và GmGLP1-BamHI: GC GGATCC TTATTTCTTAGGAGCAAGCCTAGAC + GmCHS7-NcoI: CCATGG ATGGTTAGCGTAG và GmCHS7-XbaI: AGATCT TCAGATGGCCACAC Sau khi các gen quan tâm được đưa vào cassette biểu hiện gen pRTL2, toàn bộ cassette biểu hiện gen mang promoter, enhancer, gene quan tâm cùng trình tự poly A được cắt bằng enzyme cắt giới hạn AscI và gắn vào vector nhị thể pZY101-Asc mang gen chọn lọc bar kháng ammonium glufosinate. Vector pZY101-Asc mang cassette biểu hiện gen quan tâm được biến nạp vào một số chủng A. tumefaciens bằng phương pháp xung điện. Các chủng khuẩn A. tumefaciens mang gen được dùng để chuyển nạp vào hạt đậu tương đang nảy mầm theo phương pháp của Zeng và cộng sự [33] có cải tiến. Cây chuyển gen tái sinh trồng ra đất sau khoảng 20 ngày được phun BASTA (tương đương ammonium glufosinate 60 mg/L) để kiểm tra khả năng kháng thuốc trừ cỏ. Các cây sống sót sau khi phun được thu mẫu lá để phân tích. Sự có mặt của gen cần chuyển trong cây chuyển gen được kiểm tra bằng PCR với mồi xuôi nằm trong vùng promoter 35S_F (GTGACAGATAGCTGGGCAATG) và mồi ngược nằm trong gen tương ứng. Như vậy mặc dù mồi ngược có thể gắn vào gen nội sinh, sản phẩm PCR chỉ được hình thành trên cassette biểu hiện gen mang gen cần chuyển nằm ngay sau promoter 35S. III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Từ thư viện cDNA của 3 giống đậu tương DT2008, DT84 và Williams 82, chúng tôi đã tiến hành PCR và tách chiết được gen GmMYB, GmGLP1 và GmCHS7, chủ yếu từ giống Williams 82 với các mẫu sau khi xử lý hạn nhân tạo cho thấy nhiều khả năng các gen này phản ứng và biểu hiện trong điều kiện hạn (Hình 2, Hình 3). Hình 2. A. Kết quả PCR GmMYB từ các thư viện cDNA của giống Williams 82. M: Thang ADN chuẩn 1kb plus; 1-5 lần lượt các mẫu cDNA thu ở 0h, 1h, 5h, 12h và 24h sau khi xử lý hạn. B: Kết quả PCR GmCHS7 từ các thư viện cDNA của giống Williams 82. M: Thang ADN chuẩn 1kb plus; 1-4 lần lượt các mẫu 1h, 5h, 12h và 24h. VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM 262 Hình 3. Kết quả PCR GmGLP1từ các thư viện cDNA sau xử lý hạn.M: Thang chuẩn DNA 1kb plus; 1-5 lần lượt các mẫu 0h, 1h, 5h, 12h và 24h giống DT2008; 6-10: lần lượt các mẫu 0h, 1h, 5h, 12h và 24h giống Williams82. Các gen GmMYB, GmGLP1 và GmCHS7 sau khi được PCR thành công từ thư viện cDNA đã được đưa vào plasmid pGEMT-easy, nhân dòng và giải trình tự. Kết quả giải trình tự cho thấy các gen này mang trình tự đúng với trình tự đã công bố trên cơ sở dữ liệu NCBI. Các gen này được chuyển vào cassette biểu hiện gen dưới sự điều khiển của promoter 35S và đưa vào vector nhị thể pZY101-Asc (Hình 4). Hình 4. Kết quả PCR kiểm tra cassette biểu hiện gen trong pZY101-Asc mang GmMYB (1) 2742 bp, GmGLP1 (2) 1884 bp và GmCHS7 (3) 2334 bp. Sau khi thiết kế thành công các vector nhị thể pZY101-Asc mang GmMYB, GmGLP1 và GmCHS7, chúng tôi đã tiến hành biến nạp vào các chủng A. tumefaciens EHA101, EHA105, GV3101, LBA4404 và AGL1. Các chủng khuẩn mang gen này được dùng để chuyển nạp vào một số giống đậu tương của Việt Nam. Hình 5 minh họa quy trình chuyển nạp gen vào đậu tương bằng phương pháp gây tổn thương nốt lá mầm thông qua vi khuẩn A. tumefaciens. Các nghiên cứu trước đây đã cho thấy tần số chuyển gen vào đậu tương bằng phương pháp này bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố trong đó có giống đậu tương sử dụng để tiếp nhận gen. Các giống đậu tương phản ứng rất khác nhau quy trình tái sinh chồi và chọn lọc. Ngay trong giai đoạn nảy mầm, các giống có tốc độ nảy mầm khác nhau, ảnh hưởng đến khả năng gây tổn thương nốt lá mầm và độ mẫn cảm với chuyển nạp. Ở giai đoạn tái sinh chồi, với cùng một nồng độ chất kích thích sinh trưởng nhất định, một số giống đáp ứng tạo chồi rất tốt trong khi các giống khác tạo mô xốp thay vì phát sinh chồi. Tương tự, phản ứng của các giống với áp lực chọn lọc thực vật cũng có khác biệt rõ rệt. Ở cùng một nồng độ chất chọn lọc ammonium glufosinate, chồi tái sinh ở một số giống chuyển màu nâu và chết đồng loạt trong vòng một tuần. Một số giống khác có khả năng chống chịu cao hơn và chồi giữ xanh lâu hơn. Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất 263 Hình 5. Quy trình chuyển nạp gen vào đậu tương bằng phương pháp gây tổn thương nốt lá mầm thông qua vi khuẩn A. tumefaciens, tái sinh và chọn lọc cây chuyển gen bằng gen chỉ thị bar. 1: Nảy mầm hạt trong môi trường GM sau khi khử trùng; 2: Hạt nảy mầm sau 5 ngày được tách đôi và gây tổn thương ở nốt lá mầm tạo điều kiện cho A. tumefaciens chuyển nạp; 3: Đồng nuôi cấy nửa hạt và A. tumefaciens trên môi trường CCM không chứa kháng sinh chọn lọc; 4: Kích thích tạo chồi trên môi trường SI chứa kháng sinh diệt khuẩn; 5: Chồi bên tái sinh từ các vị trí tổn thương trên nốt lá mầm trên môi trường SI; 6: Chuyển lá mầm kèm cụm chồi sang môi trường SI với chất chọn lọc thực vật-thuốc diệt cỏ ammonium glufosinate; 7: Phần lớn chồi chết dưới áp lực chọn lọc; 8: Loại bỏ lá mầm, tiếp tục nuôi cấy cụm chồi trên môi trường chọn lọc; 9: Chồi chuyển gen kháng ammonium glufosinate tái sinh từ cụm chồi; 10: Kích thích kéo dài các chồi chuyển gen trong môi trường SE không có áp lực chọn lọc; 11: Kích thích chồi tạo rễ trong môi trường RM; 12: Đưa cây chuyển gen trồng ra đất, phun BASTA kiểm tra và thu mẫu để phân tích sinh học phân tử. Sau khi thử nghiệm biến nạp trên một số giống đậu tương khác nhau của Việt Nam chúng tôi nhận thấy, giống ĐT22 cho kết quả tái sinh tốt nhất và tập trung tiến hành chuyển gen vào giống này. Các kết quả chuyển gen ban đầu cho một số cây tái sinh và sống sót qua môi trường chọn lọc chứa ammonium glufosinate. Các cây này sau khi được trồng ra đất tiếp tục được chọn lọc bằng phun thuốc diệt cỏ BASTA. Các cây sống sót sau khi phun BASTA tiếp tục được phân tích PCR. Kết quả cho thấy không phải tất cả các cây sống sót sau qua chọn lọc trong nuôi cấy mô và phun BASTA đều mang gen cần chuyển. Chỉ có bốn trong số chín cây phân tích PCR cho thấy có mang gen GmMYB (Hình 6). Đối với GmGLP1, trong số 8 cây phân tích, 5 cây cho kết quả dương tính (Hình 7). Với gen GmCHS7, tỉ lệ cây phân tích dương tính là thấp nhất: Chỉ có 1/5 cây (Hình 8).Về lý thuyết, do gen cần chuyển và gen bar nằm sát nhau trên cùng một T-DNA nên rất ít khả năng cây chuyển gen chỉ mang bar mà không mang gen cần chuyển. Nhiều khả năng, áp lực chọn lọc bằng thuốc diệt cỏ chưa đủ cao trong cả quá trình nuôi cấy mô và khi trồng ra đất. Kết quả là một số cây sống sót qua chọn lọc do khả năng kháng thuốc diệt cỏ bẩm sinh cao hơn những cây khác mặc dù không được chuyển gen. VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM 264 Hình 6. Kết quả điện di kiểm tra cây chuyển gen GmMYB. M: Thang ADN chuẩn 1 kb plus. (-) H2O; (+) plasmid; 1 - 8: Các cây chuyển gen giả định. Kích thước sản phẩm mong đợi: 1779 bp. Hình 7. Kết quả điện di kiểm tra cây chuyển gen GmGLP1. M: Thang ADN chuẩn 1 kb plus. (-) H2O; (+) plasmid; 1 - 9: Các cây chuyển gen giả định. Kích thước sản phẩm mong đợi: 992 bp. Hình 8. Kết quả điện di kiểm tra cây chuyển gen GmCHS7. M: Thang ADN chuẩn 1 kb plus. (-) H2O; (+) plasmid; 1 - 5: các cây chuyển gen giả định. Kích thước sản phẩm mong đợi: 1368 bp. Tuy nhiên chúng tôi cho rằng việc nâng cao nồng độ chọn lọc trong quá trình nuôi cấy mô và phun BASTA là không cần thiết. Trên thực tế, với áp lực chọn lọc hiện tại, số lượng cây sống sót nhưng không mang gen không quá nhiều. Ngược lại, một số giống đậu tương thử nghiệm đã không sống sót được với áp lực chọn lọc này. Nâng áp lực chọn lọc có thể giảm số cây dương tính giả nhưng có thể loại bỏ một số cây chuyển gen không sống sót được với áp lực chọn lọc cao. IV. KẾT LUẬN Chúng tôi đã tách chiết được 3 gen GmMYB, GmGLP1 và GmCHS7 và đưa thành công vào vector biểu hiện gen pZY101-Asc và chuyển vào các chủng vi khuẩn A. tumefaciens. Kết quả chuyển nạp gen vào đậu tương cho thấy bước đầu đã thu được một số cây chuyển gen mang các gen trên. Mặc dù với áp lực chọn lọc hiện tại, một số cây sống sót không mang gen cần chuyển, chúng tôi kết luận không cần nâng cao áp lực chọn lọc vì có thể tăng tỉ lệ cây dương tính thật nhưng làm giảm tổng số cây chuyển gen thu được. Các cây chuyển gen đã được xác nhận bằng PCR là nguồn vật liệu để nghiên cứu sâu hơn nữa chức năng của GmMYB, GmGLP1 và GmCHS7, đồng thời cũng là nguồn vật liệu tiềm năng để nghiên cứu chọn tạo các giống đậu tương mới có khả năng chống chịu với các điều kiện bất thuận. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Boyer JS (1982). Plant productivity and environment. Science 218, 443-448. 2. Cook ER, Seager R, Cane MA, Stahle DW (2007). .North American Drought: Reconstructions, Causes, and Consequences.Earth Sci Rev 81:93-134. 3. Salinger MJ, Sivakumar MVK, Motha R (2005). Reducing vulnerability of agriculture and forestry to climate variability and change: workshop summary and recommendations. Climatic Change 70:341-362. 4. Wang WX, Vinocur B, Shoseyov O, Altman A (2001). Biotechnologyof plant osmotic stress tolerance: physiological andmolecular considerations. Acta Hort 560:285-292. 5. Serrano R, Mulet JM, Rios G, Marquez JA, de Larrinoa IF, LeubeMP, Mendizabal I, Pascual-Ahuir A, Proft M, Ros R,Montesinos C (1999). A glimpse Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất 265 of the mechanisms of ionhomeostasis during salt stress. J Exp Bot 50:1023-1036. 6. Zhu JK (2001). Plant salt tolerance. Trends Plant Sci 6:66-71. 7. Vierling E, Kimpel JA (1992). Plant responses to environmentalstress. Curr Opin Biotech 3:164-170. 8. Zhu JK, Hasegawa PM, Bressan RA (1997). Molecular aspects ofosmotic stress in plants. Crit Rev Plant Sci 16:253-277. 9. Cushman JC, Bohnert HJ (2000). Genomic approaches to plantstress tolerance. Curr Opin Plant Biol 3:117-124. 10. Tomy S, Chang Y-M, Chen Y-H, Cao J-C, Wang T- P, et al. (2009). Salinity effects on the expression of osmoregulatory genes in the euryhaline black porgy Acanthopagrus schlegeli.General and Comparative Endocrinology 161: 123-132. 11. Manaa A, Ben Ahmed H, Valot B, Bouchet JP, Aschi-Smiti S, et al. (2011). Salt and genotype impact on plant physiology and root proteome variations in tomato. Journal of Experimental Botany 62: 2797-2813. 12. Gao Z, He X, Zhao B, Zhou C, Liang Y, et al. (2010). Overexpressing a putative aquaporin gene from wheat, TaNIP, enhances salt tolerance in transgenic Arabidopsis. Plant and Cell Physiology 51: 767-775. 13. Wang Y, Jiang J, Zhao X, Liu G, Yang C, et al. (2006). A novel LEA gene from Tamarix androssowii confers drought tolerance in transgenic tobacco. Plant Science 171: 655-662. 14. Morino M, Natsui S, Ono T, Swartz TH, Krulwich TA, et al. (2010). Single site mutations in the hetero- oligomeric MRP antiporter from alkaliphilic Bacillus pseudofirmus OF4 that affect Na+/H+ antiport activity, sodium exclusion, individual MRP protein levels, or MRP complex formation. Journal of Biological Chemistry 285: 30942-30950. 15. Gong P, Zhang J, Li H, Yang C, Zhang C, et al. (2010). Transcriptional profiles of drought- responsive genes in modulating transcription signal transduction, andbiochemical pathways in tomato. Journal of Experimental Botany 61: 3563-3575. 16. Zhou Q-Y, Tian A-G, Zou H-F, Xie Z-M, Lei G, et al. (2008). Soybean WRKYtype transcription factor genes, GmWRKY13, GmWRKY21, and GmWRKY54, confer differential tolerance to abiotic stresses in transgenic Arabidopsis plants. Plant Biotechnology Journal 6: 486-503. 17. Liao Y, Zou H-F, Wang H-W, Zhang W-K, Ma B, et al. (2008). Soybean GmMYB76, GmMYB92, and GmMYB177 genes confer stress tolerance in transgenic Arabidopsis plants. Cell Research 18: 1047-1060. 18. Mao X, Jia D, Li A, Zhang H, Tian S, et al. (2011). Transgenic expression of TaMYB2A confers enhanced tolerance to multiple abiotic stresses in Arabidopsis. Functional & Integrative Genomics11(3):445-65. 19. Chen M, Wang Q-Y, Cheng X-G, Xu Z-S, Li L-C, et al. (2007). GmDREB2, a soybean DRE-binding transcription factor, conferred drought and high-salt tolerance in transgenic plants. Biochemical and Biophysical Research Communications 353: 299-305. 20. Qin X, Zeevaart JAD (1999). The 9-cis- epoxycarotenoid cleavage reaction is thekey regulatory step of abscisic acid biosynthesis in water-stressed bean.Proceeding Natural Academy of Sciences 96: 15354-15361. 21. Zhang G, Chen M, Li L, Xu Z, Chen X, et al. (2009). Overexpression of thesoybean GmERF3 gene, an AP2/ERF type transcription factor for increasedtolerances to salt, drought, and diseases in transgenic tobacco. Journal ofExperimental Botany 60: 3781-3796. 22. Kim JH (2002). Ca2+-dependent Inhibition of Na+/H+exchanger 3 (NHE3)requires an NHE3- E3KARP-alpha -actinin-4 complex for oligomerization andendocytosis. Journal of Biological Chemistry 277: 23714-23724. 23. Moris PC (2010). Integrating lipid signalling, mitogen-activated protein kinasecascades and salt tolerance. New Phytologist 188: 640-643. 24. Chinchilla D, Shan L, He P, de Vries S, Kemmerling B (2009). One for all: thereceptor-associated kinase BAK1. Trends in Plant Science 14: 535-541. 25. Whitman M, Downes CP, Keeler M, Keller T, Cantley L (1988). Type Iphosphatidylinositol kinase makes a novel inositol phospholipid, phosphatidylinositol-3-phosphate. Nature 332: 644-646. 26. Mao X, Zhang H, Tian S, Chang X, Jing R (2009). TaSnRK2.4, an SNF1-typeserine/threonine protein kinase of wheat (Triticum aestivum L.), confers enhancedmultistress tolerance in Arabidopsis. Journal of Experimental Botany 61: 683-696. 27. Ali Z, Zhang da Y, Xu ZL, Xu L, Yi JX, He XL, Huang YH, Liu XQ, Khan AA, Trethowan RM, Ma HX (2012). Uncovering the salt response of soybean by unraveling its wild and cultivated functional genomes using tag sequencing. PLoS One 7(11):e48819. 28. Requena L, Bornemann S (1999). Barley (Hordeum vulgare). oxalate oxidase is a manganese-containing enzyme. Biochemical Journal343:185-190 29. Mahmut Ç (2000). Germin, an oxalate oxidase, has a function in many aspects of plant Life. Turkish Journal of Biology 24:717-724. 30. Lu M, Han YP, Gao JG, Wang XJ, Li WB (2010). Identification and analysis of the germin- like gene family in soybean. BMC Genomics11:620. 31. Dao TT, Linthorst HJ, Verpoorte R (2011). Chlacone synthase and its functions in plant resistance. Phytochem Rev. 10(3):397-412. 32. Yi J, Derynck MR, Chen L, Dhaubhadel S (2010). Differential expression of CHS7 and CHS8 genes in soybean. Planta 231(3):741-53. 33. Zeng P, Vadnais DA, Zhang Z, Polacco JC (2004). Refined glufosinate selection in Agrobacterium- mediated transformation of soybean [Glycine max (L.) Merrill]. Plant Cell Reports, 22(7), 478-482.