Phân lập một số alcaloid từ lá cây muồng truổng zanthoxylum avicennae (lam.) dc. rutaceae

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 89 PHÂN LẬP MỘT SỐ ALCALOID TỪ LÁ CÂY MUỒNG TRUỔNG ZANTHOXYLUM AVICENNAE (LAM.) DC. RUTACEAE Bùi Nguyễn Biên Thùy*, Võ Văn Lẹo* TÓM TẮT Đặt vấn đề: Muồng truổng là một loài cây bụi phổ biến ở Trung Quốc và các nước Đông Nam Á như Việt Nam, Thái Lan, Lào, Campuchia, Cây này được dùng để chữa các bệnh như đau dạ dày, mẩn ngứa, ghẻ lở, phong thấp. Các công bố cho thấy thành phần hóa học của cây bao gồm alcaloid (dictamnin, skimmianin, magnoflorin), flavonoid và coumarin. Tuy nhiên, ở trong nước mới có vài nghiên cứu về cây này. Do vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu này nhằm phân lập và xác định cấu trúc một số chất có trong lá cây Muồng truổng, làm tiền đề cho các thử nghiệm sinh học và tiêu chuẩn hóa dược liệu sau này. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: lá Muồng truổng (Zanthoxylum avicennae Lam. DC.) thu hái tháng 12/2017 tại bán đảo Sơn Trà, Đà Nẵng. Dược liệu được chiết ngấm kiệt với cồn 80%, lắc phân bố với các dung môi có độ phân cực tăng dần. Sử dụng các kỹ thuật sắc ký cột để phân tách và phân lập các chất. Xác định cấu trúc các chất bằng các kỹ thuật phổ MS, NMR. Kết quả: dược liệu được chiết ngấm kiệt với cồn 80%, cao toàn phần được lắc phân bố lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần là n-hexan, cloroform, ethyl acetat. Từ cao cloroform đã phân lập được 4 alkaloid: γ-fagarin, skimmianin, 1-methyl-2-pentylquinolin-4(1H)-on và 2-heptyl-1-methylquinolin-4(1H)-on. Kết luận: từ cao cloroformy của lá loài Zanthoxylum avicennae đã phân lập được 4 alkaloid. Các hợp chất phân lập được sẽ làm tiền đề cho các thử nghiệm sinh học và làm chất chuẩn trong công tác tiêu chuẩn hóa dược liệu. Từ khóa: Zanthoxylum avicennae (Lam.) DC., γ-fagarin, skimmianin, 1-methyl-2-pentylquinolin- 4(1H)-on, 2-heptyl-1-methylquinolin-4(1H)-on. ABSTRACT ISOLATION OF SOME ALKALOIDS FROM THE LEAVES OF ZANTHOXYLUM AVICENNAE (LAM.) DC. RUTACEAE Bui Nguyen Bien Thuy, Vo Van Leo * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 - No 2- 2019: 89 – 94 Background: “Muong truong” is a popular shrub found in China and Southeast Asia countries (Vietnam, Thailand, Laos, Cambodia, ...). This plant has been used to treat diseases such as stomach pain, itchy rash, rash, rheumatism .... Its chemical constituents are reported to contain alkaloids (dictamnin, skimmianin, magnoflorin), flavonoids and coumarins. However, until now there are few studies on this plant in VietNam. So this study was carried out to isolate and determine the structure of some compounds from the leaves, which are used for further biological testing and for standardization of medicinal plants. Materials and methods: Leaves of Zanthoxylum avicennae (Lam.) DC. were collected in December, 2017 at Son Tra, Da Nang. The material was extracted with 80% ethanol, the obtained extract was distributed with n- hexan, chloroform, ethyl acetate. Compounds were isolated by using column chromatography techniques. Structures of isolated compounds were elucidated by MS, NMR spectroscopy methods. *Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: TS. Võ Văn Lẹo ĐT: 090 7060790 Email: vovanleo1956@uphcm.edu.vn Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 90 Results: Plant material was extracted with 80% ethanol. The ethanol extract was evaporated to a concentrated extract under reduced pressure. This extract was diluted with water and distributed with n- hexan, chloroform, ethyl acetate, respectively. From the chloroform extract, four alkaloids were isolated: γ- fagarine, skimmianine, 1-methyl-2-pentylquinolin-4(1H)-one, 2-heptyl-1-methylquinolin-4(1H)-one. Conclusion: From the chloroform extract of the leaves of Zanthoxylum avicennae, 4 alkaloids were isolated. The isolated compounds can be used in biological tests and in standardizations of medicinal plants. Keywords: Zanthoxylum avicennae (Lam.) DC., leave, γ-fagarine, skimmianine, 1-methyl-2- pentylquinolin-4(1H)-one, 2-heptyl-1-methylquinolin-4(1H)-one. ĐẶT VẤN ĐỀ Muồng truổng (Zanthoxylum avicennae (Lam.) DC.) là loài cây bụi mọc phổ biến ở Trung Quốc và các nước Đông Nam Á như Việt Nam, Thái Lan, Lào, Campuchia, . Ở Việt Nam, Muồng truổng mọc ở khắp nơi từ Bắc vào Nam, chủ yếu ở các tỉnh duyên hải miền Trung. Thành phần hóa học chính của cây Muồng truổng là alkaloid, coumarin, ngoài ra còn có flavonoid, terpenoid, sitosterol và acid hữu cơ(1,2); với các tác dụng dược lý nổi bật là kháng viêm, độc tế bào, bảo vệ gan(4) Nghiên cứu này được thực hiện với mục tiêu chiết xuất, phân lập một số hợp chất từ lá cây Muồng truổng nhằm đóng góp thêm về dữ liệu hóa học cho cây này và phục vụ cho một số thử nghiệm sinh học sau này. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu Nguyên liệu là lá Muồng truổng (5 kg) thu hái vào tháng 12/2017 tại bán đảo Sơn Trà, Đà Nẵng. Mẫu được định danh bằng phương pháp khảo sát hình thái thực vật và ly trích, giải trình tự ADN tại công ty phù sa Biochem, Vĩnh Long; so sánh kết quả với hệ thống ngân hàng gene NCBI (National center for Biotechnology Information); tên khoa học được xác định là Zanthoxylum avicennae (Lam.) DC., thuộc họ Cam (Rutaceae). Mẫu nghiên cứu được ký hiệu là ZA- 18 lưu tại Bộ môn Dược liệu, Khoa Dược, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh. Dung môi, hóa chất, trang thiết bị Ethanol 96%, n-hexan, ethyl acetat của Si- Tech Co.Ltd (Trung Quốc) ; cloroform, methanol của Labscan (Thái Lan). Phổ khối (APCI-MS, ESI-MS) được đo trên máy ALIGENT 1100 MC-LSD Trap của Viện công nghệ hóa học. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HSQC, HMBC được đo trong dung môi DMSO-d6 trên máy Bruker AM 500 FT-NMR spectrometer của Viện hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Chiết xuất, phân lập Dược liệu (5 kg) được xay nhỏ, chiết ngấm kiệt với cồn 80%, dịch chiết cồn được cô thu hồi dung môi dưới áp suất giảm, thu được cao cồn. Cao này được pha loãng với nước, lắc phân bố lỏng-lỏng với các dung môi n-hexan, cloroform, ethyl acetat, thu được các cao n- hexan cloroform và ethyl acetat tương ứng sau khi loại dung môi. Các phương pháp sắc ký Sắc ký lớp mỏng Thực hiện trên bản mỏng silica gel 60 F254 (Merk). Sau khi khai triển bằng dung môi thích hợp, phát hiện dưới đèn UV bước sóng 254 nm, 365 nm, thuốc thử VS và thuốc thử dragendroff. Sắc ký cột nhanh Chất hấp phụ là silica gel (TQ), kích thước hạt (40-63 µm). Nạp mẫu khô, khai triển bằng hệ dung môi n-hexan – cloroform – methanol (50:50:0 – 50:50:100). Sắc ký cột cổ điển Chất hấp phụ là silica gel, kích thước hạt (25-40 µm). Nạp mẫu khô, khai triển bằng hệ dung môi n-hexan – ethyl acetat (100:0 – 60:40). Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 91 Xác định cấu trúc các chất Phân tích dữ liệu phổ MS, phổ NMR và so sánh với tài liệu tham khảo. KẾT QUẢ Chiết xuất, phân lập Bột khô (5 kg) lá Zanthoxylum avicennae được chiết ngấm kiệt với ethanol 80%. Cô thu hồi dung môi thu được 2 lít dịch chiết đậm đặc. Dịch này được pha loãng với nước và lắc phân bố lần lượt với n-hexan, cloroform, ethyl acetat, cô thu hồi dung môi thu được 3 cao phân đoạn: n-hexan (56 g); cloroform (205 g) và ethyl acetat (16,5 g). Tiến hành sắc ký cột nhanh với 55 g cao cloroform, thu được 14 phân đoạn; tủa từ phân đoạn 2, 3 được lọc rửa, kết tinh nhiều lần thu được hợp chất 1 (67 mg) và hợp chất 2 (200 mg) tương ứng; phân đoạn 6 tiến hành sắc ký cột cổ điển với hệ dung môi n-hexan - ethyl acetat (100:0 – 60:40) thu được hợp chất 3 (190 mg) và hợp chất 4 (11 mg). Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của các chất phân lập được ghi nhận trong bảng 1 và 2 sau đây: Bảng 1: Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất 1 và 2 C CHn/NHn 1 (DMSO-d6, 125/500 MHz) 2 (DMSO-d6, 125/500 MHz) c ppm H ppm, mult., (J, Hz) c ppm H ppm, mult., (J, Hz) 2 C 162,6 - 163,8 - 3 C 103,5 - 101,7 - 4 C 156,2 - 156,7 - 5 CH 113,5 7,76 d (8,5) 117,8 7,96 d (9,0) 6 CH 123,6 7,39 t (5,5) 112,5 7,39 d (9,5) 7 C 108,4 7,17 d (8) 151,9 - 8 C 154,3 - 141,3 - 9 C 136,7 - 140,7 - 10 C 118,9 - 114,1 - 2’ CH 144,6 7,97 d (2,5) 143,7 7,97 d (2,5) 3’ CH 105,3 7,42 d (3,0) 105,4 7,42 d (3,0) 4-OCH3 59,4 4,44 s 59,4 4,42 s 7-OCH3 - - 56,5 3,95 s 8-OCH3 55,6 3,95 s 60,7 3,91 s Bảng 2: Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất 3 và 4 C CHn/NHn 3 (DMSO-d6, 125/500 MHz) 4 (DMSO-d6, 125/500 MHz) c ppm H ppm, mult., (J, Hz) c ppm H ppm, mult., (J, Hz) 2 C 155,3 - 155,3 - 3 CH 109,8 6,02 s 109,8 6,02 s 4 C 175,8 - 175,8 - 5 CH 125,2 8,15 dd (8,0; 8,0) 125,2 8,15 d (8,0) 6 CH 122,9 7,37 dd (8,0; 14,0) 122,9 7,36 t (8,0) 7 CH 131,9 7,69-7,72 m 131,9 7,69-7,72 m 8 CH 116,7 7,76 d (8,5) 116,7 7,76 d (9,0) 9 C 141,8 - 141,8 - 10 C 126,0 - 126,0 - N-CH3 34,2 3,73 s 34,2 3,73 s 1’ CH2 33,6 2,76 t (7,5) 33,6 2,75 t (7,5) 2’ CH2 28,5 1,31-1,39 m 27,6 1,61 t; 1,31-1,37 m 3’ CH2 27,9 1,57-1,62 m 30,7 1,31-1,37 m 4’ CH2 28,3 1,31-1,39 m 21,8 1,31-1,37 m 5’ CH2 31,1 1,23-1,29 m 13,8 (CH3) 0,88 t (7,0) 6’ CH2 22,0 1,23-1,29 m - - 7’ CH3 13,9 0,86 t (6,5) - - Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 92 BÀN LUẬN Hợp chất 1 Dạng tinh thể hình kim không màu. Phổ APCI-MS đo chế độ ion dương của 1 cho mảnh m/z 230,23; tương ứng với khối lượng phân tử 229. Phổ 13C-NMR có 13 tín hiệu carbon, kết hợp với phổ DEPT, nhận thấy có 6 tín hiệu C-IV ở 162,6; 156,2; 154,3; 136,7; 118,9; 103,5 ppm; 5 tín hiệu C-III ở 144,6; 123,6; 113,5; 108,4; 105,3 ppm; 2 tín hiệu -OCH3 ở 59,4; 55,6 ppm. Vậy công thức phân tử của hợp chất 1 là C13H11O3N, Ω = 9. Phổ 1H-NMR của 1 có cặp tín hiệu proton doublet ở δH 8,05 (H, d, J = 2,5 Hz) và 7,46 (H, d, J = 2,5 Hz) điển hình cho cặp H của vòng furano. Ba tín hiệu proton doublet ở δH 7,76 (H, d, J = 8,5 Hz); 7,46 (H, d, J = 8,0 Hz); 7,39 (H, t) điển hình cho 3 H của vòng phenyl. Từ những dữ liệu trên, sơ bộ nhận định hợp chất 1 là một alkaloid furoquinolin. Kết hợp với các dữ liệu phổ HSQC, HMBC và tài liệu tham khảo(3), nhận định hợp chất 1 là γ-fagarin. Hợp chất 2 Dạng tinh thể hình kim không màu. Phổ APCI-MS đo chế độ ion dương của hợp chất 2 cho mảnh [M+H]+ m/z 260,32; tương ứng với khối lượng phân tử 259. Phổ 13C-NMR có 14 tín hiệu carbon, kết hợp với phổ DEPT, nhận thấy có 7 tín hiệu C-IV ở 163,8; 156,7; 151,9; 141,3; 140,7; 114,1; 101,7 ppm; 4 tín hiệu C-III ở 143,7; 117,8; 112,5; 105,4 ppm; 3 tín hiệu -OCH3 ở 60,7; 59,4; 56,5 ppm. Vậy công thức phân tử của 2 là C14H13O4N, Ω = 9. Phổ 1H-NMR của 2 có cặp tín hiệu proton doublet ở δH 7,97 (H, d, J = 2,5 Hz) và 7,42 (H, d, J = 3,0 Hz) điển hình cho cặp H của vòng furano. Cặp tín hiệu proton doublet ở δH 7,96 (H, d, J = 9,0 Hz) và 7,39 (H, d, J = 9,5 Hz) điển hình cho cặp H ghép ortho. Từ những dữ liệu trên, sơ bộ nhận định hợp chất 2 là một alkaloid furoquinolin. Kết hợp với dữ liệu phổ HSQC, HMBC và tài liệu tham khảo(3); nhận định hợp chất 2 là skimmianin. Hợp chất 3 Dạng bột vô định hình màu trắng. Phổ ESI- MS đo chế độ ion dương của 3 cho mảnh m/z 258,1969; ứng với khối lượng phân tử 257. Phổ 13C-NMR có 17 tín hiệu carbon, kết hợp với phổ DEPT, nhận thấy có 4 tín hiệu C-IV ở 175,8; 155,3; 141,8; 126,0 ppm; 5 tín hiệu CH ở 131,9; 125,2; 122,9; 116,7; 109,8 ppm; 6 tín hiệu CH2 ở 33,6; 31,1; 28,5; 28,3; 27,9; 22,0 ppm; 1 tín hiệu CH3 ở 13,9 ppm; 1 tín hiệu N-CH3 ở 34,2 ppm. Vậy công thức phân tử của 3 là C17H23ON, Ω = 7. Phổ 1H-NMR của 3 có các tín hiệu của proton vòng phenyl, một tín hiệu của proton gắn với nguyên tử có độ âm điện lớn 3,73 (3H, s) là tín hiệu của proton nhóm methyl gắn với N. Các tín hiệu proton của các carbon (22,0 đến 33,6 ppm) đặc trưng cho một nhánh heptyl. Từ các dữ liệu trên, nhận định hợp chất 3 là một alkaloid quinolin, gắn với một nhánh heptyl. Kết hợp các dữ liệu phổ HSQC, HMBC, nhận định chất 3 là 2-heptyl- 1-methylquinolin-4 (1H)-on. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 93 Hợp chất 4 Bột vô định hình màu trắng. Phổ ESI-MS đo chế độ ion dương của 4 cho mảnh m/z 230,1627 [M+H]+; ứng với khối lượng phân tử 229. Phổ 13C-NMR có 15 tín hiệu carbon, kết hợp với phổ DEPT, nhận thấy có 4 tín hiệu C- IV ở 175,8; 155,3; 141,8; 126,0 ppm; 5 tín hiệu CH ở 131,8; 125,2; 122,9; 116,7; 109,8 ppm; 4 tín hiệu CH2 ở 33,6; 30,7; 27,6; 21,8 ppm; 1 tín hiệu CH3 ở 13,8 ppm và 1 tín hiệu N-CH3 ở 34,2 ppm. Vậy công thức phân tử của 4 là C17H23ON, Ω = 7. Phổ 1H-NMR của 4 có các tín hiệu của proton vòng phenyl, một tín hiệu của proton gắn với nguyên tử có độ âm điện lớn 3,73 (3H, s) là tín hiệu của proton nhóm methyl gắn với N. Các tín hiệu proton của các carbon (21,8 đến 33,6 ppm) đặc trưng cho một nhánh pentyl. Từ các dữ liệu trên, nhận định hợp chất 4 là một alkaloid quinolin, gắn với một nhánh pentyl. Kết hợp các dữ liệu phổ HSQC, HMBC, nhận định 4 là 1-methyl-2- pentylquinolin-4 (1H)-on. (1): R = H: γ-fagarin (2): R = OCH3: Skimmianin (3): R’ = n-C7H15: 2-heptyl-1-methylquinolin-4 (1H)-on (4): R’ = n-C5H11: 1-methyl-2-pentylquinolin-4 (1H)-on Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 94 KẾT LUẬN Từ cao cloroform của lá Muồng truổng đã phân lập được 4 hợp chất alkaloid là γ- fagarin, skimmianin, 1-methyl-2- pentylquinolin-4(1H)-on, 2-heptyl-1-methyl quinolin-4(1H)-on. Hợp chất 2-heptyl-1- methylquinolin-4 (1H)-on lần đầu tiên được phân lập từ loài Zanthoxylum avicennae. Các hợp chất alkaloid này có tác dụng sinh học chính là kháng viêm, gây độc tế bào. Các chất được phân lập là tiền đề cho các thử nghiệm dược lý và tiêu chuẩn hóa dược liệu. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Chen JJ, Wang TY, and Hwang TL (2008), "Neolignans, a Coumarinolignan, Lignan Derivatives, and a Chromene: Anti-inflammatory Constituents from Zanthoxylum avicennae", Journal of Natural Products, 71, pp. 212-217. 2. Chen JJ, Yang CK, Kuo YH, Hwang TL, Kuo WL, Lim YP, Sung PJ, Chang TH, and Cheng MJ (2015), "New Coumarin Derivatives and Other Constituents from the Stem Bark of Zanthoxylum avicennae: Effects on Neutrophil Pro- Inflammatory Responses", International Journal of Molecular Sciences, 16, pp. 9719-9731. 3. Enrique Cu, Elkin PM, Lozano JM, and Delle MF (2009), "Biological activity of secondary metabolites from Peltostigma guatemalense", Natural Product Research, 23, (4), pp. 370-374. 4. Viện Dược Liệu (2006), Cây thuốc và động vật làm thuốc, Hà Nội, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, tr. 322-323. Ngày nhận bài báo: 18/10/2018 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 01/11/2018 Ngày bài báo được đăng: 15/03/2019