Phân lập và bước đầu sàng lọc vi khuẩn lactic có đặc tính sinh học tốt từ măng muối chua để tạo giống khởi động

107 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 9(94)/2018 TÀI LIỆU THAM KHẢO Bộ Công Thương, 2018. Báo cáo xuất nhập khẩu Việt Nam 2017. Nhà xuất bản Công thương. Hà Nội. TCVN 7036:2008. Hạt tiêu đen (Piper nigrum L.) - Quy định kỹ thuật. TCVN 7039:2013. Gia vị và mộc thảo - Xác định hàm lượng dầu dễ bay hơi (phương pháp chưng cất bằng hơi nước). TCVN 9683:2013. Hạt tiêu đen và hạt tiêu trắng nguyên hạt hoặc dạng bột - Xác định hàm lượng peperine - phương pháp đo quang phổ. Trung tâm Thông tin và Thống kê KH&CN, 2016. Chuyên đề: Xu hướng ứng dụng công nghệ sấy tiên tiến trong bảo quản và chế biến nông sản, thủy sản. Báo cáo phân tích xu hướng và công nghệ. Sở KH&CN TP. HCM. Trung tâm xúc tiến Thương mại và đầu tư TP Hồ Chí Minh (ITPC), 2017. Sơ lược về sản phẩm gia vị - hạt tiêu, 2017. Saha K. C., H. P. Seal and M. A. Noor, 2013. Isolation and characterization of piperine from the fruits of black pepper (Piper nigrum). J. Bangladesh Agril. Univ. 11(1): 11-16, 2013. Krishnapura Srinivasan, 2009. Black Pepper (Piper nigrum) and Its Bioactive Compound, Piperine. Researchgate, May, 2009. Morshed S., M.D. Hossain, M. Ahmad, M. Junayed, 2017. Physicochemical Characteristics of Essential Oil of Black Pepper (Piper nigrum) Cultivated in Chittagong, Bangladesh. Journal of Food Quality and Hazards Control 4 (2017) 66-69. Study on determination of heat pump drying regime for manufacturing green peppercorn Pham Van Thao, Phan Thanh Binh, Vo Thi Thuy Dung, Truong Minh Hang, Tran Thi Tham Ha, Nguyen Thi Kim Oanh Abstract Heat pump drying is one of the drying methods that has been applied on drying of many agricultural products in order to keep the natural color of the green pepper berries during processing. Four heat pump drying regimes at four different temperatures, including 200C, 250C, 300C and 350C, were tested on both fresh green pepper berries and fresh green pepper spikes. The study also involved on evaluating the effect of the heat pump drying regimes on the moisture reduction of peppercorn, color and quality of green peppercorn after drying. The results identified the best heat pump drying regimes for manufacturing green peppercorn as: drying temperature was 300C, relative humidity was 40%, wind speed was 3 mps, drying time was about 40 hours. This drying regimes produced the highest percentage of green peppercorn and olive peppercorn, but the lowest percentage of black peppercorn. The flavour and the quality of dried green peppercorn products were best for spicy with specific aroma and attracting appearance. Keywords: Pepper processing, green peppercorn, heat pump drying, pepper drying Ngày nhận bài: 21/8/2018 Ngày phản biện: 29/8/2018 Người phản biện: TS. Nguyễn Văn Thường Ngày duyệt đăng: 18/9/2018 1 Khoa Công nghệ thực phẩm, Học viện Nông nghiệp Việt Nam PHÂN LẬP VÀ BƯỚC ĐẦU SÀNG LỌC VI KHUẨN LACTIC CÓ ĐẶC TÍNH SINH HỌC TỐT TỪ MĂNG MUỐI CHUA ĐỂ TẠO GIỐNG KHỞI ĐỘNG Nguyễn Thị Lâm Đoàn1, Trần Thị Lan Hương1 TÓM TẮT Vi khuẩn lactic trong các sản phẩm muối chua truyền thống có vai trò quan trọng trong chế biến và bảo quản thực phẩm. Nghiên cứu này tiến hành xác định số lượng vi khuẩn lactic, pH trong măng muối chua và bước đầu sàng lọc các chủng có khả năng chịu pH thấp như trong môi trường lên men, kháng vi khuẩn gây hư hỏng măng, không sinh cellulase. Kiểu lên men đồng hình hoặc dị hình được xác định để khuyến cáo chủng đó nên bổ sung vào giai đoạn đầu hay giai đoạn sau của quá trình lên men và khả năng sinh acid. Kết quả cho thấy số lượng vi khuẩn lactic trong sản phẩm măng muối chua dao động từ 35 ˟ 109 đến 49 ˟ 109 CFU/g, pH từ 3,72 đến 3,93. Từ 90 chủng vi khuẩn lactic được nghiên cứu phân lập từ măng muối chua đã sàng lọc 07 chủng có khả năng chịu pH thấp (pH 2,0; 3,0; 4,0), kháng vi khuẩn gây hư hỏng măng Bacillus cereus với đường kính vòng kháng khuẩn 4 - 11 mm, không 108 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 9(94)/2018 sinh cellulase ngoại bào. Trong 07 chủng có 05 chủng (MC1.2, MC2.2, MC2.5, MC4.14, MC6.1) lên men đồng hình, 02 chủng (MC3.5, MC6.8) lên men dị hình. Khả năng sinh lactic acid của các chủng lên men đồng hình từ 203oT đến 248,7oT, các chủng lên men dị hình từ 53oT đến 62,7oT. Đây là cơ sở để lựa chọn chủng làm giống khởi động cho từng loại sản phẩm măng cụ thể sau này. Từ khóa: Măng muối chua, vi khuẩn lactic, kháng vi khuẩn gây hư hỏng I. ĐẶT VẤN ĐỀ Măng là thức ăn chứa nhiều chất xơ và phytosterol, giàu khoáng chất như kali, canxi, mangan, kẽm, đồng, sắt (Chongtham et al., 2011). Sản phẩm từ măng hiện chủ yếu là măng tươi và măng muối chua theo phương thức truyền thống, chất lượng các sản phẩm chế biến chưa cao, hình thức sản phẩm đơn điệu, dẫn đến hiệu quả kính tế mang lại chưa tương xứng với tiềm năng vốn có của nó (Nguyễn Văn Toản và ctv., 2014). Lên men latic là phương pháp bảo quản và chế biến được sử dụng khá phổ biến nhằm kéo dài thời gian bảo quản do ức chế các vi sinh vật gây hư hỏng và gây bệnh thực phẩm, đồng thời làm gia tăng hương, vị cho sản phẩm (Thakur et al., 2016). Tuy nhiên, việc bảo quản măng bằng cách lên men không thể kéo dài quá lâu bởi lượng acid sinh ra làm pH < 4,0 sẽ ức chế cả vi khuẩn lactic dẫn đến măng có hiện tượng thối nhũn, mùi khó chịu. Măng bị nhũn nát là do trong quá trình lên men tồn tại một số loài vi khuẩn Bacillus cereus, Bacillus pumilus, Carnobacterium sp., Enterococcus faecium và Pseudomonas fluorescens (Debangana et al., 2011) sinh ra các enzyme thủy phân pectin của tế bào thực vật như pectin methyl esterase, polygalacturonase, pectin lyase, pectate lyase, hemicellulase, cellulase dẫn đến sự chảy nước các mô thực vật gây ra sự thối rữa và mềm (Liao, 2005). Kết quả nghiên cứu của Jeyaram và cộng tác viên (2010) đã cho thấy trong măng muối chua Bacillus cereus chiếm ưu thế 35,7%; trong đó Bacillus pumilus 2,6%, Carnobacterium sp. 11,9%, Enterococcus faecium 1,2% và Pseudomonas fluorescens 4,6%. Ngoài ra, tác giả cũng cảnh báo số lượng vi khuẩn Bacillus cereus trong măng muối chua từ 106 - 107CFU/ml chiếm 87% trong các mẫu nghiên cứu của nhóm tác giả làm tăng mối lo ngại mất an toàn cho người tiêu dùng, độc tố do vi khuẩn này có thể gây ngộ độc thực phẩm. Để hạn chế hư hỏng của măng muối chua và kéo dài thời gian bảo quản, người sản xuất, kinh doanh măng thường sử dụng phụ gia không rõ nguồn gốc xuất xứ, tiềm ẩn nhiều nguy cơ gây mất an toàn thực phẩm, ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng. Một số nghiên cứu trước đã cho thấy vi khuẩn lactic, chủ yếu là các loài thuộc giống Lactobacillus, Leuconostoc và Pediococcus là nhóm chính trong quá trình lên men măng muối chua (Tamang et al., 2008; Jeyaram et al., 2010). Đồng thời, tác giả cũng đưa ra giải pháp nâng cao chất lượng và an toàn cho sản phẩm là nghiên cứu những đặc tính có lợi của các chủng vi khuẩn lactic này tạo giống khởi động. Tuy nhiên, nghiên cứu tạo giống khởi động từ vi khuẩn lactic mới chỉ tập trung vào một số sản phẩm như dưa muối (Halász et al., 1999), xúc xích (Elias et al., 2014), kim chi (Lee et al., 2015); đối với măng muối chua còn rất hạn chế. Chính vì vậy, nghiên cứu này tập trung phân lập và bước đầu sàng lọc các chủng vi khuẩn lactic có đặc tính tốt như khả năng chịu pH thấp, khả năng kháng vi khuẩn gây hư hỏng măng, xác định kiểu lên men, khả năng sinh lactic acid để tạo giống khởi động cho bảo quản và chế biến măng chua. II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu - Mẫu măng: Sáu mẫu măng muối chua thu thập tại Hòa Bình và Yên Bái được sử dụng để phân lập các chủng vi khuẩn lactic. Ba mẫu ký hiệu là MC1, MC2, MC3 được thu thập tại Hòa Bình, MC4, MC5, MC6 được thu thập tại Yên Bái. - Chủng vi khuẩn: Chủng vi khuẩn lactic được phân lập từ các mẫu măng muối chua, kí hiệu là MC. Vi khuẩn kiểm định: Bacillus cereus ATCC 21778 được cung cấp từ Viện Công nghệ sinh học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. - Môi trường nghiên cứu: Môi trường phân lập vi khuẩn lactic MRS (g/l): Glucose - 20,0; NaH2PO4 - 2,0; CH3COONa - 5,0; Cao thịt -10,0; C6H17N3O7 - 2,0; Pepton -10,0; MgSO4.7H2O - 0,1; Cao nấm men - 5,0; MnSO4.4H2O - 0,05; Tween 80 - 1,0 ml; Thạch - 15,0; Nước cất vừa đủ - 1lít; pH 6,5; khử trùng 121ºC/15 phút. Môi trường nuôi vi sinh vật kiểm định LB (g/l): Cao nấm men - 5,0; Pepton - 10,0; NaCl - 10,0; pH 7,0; khử trùng 121ºC/15 phút. Môi trường CMC (carboxymethyl cellulose) dùng để xác định khả năng sinh cellulase (g/l): Thạch: 17,0; CMC: 1,0; nước cất vừa đủ - 1 lít; pH 7,0; khử trùng 121ºC/15 phút. 109 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 9(94)/2018 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phân lập vi khuẩn lactic Phân lập và hoạt hóa vi khuẩn lactic trên môi trường MRS theo mô tả bởi Nguyen và cộng tác viên (2013), có điều chỉnh về nhiệt độ nuôi cấy. Mẫu được đồng nhất, pha loãng từ 10-1 đến 10-8. Trang đều 100µl dịch trên môi trường phân lập và nuôi ở tủ ấm 37oC/48 h. Chọn đĩa thạch có mật độ vi khuẩn 30 - 300 khuẩn lạc. Xác định sơ bộ vi khuẩn lactic dựa trên đặc điểm hình thái. Đặc điểm vi khuẩn (gram, hoạt tính catalase) xác định theo Barnali và Subhankar (2010). Chủng được giữ trong môi trường MRS có bổ sung 40% glycerol ở –80°C cho các nghiên cứu tiếp theo. 2.2.2. Sàng lọc các chủng chịu được acid thấp tương tự với môi trường lên men Khả năng chịu acid của vi khuẩn được đánh giá qua lượng tế bào sống sót ở môi trường có pH 2, 3, 4 trong 24 h (Dương Thu Hương và Phạm Kim Đăng, 2015). Môi trường MRS lỏng đã điều chỉnh pH bằng HCl 1N hoặc NaOH 1N. Nhỏ 1% dịch vi khuẩn (đã được nuôi trong 24 h) vào các ống nghiệm trên và nuôi ở 37oC. Đánh giá khả năng chịu pH thông qua OD620nm của dịch nuôi cấy ở 0 h và 24 h. Khả năng chịu acid được xác định dựa vào giá trị DOD là giá trị hiệu số của giá trị OD đo tại thời điểm 24 h và giá trị OD đo tại thời điểm 0h, ở mỗi nồng độ pH. 2.2.3. Xác định khả năng kháng vi khuẩn gây hư hỏng măng Xác định khả năng kháng vi khuẩn gây hư hỏng măng bằng phương pháp khuếch tán thạch của Herreros và cộng tác viên (2005) với vi khuẩn kiểm định là Bacillus cereus. Chủng vi khuẩn lactic (tuyển chọn ở thí nghiệm trước) được nuôi cấy trong môi trường MRS lỏng ở 37oC trong 18 h, sau đó ly tâm 6000 vòng/phút trong 20 phút. Thu dịch nổi và chỉnh pH về trung tính (6,7 - 7,0) bằng NaOH 1N để loại yếu tố hạn chế vi khuẩn kiểm định do sinh acid. Vi khuẩn kiểm định được nuôi ở 37oC trong 24 h trên môi trường LB lỏng. Lấy 30μl dung dịch mỗi chủng vi khuẩn kiểm định cấy gạt lên đĩa pettri chứa môi trường LB agar. Nhỏ 80μl dịch ly tâm của chủng vi khuẩn lactic đã được chỉnh pH vào các lỗ thạch đường kính 5 mm đã được khoan trên đĩa và giữ ở nhiệt độ 4oC trong 4 h, sau đó giữ ở 37oC trong 24 h. Khả năng ức chế được đánh giá bằng hiệu số D – d (mm), trong đó: D là đường kính vòng kháng khuẩn (mm), d là đường kính lỗ thạch (5mm). 2.2.4. Đánh giá khả năng sinh cellulase ngoại bào Khả năng sinh cellulase ngoại bào được xác định thông qua phương pháp đục lỗ thạch trên môi trường có bổ sung cơ chất tương ứng carboxymethyl cellulose (CMC) (Nguyễn Lân Dũng và cộng tác viên (1976). Dịch hoạt hóa trên môi trường MRS ở 37ºC trong 48 h được ly tâm 6000 vòng/phút trong 30 phút, ở 4ºC. Nhỏ 0,1 ml dịch ly tâm vào lỗ thạch đường kính 5 mm đã được khoan trên môi trường chứa CMC. Để ở 4oC trong 2 h để dịch ly tâm khuếch tán đều vào trong thạch. Tiếp tục ủ ở 37oC trong 48 h để lượng dịch trong lỗ thạch thủy phân cơ chất. Đĩa thạch sau đó được phủ bằng dung dịch lugol 5%. Khả năng sinh enzyme được đo bằng đường kính vòng phân giải cơ chất xung quanh lỗ thạch, tức D – d, trong đó: D là đường kính vòng phân giải (mm), d là đường kính lỗ thạch (5mm). 2.2.5. Xác định kiểu lên men Phương pháp xác định kiểu lên men lactic đồng hình và dị hình dựa vào khả năng sinh khí CO2 trong quá trình lên men glucose của vi khuẩn lactic. Cho ống Durham vào ống nghiệm chứa 5ml môi trường MRS. Cấy chủng vi khuẩn lactic cần thử vào ống, nuôi ở 37oC trong 48 giờ. Nếu ống Durham nổi lên trên bề mặt môi trường thì chứng tỏ chủng vi khuẩn sinh khí CO2 (lên men lactic dị hình). Nếu ống Durham chìm, chủng vi khuẩn không sinh khí CO2 (lên men men lactic đồng hình) (Astuti, 2016). 2.2.6. Xác định khả năng sinh lactic acid Khả năng sinh lactic acid của các chủng vi khuẩn lactic được sử dụng phương pháp chuẩn độ Therner (Mai Đàm Linh và ctv., 2007). 10 ml dịch nuôi cấy vi khuẩn ở 37ºC trong 48h được bổ sung 20ml nước cất và thêm 01 - 02 giọt phenolphtalein 1%. Chuẩn độ bằng NaOH 0,1N đến khi xuất hiện màu hồng nhạt bền trong 30 giây thì dừng lại. Ghi lại thể tích dung dịch NaOH 0,1N đã dùng để chuẩn độ. Độ acid được tính theo độ Therner theo công thức: ºT = VNaOH tiêu tốn ˟ 10. Trong đó: ºT là độ Therner; 10 là số ml dịch nuôi cấy dùng chuẩn độ. 2.2.7. Xử lý số liệu Sử dụng phần mềm Excel và Minitab để xử lý số liệu. 2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 1 đến tháng 6 năm 2018 tại Khoa Công nghệ thực phẩm - Học viện Nông nghiệp Việt Nam. 110 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 9(94)/2018 III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Số lượng vi khuẩn lactic phân lập từ các mẫu măng muối chua Từ các mẫu măng muối chua sau khi phân lập đã thu được 100 khuẩn lạc, trong đó 90 chủng vi khuẩn lactic đã được thu nhận dựa trên các đặc tính hình thái và sinh lý. Số lượng và ký hiệu các chủng trong từng mẫu được thể hiện ở Bảng 1. Bảng 1. Đặc điểm 06 mẫu măng muối chua sử dụng trong nghiên cứu Số lượng khuẩn lạc vi khuẩn lactic trong các mẫu măng muối chua của nghiên cứu này dao động từ 35 ˟ 109 đến 49 ˟ 109 CFU/g (Bảng 1), cao hơn so với nghiên cứu của Tamang và cộng tác viên (2008) trên măng muối chua ở Đông Bắc Ấn Độ (105 đến 108 CFU/g). Chính số lượng vi khuẩn lactic cao hơn nên sinh nhiều acid hơn dẫn đến pH của măng muối chua (từ 3,72 đến 3,93) thấp hơn so với nghiên cứu của Tamang và cộng tác viên (2008) (pH 3,9 đến 4,2). 3.2. Sàng lọc các chủng vi khuẩn lactic chịu acid như trong môi trường lên men Một số nghiên cứu trước đã chỉ ra sản phẩm măng muối chua mesu, soidon, soibum của Ấn độ pH là 3,9 - 4,2 (Tamang et al., 2008) và pH 3,5 đối với măng muối chua Đài Loan (Chen et al., 2010). Tuy nhiên, việc bảo quản măng bằng cách lên men không thể kéo dài, bởi khi lượng lactic acid sinh ra trong quá trình lên men làm pH < 4,0 sẽ ức chế cả vi khuẩn lactic, vì vậy khi măng muối chua bảo quản dài ngày sẽ bị thối nhũn và có mùi khó chịu. Lee và cộng tác viên (2015) nghiên cứu tạo giống khởi động cho kim chi đã chứng mình rằng các vi khuẩn trong tạo giống khởi động trước tiên phải thích nghi với môi trường lên men. Chính vì vậy, nghiên cứu này đánh giá khả năng chịu acid của các chủng xem chủng đó có vượt qua hàng rào pH thấp trong môi trường lên men măng muối chua để có thể sử dụng trong việc tạo giống khởi động đặc biệt khi sản phẩm được bảo quản trong một thời gian dài. Thí nghiệm tiến hành đánh giá khả năng chịu acid tại pH 2; 3; 4 của 90 chủng vi khuẩn lactic được phân lập từ măng muối chua. Kết quả cho thấy 90 chủng vi khuẩn lactic đều có khả năng chịu được pH 4; 50/90 chủng chịu được pH 3; 30/90 chủng chịu được pH 2. Trong 30 chủng có khả năng chịu được pH 2, khả năng sinh trưởng tốt nhất thuộc về 05 chủng (MC1.2, MC2.5, MC3.1, MC4.7, MC6.8) có DOD sau 24 h tăng ≥ 0,32 đơn vị (Bảng 2). Bảng 2. Giá trị ΔOD của 05 chủng vi khuẩn lactic có khả năng chịu acid thấp Ghi chú: Trong cùng một hàng các giá trị có chữ ở mũ giống nhau thì không có sự khác nhau ở mức ý nghĩa α = 0,05. Hầu hết các chủng đều có xu hướng giảm tỉ lệ sống khi hạ thấp pH. Kết quả nghiên cứu này phù hợp với các kết quả nghiên cứu của Kim và cộng tác viên (2007) cho thấy khi pH 2,5, có 3/7 chủng vi khuẩn lactic có khả năng chịu môi trường acid này và một nghiên cứu khác của Dương Thu Hương và Phạm Kim Đăng (2015) cho rằng chủng vi khuẩn lactic có khả năng chịu được pH từ 2 đến 3 là 15/20 chủng. Như vậy, 30 chủng có khả năng chịu được pH 2 - 4 tiếp tục được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. 3.3. Sàng lọc các chủng có khả năng kháng vi khuẩn gây hư hỏng măng Trong 30 chủng được thử tính kháng Bacillus cereus có 13 chủng có khả năng kháng trong đó có 02 chủng (MC4.14 và MC6.5) với vòng kháng khuẩn mạnh ≥ 10mm (Bảng 3). Ký hiệu mẫu Số lượng chủng pH CFU/g mẫu Ký hiệu chủng MC1 15 3,93 47 ˟ 109 MC1.1 đến MC1.15 MC2 15 3,86 49 ˟ 109 MC2.1 đến MC2.15 MC3 15 3,86 36 ˟ 109 MC3.1 đến MC3.15 MC4 15 3,85 35 ˟ 109 MC4.1 đến MC4.15 MC5 15 3,85 45 ˟ 109 MC5.1 đến MC5.15 MC6 15 3,72 44 ˟ 109 MC6.1 đến MC6.15 Ký hiệu chủng Giá trị ΔOD pH 2 pH 3 pH 4 MC1.2 0,42a 0,57b 0,70c MC2.5 0,41a 0,57b 0,70c MC3.1 0,34a 0,49b 0,54c MC4.7 0,35a 0,46b 0,56c MC6.8 0,32a 0,47b 0,60c 111 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 9(94)/2018 TT Tên chủng Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) 1 MC1.2 4 2 MC1.9 8 3 MC2.2 9 4 MC2.5 8 5 MC2.8 7 6 MC3.1 9 7 MC3.5 6 8 MC4.7 4 9 MC4.14 10 10 MC5.4 5 11 MC6.1 8 12 MC6.5 11 13 MC6.8 4 TT Tên chủng Đường kính vòng phân giải cơ chất (D – d) mm 1 MC1.2 0 2 MC1.9 23 3 MC2.2 0 4 MC2.5 0 5 MC2.8 32 6 MC3.1 20 7 MC3.5 0 8 MC4.7 21 9 MC4.14 0 10 MC5.4 31 11 MC6.1 0 12 MC6.5 26 13 MC6.8 0 Bảng 3. Khả năng kháng vi khuẩn Bacillus cereus của các chủng vi khuẩn lactic Ghi chú: D – d là đường kính vòng kháng khuẩn, d = 5 mm. Kết quả thu được phù hợp với kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Minh Hằng và Nguyễn Minh Thư (2013) khi thu được 03 chủng phân lập từ nước dưa muối, cà muối, hành muối có khả năng kháng mạnh Bacillus cereus với đường kính vòng kháng khuẩn 8 - 12 mm. Nghiên cứu của Tamang và cộng tác viên (2009) cũng chỉ ra một số loài khác nhau của giống Lactobacillus, Pediococcus và Leuconostoc được phân lập từ các thực phẩm lên men cũng có khả năng kháng một số vi khuẩn gây thối, mềm sản phẩm như Bacillus cereus. Do vậy 13 chủng có khả năng kháng được Bacillus cereus được sử dụng cho nghiên cứu tiếp theo. 3.4. Đánh giá khả năng sinh celullase ngoại bào Thành phần quan trọng nhất cấu trúc nên thành tế bào trong măng là cellulose, khi thay đổi thành phần này có thế làm sản phẩm bị mềm nhũn. Do vậy, cellulose có trong măng là chỉ tiêu ảnh hưởng lớn đến chất lượng của nguyên liệu cũng như sản phẩm măng (Xu et al., 2004). Tiến hành đánh giá khả năng sinh cellulase với cơ chất carboxymethyl cellulose (CMC) bằng phương pháp đục lỗ thạch miêu tả trong mục 2.2 với 13 chủng tuyển chọn (thí nghiệm trên). Chủng không có khả năng sinh cellulase sẽ được chọn cho nghiên cứu tiếp theo. Trong 13 chủng có 06 chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh cellulase cao (Bảng 4) đường kính vòng phân giải cơ chất 20 - 32 mm. Kết quả nghiên cứu này vượt trội hơn so với nghiên cứu trước đó của Đào Thị Lương và cộng tác viên (2010) đã cho thấy đường kính vòng phân giả cơ chất CMC 8 - 12 mm. Các chủng có khả năng sinh cellulase cao này là chủng tiềm năng để ứng dụng trong nhiều nghiên cứu tiếp theo trong công nghệ thực phẩm và trong chăn nuôi. Tuy nhiên, mục đích của nghiên cứu này lại tuyển chọn các chủng không sinh cellulase để tạo giống khởi động cho măng muối chua nên 07 chủng không sinh cellulase là MC1.2, MC2.2, MC2.5, MC3.5, MC4.14, MC6.1, MC6.8 sẽ được sử dụng cho nghiên cứu tiếp theo. Bảng 4. Khả năng sinh cellulase ngoại bào của các chủng tuyển chọn Ghi chú: D – d là đường kính vòng phân giải cơ chất, d = 5 mm. Hình 1. Khả năng phân giải cơ chất carboxymethyl cellulose (CMC) của một số chủng vi khuẩn lactic 3.5. Xác định kiểu lên men của chủng vi khuẩn lactic và khả năng sinh lactic acid Theo nghiên cứu trước đã chỉ ra trong lên men dưa cải bẹ muối chua vi khuẩn lactic lên men đồng MC2.8 MC1.9 MC3.1 MC6.5 MC5.4 MC4.7 112 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 9(94)/2018 hình và dị hình đều đóng vai trò quan trọng trong quá trình lên men (Font de Valdez et al., 1990). Trong giai đoạn đầu của quá trình lên men vi khuẩn lactic lên men dị hình đóng vai trò chính trong đó chủ yếu là các loài thuộc giống Leuconostoc. Trong giai đoạn sau của quá trình lên men chủ yếu các chủng lên men đồng hình một số loài thuộc Lactobacillus và Pedioccocus, sản sinh acid nhiều làm pH của sản phẩm giảm 3,5 đến 3,8 ngăn chặn vi sinh vật gây thối hỏng và sản phẩm đạt được chất lượng mong muốn (Aukrust et al., 1994). Kết quả bảng 5 chỉ ra trong 07 chủng tuyển chọn có 05 chủng lên men đồng hình (MC1.2, MC2.2, MC2.5, MC4.14, MC6.1) và 02 chủng (MC3.5 và MC6.8) lên men dị hình. Các chủng lên men dị hình định hướng bổ sung vào giai đoạn đầu, các chủng lên men đồng hình bổ sung ở giai đoạn sau của quá trình lên men măng muối chua Tất cả các chủng đều có khả năng sinh lactic acid. Trong đó các chủng lên men lactic đồng hình có khả năng sinh lượng lactic acid từ 203 - 248,7oT, còn các chủng lên men dị hình có khả năng sinh lượng lactic acid từ 53 - 62,7oT. Kết quả trên khá phù hợp với các nghiên cứu trước đây của Nguyễn Thị Lâm Đoàn và Nguyễn Thị Thùy Dương (2017) về hàm lượng lactic acid của vi khuẩn lactic được phân lập từ cà muối chua trong đó có 27/61 chủng có khả năng sinh acid cao từ 200 - 263oT, 30/61 chủng có khả năng sinh acid từ 100 - 200oT, 4/61 chủng có khả năng sinh acid từ 50 - 80oT. Bảng 5. Đặc điểm của vi khuẩn lactic được tuyển chọn Ghi chú: (+): có sinh khí; (-): không sinh khí. Giá trị có chữ ở mũ giống nhau trong cùng cột thì không có sự khác nhau ở mức ý nghĩa α = 0.05. Lactic acid có tác dụng làm giảm pH của sản phẩm, ức chế hoạt động của nhiều loại vi sinh vật gây hư hỏng (Thakur et al., 2016). IV. KẾT LUẬN Dựa trên 06 mẫu măng chua thu thập ở Hòa Bình và Yên Bái đã sàng lọc 07 chủng (trong đó 4/7 chủng từ măng muối Hòa Bình và 3/7 chủng từ măng muối Yên Bái) có khả năng chịu pH 2 - 4, có khả năng kháng vi khuẩn gây hư hỏng măng Bacillus cereus, không sinh cellulase ngoại bào. Trong 07 chủng có 05 chủng lên men đồng hình, 02 chủng lên men dị hình, các chủng lên men dị hình có lượng acid lactic sinh ra bằng 1/3 đến 1/4 so với các chủng đồng hình. Có thể định hướng sử dụng các chủng này làm giống khởi động trong sản xuất măng muối chua, đặc biệt các chủng lên men dị hình có thể bổ sung vào giai đoạn đầu, còn các chủng lên men đồng hình bổ sung vào giai đoạn sau của quá trình lên men. TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mượu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch và Phạm Văn Ty, 1976. Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, tập 2. NXB Khoa học Kỹ thuật. Hà Nội. Nguyễn Thị Lâm Đoàn và Lưu Thị Thùy Dương, 2017. Tuyển chọn vi khuẩn lactic có một số hoạt tính sinh học để ứng dụng trong xử lý phế phụ phẩm nông nghiệp làm thức ăn chăn nuôi cho gia súc nhai lại. Tạp chí Khoa học Nông Nghiệp Việt Nam, 15 (11): 1556 -1564. Nguyễn Thị Minh Hằng và Nguyễn Minh Thư, 2013. Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp amylase và bacteriocin. Tạp chí Khoa học và Công nghệ Lâm nghiệp, 3 (1): 3-10. Dương Thu Hương và Phạm Kim Đăng, 2015. Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn lactic có đặc tính probiotic từ ruột gà. Tạp chí Khoa học kỹ thuật chăn nuôi, 12: 78 - 86. Mai Đàm Linh, Đỗ Minh Phương, Phạm Thị Tuyết, Kiều Hữu Ảnh và Nguyễn Thị Giang, 2007. Đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn lactic phân lập trên địa bàn Hà Nội. Tạp chí Khoa học, Trường Đại học Quốc gia Hà Nội, 24, 211 - 226. Đào Thị Lương, Nguyễn Thị Anh Đào, Nguyễn Thị Kim Quy, Trần Thị Lệ Quyên, Dương Văn Hợp, Trần Quốc Việt, Ninh Thị Len và Bùi Thị Thu Huyền, 2010. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic dùng trong chế biến và bảo quản thức ăn thô xanh và phụ phẩm nông nghiệp cho gia súc nhai lại. Di truyền học và ứng dụng - Chuyên san Công nghệ sinh học, 6: 1-6 Nguyễn Văn Toản, Mai Khánh Trang, Phạm Thị Kim Chi, Trần Thanh Quỳnh Anh và Nguyễn Văn Huế, 2014. Nghiên cứu ảnh hưởng của hai thông số kỹ thuật (thời gian ngâm, nồng độ muối) đến chất lượng sản phẩm măng muối chua. Hue University Journal of Science, 94 (6), 1-8. Astuti M. P., 2016. Isolation, characterization, and identification lactic acid bacteria from chicken waste faeces that potential as probiotics. International Journal of Scientific and Research Publications, 6(5): 180-191. TT Ký hiệu chủng Sinh khí Lượng lactic acid (oT) 1 MC1.2 - 210ef 2 MC2.2 - 203f 3 MC2.5 - 230bc 4 MC3.5 + 62,7j 5 MC4.14 - 228cd 6 MC6.1 - 248,7a 7 MC6.8 + 53j 113 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 9(94)/2018 Aukrust T. W., Blom A., Sandtorv B. F. and Slinde E., 1994. Interactions between starter culture and raw material in lactic acid fermentation of sliced carrot. LWT - Food Science and Technology 27 (4): 337-341. Barnali A. and Subhankar P., 2010. Isolation and characterization of lactic acid bacteria from dairy effluents. Journal of Environmental Research and Development, 4: 983- 992. Chen Y. S., Wu H. C., Lui C. H., Chen H. C. and Yanagida F., 2010. Isolation and characterization of lactic acid bacteria from Jiang-sun (fermented bamboo shoots), a traditional fermented food in Taiwan. J. Sci. Food Agric, 90 (12): 1977-1982. Chongtham N., Madho S. B. and Sheena H., 2011. Nutritional properties of bamboo shoots: potential and prospects for utilization as a health food. Comprehensive reviews in food science and food safety, 10: 153- 169. Debangana C., Jatindra K. S. and Sharma G. D., 2011. Bamboo shoot based fermented food products: a review. Journal of Scientific and Industrial Research, 70: 199-203. Elias M., Potes M. E., Roseiro L.C., Santos C., Gomes A. and Agulheiro-Santos A. C., 2014. The effect of starter cultures on the Portuguese traditional sausage “Paio do Alentejo” in terms of its sensory and textural characteristics and polycyclic aromatic hydrocarbons profile. Journal of Food Research, 3 (3): 45-56. Halász A., Ágnes B. and Wilhelm H. H., 1999. The influence of starter culture selection on sauerkraut fermentation. Zeitschrift für Lebensmitteluntersuchung und - Forschung A, 208: 434-438. Jeyaram K., Romi W., Singh T. A., Devi A . R. and Devi S. S., 2010. Bacterial species associated with starter cultures for bamboo shoot fermenatation in Manipur state of India. Int J Food Microbiol, 143: 1-8. Kim P. I., Jung M. Y., Chang Y. H., Kim S., Kim S. J. and Park Y.H., 2007. Probiotic properties of Lactobacillus and Bifidobacterium strains isolated from porcine gastrointestinal tract. Applied Microbiology and Biotechnology, 74 (5): 1103-1111. Font de Valdez G., de Giori G.S., Garro M., Mozzi F. and Oliver G., 1990. Lactic acid bacteria from naturally fermented vegetables. Microbiol. Alim. Nutr, 8: 175 - 179. Lee M. E., Jang J. Y., Lee J. H., Park H. W., Choi H. J. and Kim T. W., 2015. Starter cultures for Kimchi fermentation. J. Microbiol. Biotechnol, 25(5): 559-568. Liao C. H., 2005. Bacterial soft rot. Microbiology of fruits and vegetables. Boca Raton CRC Press, 117-134. Nguyen T. L. D., Van H. K., Cnockaert M., De B. E., Maarten A., Le T. B., Vandamme P., 2013. A culture - dependent and - independent approach for the identification of lactic acid bacteria associated with the production of nem chua, a Vietnamese fermented meat product. Journal of Food Research International, 50: 232 -240. Tamang B., Tamang J. P., Schillinger U., Franz C. M., Gores M. and Holzapfel W. H., 2008. Phenotypic and genotypic identificationof lactic acid bacteria isolated from ethnic fermented bamboo tender shoots of North East India. Int J FoodMicrobiol, 121: 35-40. Tamang J.P., Tamang B., Schillinger U., Guigas C. and Holzapfel W. H., 2009. Functional properties of lactic acid bacteria isolated from ethnic fermented vegetables of the Himalayas. International Journal of Food Microbiology, 135: 28-33. Thakur K., Rajani C. S., Tomar S. K. and Panmei A., 2016. Fermented bamboo shoots: a rich niche for bioprospecting lactic acid bacteria. Jounal of Bacteriology and mycology, 3 (4): 1-6. Xu, Y. G., Lu, S. M and Wang, Q., 2004. Changes of cell wall components and PAL during cold storage activity in fresh-cut bamboo shoots. Journal of Food Biochemistry, 28: 169-177. Isolation, initial screening of lactic acid bacteria with good characteristics from fermented bamboo shoots to make starter culture Nguyen Thi Lam Doan, Tran Thi Lan Huong Abstract Lactic acid bacteria (LAB) play important roles in processing and food preservation of fermented food. This study determined the LAB strains, pH in fermented bamboo shoots and initial screening of lactic acid bacteria with good characteristics such as low pH tolerance, resistance to spoilage bacteria, no extracellular cellulase producing, types of fermentation (homofermentative or heterofermentative), lactic acid producing ability. The results showed that LAB strains in fermented bamboo shoots was varied from 35 ˟ 109 to 49 ˟ 109 CFU/g, pH from 3.72 to 3.93. Seven strains were selected from 90 LAB strains of 6 samples, with the low pH tolerance (pH 2 to 4), resistance to fermented bamboo shoot spoilage bacteria Bacillus cereus with zone of inhibition diameter 4 - 11 mm, no extracellular cellulase producing. Among 7 selected strains, 5 strains (MC1.2, MC2.2, MC2.5, MC4.14, MC6.1) were homofermentative and 02 strains (MC3.5, MC6.8) were heterofermentative. The lactic acid producing ability of homofermentative LAB were 203 - 248.7oT and of heterofermentative LAB strains were 53 - 62.7oT. These 07 strains can be used to select the best one for making starter culture. Keywords: Fermented bamboo shoots, lactic acid bacteria, resistance to spoilage bacteria, starter culture Ngày nhận bài: 1/8/2087 Ngày phản biện: 6/8/2018 Người phản biện: PGS. TS. Nguyễn Thị Thanh Thủy Ngày duyệt đăng: 18/9/2018