Phân lập một số loại nấm, vi khuẩn gây bệnh trên lá phong lan giống và giống Dendnobium phalaenopsis

KHOA HOÏC KYÕ THUAÄT18 T Ạ P C H Í K H O A H Ọ C C Ô N G N G H Ệ V À M Ô I T R Ư Ờ N G 1. Đặt vấn đề Hoa Lan (Orchidaceae) được biết đến như một loài hoa quý phái, hoa của bậc vua chúa vương giả. Ngoài vẻ đẹp rực rỡ về màu sắc, quyến rũ về hình dáng, hoa lan còn được sử dụng để tách chiết phục vụ cho một số ngành công nghiệp mỹ phẩm và có nhiều giá trị nhất định trong y học. Trong các giống phong lan phổ biến ở Việt Nam hiện nay, Hoàng Lan (Dendrobium) và Hồ Điệp (Phalaenopsis) là hai giống cho hoa đẹp, phù hợp với thị hiếu người tiêu dùng nên được thị trường cả nước rất ưa chuộng. Hiện nay, Hoàng Lan (Dendrobium) và Hồ Điệp (Phalaenopsis) đã được nhân giống theo công nghệ nuôi cấy mô và được hoàn thiện quy trình chăm sóc vào năm 2008. Tuy nhiên, một nguyên nhân làm suy giảm chất lượng cũng như tính thẩm mỹ của chậu lan thương phẩm là vấn đề sâu bệnh hại. Cho nên việc chú trọng đến nghiên cứu về bệnh trên hai giống lan Dendrobium và Phalaenopsis là rất cần thiết để đưa ra các giải pháp phòng và điều trị bệnh thích hợp. 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1. Nguyên vật liệu và môi trường Các mẫu lá bệnh của 2 giống Dendrobium và Phalaenopsis (đối với mỗi loại bệnh ta thu thập 20 lá bệnh) được thu thập. Mẫu lá sau khi được thu thập sẽ được giữ trong túi giấy kín và vận chuyển về phòng thí nghiệm. Mẫu được dùng trong ngày để phân lập. Môi trường phân lập nấm gồm có: Môi trường thạch nước cất (WA), môi trường thạch đường khoai tây (PDA), môi trường Czapek, môi trường chọn lọc Phytophthora (PSM), môi trường PDA một phần tư độ mạnh có bổ sung kháng sinh. Môi trường phân lập vi khuẩn: Môi trường King’s B (KbM). 2.2. Phương pháp nghiên cứu Phân lập nấm gây bệnh Quy trình phân lập nấm gây bệnh: Lau sạch buồng cấy vi sinh bằng cồn êtyl 900. Nhúng dụng cụ (kẹp, kéo hoặc dao mổ) trong cồn Phân lập một số loại nấm, vi khuẩn gây bệnh trên lá phong lan giống và giống VÕ THỊ BÍCH THƯƠNG, NGUYỄN THỊ THÁI HÀ Phân hiệu Trường Đại Học Nông Lâm TP. HCM tại Gia Lai Mục tiêu chính của nghiên cứu là xác định các bệnh thường gặp ở phong lan giống Dendrobium và Phalaenopsis. Qua mô tả hình thái, phân loại nấm và vi khuẩn gây bệnh bằng phương pháp hình thái học. Kết quả cho thấy bệnh do vi khuẩn và nấm trên hai giống phong lan Dendrobium và Phalaenopsis đã phân lập được 6 chủng nấm (Alternaria sp.,Curvularia sp.,Collectotrichum sp.,Colletotrichum graminicola (Colletotrichum cereale), Colletotrichum gloeosporioides, Fusarium sp.) và 1 chủng vi khuẩn (Erwinia sp.) gây nên 7 bệnh khác nhau. phalaenopsisDendnobium KHOA HOÏC KYÕ THUAÄT 19 S Ố 0 6 N Ă M 2 0 19êtyl 900 và hơ khô trên ngọn lửa đèn cồn. Rửa sạch mẫu đối với lá và thân: rửa trong nước vô trùng để loại bỏ đất, bụi và các tạp chất khác; đối với rễ: rửa bằng nước vô trùng 3 lần trong lọ nhỏ. Thêm 1 giọt thuốc tẩy vào lọ trong lần rửa đầu tiên. Khử trùng bề mặt mô lá hoặc thân bằng cách dùng giấy mềm (giấy ăn) đã nhúng cồn êtyl 700 lau mặt lá hoặc bằng cách nhúng nhanh lá dày vào cồn êtyl 700 trong 5 giây, rửa lại trong nước vô trùng và để khô trên giấy thấm vô trùng. Đối với rễ: nhúng rễ trong cồn êtyl 700, rửa nhanh trong nước vô trùng và để khô trên giấy thấm đã khử trùng. Dùng dụng cụ đã khử trùng cắt những miếng cấy nhỏ (2 x 2mm) từ phần ranh giới giữa mô khỏe và mô bệnh (lá), miếng dài 1 - 2mm ở phần ranh giới giữa mô bệnh và mô khỏe (rễ). Sau đó cấy lên môi trường nghèo dinh dưỡng như thạch nước cất (WA) hoặc môi trường chọn lọc, đặt những miếng cấy gần mép đĩa. Ấn nhẹ miếng cấy để chúng tiếp xúc tốt với mặt thạch. Đặt đĩa cấy ở nhiệt độ khoảng 250C, lí tưởng là trong điều kiện ánh sáng. Kiểm tra đĩa cấy hằng ngày, khi các tản nấm phát triển từ những miếng cấy, cấy truyền chúng (chú ý cắt ở mép ngoài tản nấm) sang môi trường như PDA hay WA có chứa các miếng mô cây đã khử trùng. Các miếng mô cây đã khử trùng kích thích sự hình thành bào tử, giúp cho việc giám định tác nhân gây bệnh. Làm thuần nấm bằng cách cấy đơn bào tử nảy mầm hoặc cấy đỉnh sinh trưởng của sợi nấm. Đối với các loại nấm sản sinh ra du động bào tử như Phytophthora có thể được phân lập từ giá thể bằng cách bẫy như sau: Cho khoảng 100g giá thể vào một cốc nhựa. Đổ nước vô trùng vào cốc sao cho ngập khoảng 5 - 10cm. Thả vào cốc những mẫu bộ phận tươi của cây trồng mẫn cảm với bệnh, các vật liệu bẫy này sẽ nổi trên mặt nước. Đặt cốc nguyên vị trí trong 2 - 4 ngày. Nấm sau 2 - 3 ngày từ mép vết bệnh đã phát triển trên vật liệu bẫy. Rửa sạch bằng nước vô trùng và khử trùng bề mặt, dùng môi trường chọn lọc để phân lập. Phân lập vi khuẩn gây bệnh Quy trình phân lập vi khuẩn gây bệnh: Dùng kéo đã hấp vô trùng cắt lá bệnh thành nhiều phần nhỏ, cho vào bình tam giác có chứa 100ml nước cất vô trùng. Lắc đều cho vi khuẩn phân tán từ vết bệnh ra môi trường nước. Chuẩn bị 6 ống nghiệm có đánh số theo thứ tự 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6. Dùng micropipet cho vào mỗi ống nghiệm 9ml nước cất vô trùng. Dùng micropipet hút 1ml dung dịch mẫu bệnh từ bình tam giác cho vào ống nghiệm 10-1, lắc đều. Tiếp tục dùng micropipet hút 1ml dung dịch từ ống nghiệm 10-1 cho vào ống nghiệm 10-2 . Làm tương tự đến ống nghiệm 10-6 . Dùng micropipet hút 0,1ml dung dịch từ ống nghiệm 10-5 và ống nghiệm 10-6 cho vào các đĩa petri chứa môi trường KbM hoặc WA. Dùng que gạt Drigalxki gạt đều dung dịch trên bề mặt đĩa petri. Đặt đĩa cấy ở nhiệt độ từ 25 - 300 C trong 1 - 2 ngày. Sau 1 - 2 ngày, chọn những khuẩn lạc đặc trưng mọc rời rạc trên đĩa petri để cấy truyền. Dùng que cấy đầu tròn đã khử trùng chạm vào khuẩn lạc được chọn và cấy lên môi trường King’s B bằng phương pháp cấy ria góc hoặc cấy ria liên tục theo hình sau: Đặt đĩa cấy ở nhiệt độ từ 25 - 300 C trong 2 ngày. Cấy truyền một khuẩn lạc đơn mọc từ đĩa cấy mới sang 1 ống nghiệm chứa môi trường King’s B đổ nghiêng. Đây là những mẫu thuần. Lây bệnh nhân tạo Để kiểm tra các chủng nấm và vi khuẩn đã phân lập được có phải là tác nhân gây bệnh, ta tiến hành lây bệnh nhân tạo. Có thể tiến hành như sau: Dùng que cấy hay kim tiêm tạo viết thương trên lá hoặc trên thân. Gắn một miếng thạch nhỏ từ mẫu tác nhân gây bệnh đã làm thuần vào vị trí vết thương. Dùng que cấy hay kim tiêm tạo viết thương trên lá hoặc trên thân cây đối chứng nhưng không gây bệnh. Dùng KHOA HOÏC KYÕ THUAÄT20 T Ạ P C H Í K H O A H Ọ C C Ô N G N G H Ệ V À M Ô I T R Ư Ờ N G nylon bọc vết thương lại. Tưới ẩm mỗi ngày. Kiểm tra so sánh những cây được lây bệnh và cây đối chứng. So sánh các triệu chứng này với các triệu chứng đã quan sát trên mẫu bệnh trước đó. Cũng có thể sử dụng phương pháp phun dịch bào tử lên lá cây hoặc tưới dịch bào tử vào đất để lây bệnh nhân tạo cho cây. Phân loại các chủng vi sinh vật gây bệnh bằng phương pháp hình thái học Các chủng nấm đã phân lập được cấy trên đĩa thạch PDA. Quan sát các đặc điểm hình thái, màu sắc, bào tử, thể bình, giá sinh bào tử,... và định danh chúng bằng các khóa phân loại nấm sợi của Robert A. Samson (1984); Katsuhiko Ando (2002) và thư viện hình ảnh nấm Mycology Online. Các chủng vi khuẩn được cấy trên môi trường King’s B, quan sát các đặc điểm hình thái khuẩn lạc. Sau đó nhuộm Gram, quan sát đặc điểm vi khuẩn dưới kính hiển vi và định danh. 3. Kết quả và thảo luận 3.1. Các bệnh điều tra được trên giống lan Dendrobium và nguyên nhân gây bệnh 3.1.1. Bệnh cháy đen đầu lá 3.1.1.1. Triệu chứng bệnh Đầu tiên, ở đỉnh lá lan Dendrobium xuất hiện đốm tròn màu nâu sậm, hơi trong. Đốm này dần lan rộng ra làm toàn bộ đỉnh lá chuyển sang màu nâu sậm. Vết bệnh có thể kéo dài chiếm 1/4 đến 1/3 chiều dài lá. Ranh giới giữa vết bệnh và phần khỏe của lá có màu vàng. Sau khoảng 2 - 3 tuần, phần lá bị bệnh khô lại chuyển sang màu nâu đen rồi chuyển sang đen. Ranh giới giữa phần bệnh và phần khỏe của lá có màu đen. Bệnh gây hỏng đầu lá và làm lá rụng sớm. Hình 1. Triệu chứng bệnh cháy đen đầu lá trên lan Dendrobium (a) Vết bệnh ban đầu (b) Vết bệnh sau 2 - 3 tuần 3.1.1.2. Nguyên nhân gây bệnh: Phân lập các lá bị bệnh, thu được 2 chủng nấm (kí hiệu Den1 và Den2). Bảng 1: Đặc điểm khuẩn lạc chuẩn Den 1 trên môi trường PDA Hình dạng Kích thước Màu sắc Hệ sợi khí sinh Khuẩn lạc chủng Den1 trên môi trường PDA Có hình tròn đồng tâm Phủ kín đĩa petri 90 mm trong 10 ngày Khuẩn lạc màu xanh lục, tạo các vân tròn màu nâu đen ở mặt dưới đĩa petri Màu trắng, dài (ở giữa khuẩn lạc), ngắn hơn (ở rìa khuẩn lạc) Đặc điểm bào tử vô tính sinh ra trên môi trường PDA: Bào tử mọc từ đỉnh tế bào trên cùng của cành sinh bào tử, được bao bởi 2 lớp màng. Bào tử non chỉ được phân cách bằng các vách ngăn ngang. Bào tử trưởng thành có thêm các vách ngăn dọc. Khi chín là một quả thể nhiều nhân có vách ngang và dọc. (a) (b) Hình 2. Bào tử vô tính Dend1 sinh ra trên môi trường PDA (x100) (a) Bào tử non nảy chồi từ đỉnh của cành sinh bào tử (b) Bào tử trưởng thành (phía trên), bào tử mới nảy chồi từ đuôi của một bào tử khác (phía dưới) Định danh: Chủng Den1 được xác định là Alternaria sp. Bảng 2: Đặc điểm khuẩn lạc chuẩn Den 2 trên môi tường PDA Hình dạng Kích thước Màu sắc Hệ sợi khí sinh Khuẩn lạc chủng Den2 trên môi trường PDA Hình tròn đồng tâm Đường kính khuẩn lạc đạt 6cm sau 1 tuần nuôi cấy Khuẩn lạc có màu xanh lục, tạo sắc tố xanh đen ở mặt đáy đĩa petri Ở giữa khuẩn lạc mọc cao thành ụ với màu nâu, ở rìa khuẩn lạc có màu trắng đến xanh lục nhạt.(a) (b) KHOA HOÏC KYÕ THUAÄT 21 S Ố 0 6 N Ă M 2 0 19Đặc điểm bào tử vô tính sinh ra trên môi trường PDA: Bào tử mọc từ nách hoặc từ đỉnh của cành sinh bào tử, có 2 lớp màng tế bào. Bào tử non và trưởng thành đều chỉ có các vách ngăn ngang (3 vách ngăn), không có vách ngăn dọc. Bào tử trưởng thành có hình dạng cong do tế bào thứ 3 phát triển to hơn các tế bào còn lại. 3.1.2.2. Nguyên nhân gây bệnh Qua phân lập các lá bệnh, thu được 1 chủng nấm (kí hiệu Den3). Bảng 3: Đặc điểm khuẩn lạc Den3 trên môi trường PDA Hình dạng Kích thước Màu sắc Hệ sợi khí sinh Khuẩn lạc chủng Den3 trên môi trường PDA Có dạng tròn đồng tâm Đường kính khuẩn lạc đạt 7,4 cm sau 10 ngày nuôi cấy Tạo sắc tố cam ở cả mặt trên và mặt đáy của đĩa petri Bông xốp, vùng trung tâm màu xanh lục, vùng rìa khuẩn lạc màu trắng. Trên bề mặt khuẩn lạc hình thành các hạt tròn màu xanh lục sẫm (đường kính 1 - 2mm). Đặc điểm của bào tử hình thành trên môi trường PDA: Bào tử hình thành từ cành bào tử phân sinh (hình thành trên sợi nấm). Bào tử dạng hình trụ 2 đầu tù (giống quả dưa chuột), đơn bào, không có vách ngăn, màu sắc trong. (a) (b) Hình 3. Bào tử vô tính Dend2 sinh ra trên môi trường PDA (x100) (a) Bào tử non mọc ra từ nách của cành sinh bào tử (b) Hình dạng bào tử trưởng thành Định danh: Chủng Den2 được xác định là Curvularia sp. 3.1.2. Bệnh đốm vòng (thán thư) 3.1.2.1. Triệu chứng bệnh Ban đầu, trên lá xuất hiện các chấm nhỏ màu nâu vàng, sau đó tiếp tục phát triển rộng dần ra thành những đốm tròn có màu nâu đậm. Sau một thời gian ở giữa vết bệnh chuyển dần sang màu xám và xuất hiện những vân tròn đồng tâm. Trên vết bệnh xuất hiện các chấm nổi lên màu nâu đen, đó là đĩa bào tử. Ranh giới giữa vết bệnh và phần lá khỏe thường có màu nâu sẫm đến đen. Lá héo và rụng nhanh chóng. Hình 5. Bào tử Den3 hình thành trên môi trường PDA (x100) Định danh: Chủng Den3 được xác định là Colletotrichum gloeosporioides. 3.1.3. Bệnh thối nâu 3.1.3.1. Triệu chứng bệnh Đầu tiên, trên lá xuất hiện những đốm nhỏ sũng nước, tròn hoặc bầu dục, thường nằm gần giữa lá. Khi bệnh tiến triển, màu các đốm thay đổi từ nâu nhạt tới nâu hạt dẻ rất đậm. Đốm lan rộng về mọi phía, cuối cùng làm thối toàn bộ lá. Nếu đốm xuất hiện ở phần gốc lá sẽ làm thối hỏng hệ mạch dẫn, làm lá héo và rụng rất nhanh. (a) (b) (c) Hình 4. Triệu chứng bệnh đốm vòng (thán thư) trên lan Dendrobium (a) Vết bệnh xuất phát từ đỉnh lá với các chấm nâu đen (đĩa bào tử) nổi lên giữa nền vết bệnh màu xám (b) Vết bệnh xuất phát từ mép lá với những vân tròn rất rõ (c) Lá bệnh héo khô nhanh chóng (a) (b) (c) Hình 6. Triệu chứng bệnh thối nâu trên lan Dendrobium KHOA HOÏC KYÕ THUAÄT22 T Ạ P C H Í K H O A H Ọ C C Ô N G N G H Ệ V À M Ô I T R Ư Ờ N G (a) Vết bệnh xuất hiện trên lá non làm lá héo vàng rất nhanh (b) Vết bệnh trên lá già với màu nâu sậm hơn (c) Vết bệnh lan tới đỉnh sinh trưởng làm thối cả ngọn 3.1.3.2. Nguyên nhân gây bệnh Qua phân lập các mẫu lá bệnh, thu được 1 chủng vi khuẩn (kí hiệu Den4). Bảng 4: Đặc điểm của khuẩn lạc vi khuẩn Den4 trên môi trường King’s B (KbM) Hình dạng Màu sắc Khuẩn lạc vi khuẩn Den 4 trên môi trường KbM sau 2 ngày Tròn, lồi, nhầy, bóng, mép khuẩn lạc tròn nhẵn Khuẩn lạc có màu vàng nhạt. Ở trung tâm có màu sậm hơn so với rìa khuẩn lạc. Đặc điểm hình thái vi khuẩn Den4: Bằng phương pháp nhuộm Gram và quan sát dưới kính hiển vi quang học ở bội giác x100. Vi khuẩn Den4 có những đặc điểm sau: Den4 là vi khuẩn Gram âm (bắt màu hồng khi nhuộm Gram). Có dạng hình que, nằm riêng lẽ hay dính nhau thành từng cặp. (a) (b) Hình 8. Triệu chứng bệnh đốm vòng trên lan Phalaenopsis (a) Vết bệnh xuất phát từ mép lá (b) Vết bệnh xuất phát từ đỉnh lá 3.2.1.2. Nguyên nhân gây bệnh: Qua phân lập các lá bệnh, thu được 1 chủng nấm sợi (kí hiệu Pha1) Bảng 5: Đặc điểm khuẩn lạc Pha1 trên môi trường PDA Hình dạng Kích thước Màu sắc Hệ sợi khí sinh Khuẩn lạc chủng Pha 1 trên môi trường PDA Tròn đồng tâm, có những nếp nhăn chạy dọc từ tâm ra rìa khuẩn lạc Đường kính đạt 7cm sau 1 tuần nuôi cấy. Khuẩn lạc có màu trắng sữa. Mặt đáy đĩa petri có những vân tròn xanh lục xen kẽ hồng nhạt Màu trắng hồng, bông xốp. Trên bề mặt khuẩn lạc hình thành nhiều đốm đen kích thước nhỏ, tập trung nhiều nhất ở vùng trung tâm. Đặc điểm bào tử Pha1 hình thành trên môi trường PDA: Bào tử đơn bào, không có vách ngăn, màu trong. Hình thoi, cong ở 2 đầu. Mọc trên các cuống bào tử đính hình trụ đơn bào, trong suốt. Hình 7. Vi khuẩn Den4 chụp dưới hính hiển vi quang học (x100) Định danh: Chủng Den4 được xác định là vi khuẩn Erwinia sp. 3.2. Các bệnh điều tra được trên giống lan Phalaenopsis và nguyên nhân gây bệnh 3.2.1. Bệnh đốm vòng 3.2.1.1. Triệu chứng bệnh Ban đầu, trên lá xuất hiện các chấm nhỏ màu nâu, sau đó tiếp tục phát triển rộng dần thành những đốm lớn màu nâu đen. Sau một thời gian, trung tâm vết bệnh chuyển dần sang màu vàng xám. Tại vết bệnh hình thành những vân tròn đồng tâm nhăn nheo. Ranh giới giữa vết bệnh và phần lá còn lại thường có màu đen, xung quanh viền đen là phần lá bị héo vàng, tiếp đến phần lá khỏe màu xanh. Hình 9. Bào tử Pha1 hình thành trên môi trường PDA (x100) Định danh: Chủng Pha1 được xác định là Colletotrichum graminicola (Colletotrichum cereale) 3.2.2. Bệnh héo Fusarium 3.2.2.1. Triệu chứng bệnh Đầu tiên, trên lá xuất hiện các triệu chứng KHOA HOÏC KYÕ THUAÄT 23 S Ố 0 6 N Ă M 2 0 19 (a) (b) (c) Hình 10. Triệu chứng bệnh héo Fusarium trên lan Phalaenopsis (a) Triệu chứng bệnh ban đầu (b) Toàn bộ lá bị héo vàng (c) Lá xoắn lại và rất dễ rụng (lá phía dưới), lá phía trên bắt đầu xuất hiện những triệu chứng bệnh. 3.2.2.2. Nguyên nhân gây bệnh : Qua phân lập các lá bệnh, thu được 1 chủng nấm sợi (kí hiệu Pha2) Bảng 6: Đặc điểm của khuẩn lạc Pha2 trên môi trường PDA Hình dạng Kích thước Màu sắc Hệ sợi khí sinh Khuẩn lạc chủng Pha 2 trên môi trường PDA Tròn đồng tâm, phân thành 3 tầng. Ở trung tâm, các sợi nấm khí sinh mọc cao nhất, thấp nhất là vùng rìa khuẩn lạc. Đường kính khuẩn lạc đạt 5,2cm sau 1 tuần nuôi cấy. Chất hòa tan tạo nên màu vàng sậm ở đáy đĩa petri Hệ sợi khí sinh phát triển mạnh có màu trắng và vàng nhạt Đặc điểm của bào tử Pha2 trên môi trường PDA: Quan sát dưới kính hiển vi quang học, phát hiện được 2 loại bào tử: Các bào tử lớn có màu trong, dạng hình thoi với 2 đầu cong (1 đầu ít cong và 1 đầu cong nhiều hơn). Bào tử có 3 vách ngăn ngang. Các bào tử nhỏ có màu trong, dạng hình thoi tròn 2 đầu, không có vách ngăn ngang. (a) (b) Hình 12. Triệu chứng bệnh đốm vàng lá trên lan Phalaenopsis (a) Triệu chứng bệnh ban đầu (b) Đốm hóa nâu đen ở chính giữa 3.2.3.2. Nguyên nhân gây bệnh: Phân lập các lá bệnh, thu được 1 chủng nấm sợi (kí hiệu Pha3) Bảng 7: Đặc điểm khuẩn lạc Pha3 trên môi trường PDA Hình dạng Kích thước Màu sắc Hệ sợi khí sinh Khuẩn lạc chủng Pha 3 trên môi trường PDA Tròn không đều Đường kính đạt 8,2 cm sau 1 tuần nuôi cấy Khuẩn lạc có màu trắng, mặt dưới đĩa petri màu trắng sữa Màu trắng, ngắn Đặc điểm của bào tử Pha3 sinh ra trên môi trường PDA: Bào tử trong suốt, hình trụ hơi bo tròn ở 2 đầu. Chiều dài gấp đôi chiều ngang. Bào tử đơn bào, có 1 nhân màu sậm. Được giải phóng ra từ các bọc bào tử. héo, lá mất đi độ dày vốn có, trở nên mỏng, nhăn nheo, chuyển dần từ màu xanh sang vàng nhạt. Cuối cùng, lá héo hoàn toàn, có màu vàng sậm, xoắn lại và rụng. Bệnh thường xảy ra trước tiên với các lá già ở phía dưới rồi lan dần đến các lá phía trên. 3.2.3. Bệnh đốm vàng lá 3.2.3.1. Triệu chứng bệnh Ban đầu trên lá xuất hiện các chấm nhỏ màu vàng, lan rộng dần ra theo hình tròn hoặc hình không đều. Các chấm này lõm xuống so với bề mặt lá. Sau một thời gian, chính giữa đốm bệnh khô lại và chuyển sang màu nâu đen. Hình 11. Bào tử chủng nấm Pha2 trên môi trường PDA (x100) Định loại: Chủng Pha2 được xác định là Fusarium sp. Hình13. Bào tử Pha3 trên môi trường PDA (x100) Định danh: Chủng Pha3 được xác định là Collectotrichum sp. KHOA HOÏC KYÕ THUAÄT24 T Ạ P C H Í K H O A H Ọ C C Ô N G N G H Ệ V À M Ô I T R Ư Ờ N G Hình 14. Triệu chứng bệnh thối mềm trên lan Phalaenopsis 3.2.4.2. Nguyên nhân gây bệnh: Qua phân lập các mẫu lá bệnh, thu được 1 chủng vi khuẩn (kí hiệu Pha4). Đặc điểm của khuẩn lạc vi khuẩn Pha4 trên môi trường King’s B (KbM): Hình dạng, có dạng hình tròn, lồi, nhầy, bóng, mép khuẩn lạc tròn nhẵn. Màu sắc: khuẩn lạc có màu vàng nhạt. Ở trung tâm có màu sậm hơn so với ngoài rìa. Đặc điểm hình thái vi khuẩn Pha4: Bằng phương pháp nhuộm Gram và quan sát dưới kính hiển vi quang học ở bội giác x100. Vi khuẩn Pha4 có những đặc điểm sau: Pha4 là vi khuẩn Gram âm (bắt màu hồng khi nhuộm Gram). Có dạng hình que, nằm riêng lẽ hay dính nhau thành từng cặp. Định danh: Chủng Pha4 được xác định là Erwinia sp. Kết luận Bệnh do vi khuẩn và nấm trên hai giống phong lan Dendrobium và Phalaenopsis diễn ra liên tục trong năm nhưng ở mức độ khác nhau. Trên hai giống lan Dendrobium và Phalaenopsis đã phân lập được 6 chủng nấm (Alternaria sp., Curvularia sp., Collectotrichum sp., Colletotrichum graminicola (Colletotrichum cereale), Colletotrichum gloeosporioides, Fusarium sp.) và 1 chủng vi khuẩn (Erwinia sp.) gây nên 7 bệnh khác nhau.Vi khuẩn Erwinia sp. là nguyên nhân gây ra bệnh thối trên cả hai giống lan Dendrobium và Phalaenopsis. Chi nấm Collectotrichum là nguyên nhân chính của bệnh đốm lá trên hai giống lan Dendrobium và Phalaenopsis với 3 bệnh gây ra bởi 3 loài khác nhau. Bệnh gây hại lớn nhất trên lan Dendrobium là bệnh cháy đen đầu lá do nấm Alternaria sp. và Curvularia sp. gây nên. Bệnh gây hại lớn nhất trên lan Phalaenopsis là bệnh héo Fusarium do nấm Fusarium sp. gây nên. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. James H. Blake, Meg Williamson, Kathy Ellingson (2006), Index of Plant Diseases in South Carolina, Clemson Extension. 2. J. Duff (2002), Orchid Diseases in the Northern Territory, Department of Resources - Primary Industry, Northern Territory. 3. J.S. Hu, S. Ferreira, M. Wang (1993), “Detection of Cymbidium Mosaic Virus, Odontoglossum Ringspot Virus, Tomato Spotted Wilt Virus, and Potyvirus Infexting Orchids in Hawaii”, Plant Disease, Vol (77), 464 - 468. 4. Z. Latiffah, M.Z. Nur Hayati, S. Baharuddin and Z. Maziah (2009), “Indentification and Pathogenicity of Fusarium Species Associated with Root Rot and Stem Rot of Dendrobium”, Asian Journal of Plant Pathology, Vol (1), 14 - 21. 5. John W. Miller (1990), “Bacterial Brown Spot of Orchid causes by Pseudomonas cattleyae”, Plant Pathology Circular, No. 330. 6. S. Tanaka, H. Nishii, S. Ito, and M. Kameya-Iwaki (1997), “Detection of Cymbidium Mosaic Potexvirus and Odontoglossum Ringspot Tobamovirus from Thai Orchids by Rapid Immunofilter Paper Assay”, Plant Disease, Vol (81), 167 - 170. 7. J.Y. Uchida and M. Aragaki (1991), “Phytophthora Diseases of Orchids in Hawaii”, Research extension series, Vol (129). 8. J. Y. Uchida and M. Aragaki (1991), “Fungal diseases of Dendrobium flowers”, Research extension series, Vol (133). 9. Janice Uchida (1995), “Bacterial diseases of Dendrobium”, Research extension series, Vol (158). 3.2.4. Bệnh thối mềm 3.2.4.1. Triệu chứng bệnh Đầu tiên, trên lá xuất hiện các vết tròn hoặc hình dạng không cố định màu xanh nhạt, trong. Các vết này lan rất nhanh, vùng bị bệnh úa mềm, sũng nước và có mùi hôi. Nếu vết bệnh xuất phát gần gốc lá, nó có thể làm thối phần gốc lá, gây rụng sớm. Nếu xuất phát từ đỉnh lá, nó sẽ làm thối toàn bộ lá. Hình 15. Khuẩn lạc vi khuẩn Pha4 trên môi trường King’s B (KbM) Hình 16. Vi khuẩn Pha4 dưới kính hiển vi quang học (x100)