Nuôi cấy mô sẹo và tế bào đơn tạo và chọn dòng đột biện và thu nhận các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học

NUƠI CẤY MƠ SẸO VÀ TẾ BÀO ĐƠN TẠO VÀ CHỌN DỊNG ĐỘT BIỆN VÀ THU NHẬN CÁC CHẤT THỨ CẤP CĨ HOẠT TÍNH SINH HỌC A-NUƠI CẤY MƠ SẸO 1-Sự hình thành mơ sẹo Nuơi cấy mơ sẹo là khâu rất quan trọng trong nuơi cấy mơ tế bào. Mơ sẹo là nguyên liệu khởi đầu cho các nghiên cứu quan trọng khác như: phân hĩa mơ và tế bào, chọn dịng tế bào, nuơi cấy tế bào trần, nuơi cấy tế bào đơn, nuơi cấy phơi soma, sản xuất các chất thứ cấp cĩ hoạt tính sinh học…. Màu sắc của mơ sẹo khơng giống nhau trên các mơi trường nuơi cấy khác nhau hay trên các bộ phận khác nhau và chúng thường cĩ màu vàng, trắng, nâu hay trắng xanh… Nồng độ và loại kích thích tố sử dụng trong mơi trường nuơi cấy là những yếu tố cĩ ảnh hưởng đến sự hình thành và phát triển mơ sẹo. Thường mơ sẹo được hình thành trên mơi trường giàu auxin; cĩ thể dùng auxin riêng rẽ hay kết hợp với nhau hoặc cĩ thể kết hợp với cytokinin tuỳ từng loại cây. Cơ sở sinh lí:tính tồn năng -Là khả năng của 1 tế bào hình thành 1 cây hịan chỉnh trong điều kiện nuơi cấy thích hợp, do trong tế bào cĩ chứa bộ ADN(NST) hồn chỉnh, chứa tồn bộ thơng tin di truyền cho 1 chu kì sống hồn chỉnh. Mơ sẹo là một khối tế bào khơng cĩ tổ chức, hình thành từ các mơ và các cơ quan phân hĩa dưới các điều kiện đặc biệt (cĩ vết thương, xử lý các chất điều hồ sinh trưởng thực vật…). Các tế bào thuộc các mơ hoặc cơ quan này phải chịu một sự phản phân hĩa trước lần phân chia đầu tiên Mơ sẹo là một khối tế bào phát sinh khơng định hướng và khơng kiểm sốt được,cĩ hình dạng khơng nhất định,do khơng cĩ lớp nhu mơ.Phát triển khơng theo quy luật nhưng cĩ khả năng biệt hĩa thành rễ ,chồi và phơi để hình thành hầu hết các bộ phận hồn chỉnh của cây.Tùy từng tế bào, từng loại mơ, từng thời kì sinh trưởng, phát triển mà các gen phù hợp hoạt động; các gen khơng cùng hoạt động như nhau trong các giai đoạn phát triển của cơ thể (do cơ chế điều hịa hoạt động của gen). Sự hình thành mơ sẹo gồm 3 giai đoạn :phát sinh mơ sẹo,phân chia tế bào và biệt hĩa. Giai đoạn 1: trong phase phát sinh mơ sẹo sự trao đổi chất kích thích tế bào chuẩn bị phân chia, giai đoạn này dài hay ngắn phụ thuộc vào tình trạng sinh lí của mơ và điều kiện nuơi cấy. Giai đoạn 2: tế bào phân chia tăng sinh khối. Giai đoạn 3 : xuất hiện sự biệt hĩa tế bào và các con đường trao đồi chất sản xuất chất thứ cấp cĩ hoạt tính sinh học.. Một vấn đề quan tâm trong nuơi cấy mơ sẹo là sự biến tính tế bào do độ già của mẫu, sự thay đổi tế bào chất của nhân, thời gian duy trì , điều kiện nuơi cấy, thành phần mơi trường, nhất là chất sinh trưởng (thường tổ hộp thành 4 nhĩm : Auxin, Cytokinin, Auxin + Cytokinin, dịch chiết). Các dịch chiết tự nhiên như dịch chiết khoai tây, dịch chiết nấm và một số chất khác như vitamin C, nước dừa có tác dụng tích cực cho tạo phôi, mô sẹo. Trong một số ít trường hợp ethylen kích thích tạo mô sẹo. Hàm lượng hormon nội sinh và chiều di chuyển của các hormon này trong mẫu cấy cĩ ảnh hưởng đến sự phát sinh mơ sẹo. Vì vậy nguồn mẫu cấy, việc lấy mẫu cấy, cách đặt mẫu cấy trên mơi trường nuơi cấy sẽ ảnh hưởng đến sự phát sinh mơ sẹo dẫn đến những phản ứng khác nhau của mẫu cấy. Mô già do lâu không cấy chuyển hoặc mô qua cấy chuyển nhiều lần thường cho tỉ lệ tái sinh thấp hoặc mất khả năng tái sinh. Các đặc tính thường gặp trong nuơi cấy mơ sẹo:Phân hĩa: 1 tế bào ,1khối tế bào(phân hĩa) mơ cơ quan hệ cơ quan. Phản phân hĩa: khi các tế bào đã phân hĩa thành các mơ chức năng riêng biệt nhưng vẫn cĩ thể quay về trạng thái chức năng phơi sinh ban đầu khi gặp điều kiện thuận lợi. Các đặc tính trên được xác định dựa trên cơ sở là đặc điểm di truyền nhưng sự thay đổi mơi trường cũng cĩ ảnh hưởng trực tiếp đến các đặc tính đĩ. Mơ sẹo được hình thành từ mặt cắt của thân hay của rễ:tế bào nhu mơ và thành phần tế bào rây.Qua sự biệt hĩa tế bào hình thành những chất liệu cấu tạo nhu mơ các loại,các tế bào rây...hơn nữa hình thành mơ phân sinh,trung tâm của sự tạo nên chồi và rễ;biệt hĩa tạo thành mơ sẹo phát sinh phơi để hình thành cây hồn chỉnh. 2-Sự hình thành chồi từ mơ sẹo Được điều khiển bằng: - Các chất sinh trưởng đi vào mơi trường -Điều kiện nuơi cấy. -Dịch chiết -Tỷ lệ cytokinin/auxin Sự hình thành chồi nhiều khi lại xảy ra trên mơi trường khơng sinh trưởng,hay cĩ cytotinin và khơng cĩ auxin. Quá trình hình thành cơ quan trong mơ xảy ra qua 2 giai đoạn: - Giai đoạn thứ nhất là tái phân hĩa. Trong giai đoạn này xảy ra quá trình chuyển các tế bào biệt hĩa thành mơ sẹo - Giai đoạn thứ hai là hình thành các mầm mống cơ quan. Bằng phương pháp phĩng xạ tế bào đã thấy rằng những tế bào của các mầm mống nhu mơ mà ở đấy được hình thành mầm mống cơ quan, tổng hợp DNA và protein xảy ra rất mạnh, hàm lượng đường cũng tăng. Trong quá trình phân hĩa, ở các mơ sẹo khơng cĩ tổ chức được hình thành các cấu trúc hình thái dẫn đến việc tạo chồi, rễ, cành, hoa và cây hồn chỉnh. Quá trình phân hĩa này cĩ thể thực hiện bằng cách thay đổi một số chất và các chất điều hịa sinh trưởng trong mơi trường nuơi cấy Đối với mơ sẹo, xu thế tạo cơ quan giảm dần khi mơ cấy chuyền nhiều lần vì khi cấy chuyển nhiều lần như thế thường hình thành các tế bào đa bội và lệch bội, ngồi ra cĩ thể mất các yếu tố di truyền. Theo Vũ Văn Vụ (1999) mơ sẹo khi hình thành thường cĩ 2 loại: • Loại xốp: chứa nhiều tế bào xốp với nhân nhỏ, tế bào chất lỏng và khơng bào to. • Loại cứng: Các tế bào cứng, chắc thành khối, nhân to, tế bào chất đậm đặc và khơng bào nhỏ. Dạng mơ sẹo cũng cĩ ảnh hưởng đến khả năng tái sinh cơ quan của khối mơ. Khả năng tái sinh chồi sớm mất đi ở mơ sẹo xốp nhưng vẫn duy trì ở mơ sẹo cứng. Nguyên nhân cĩ thể do các tế bào mơ sẹo sẽ mất đi khả năng tổng hợp một số chất thiết yếu cho sự tái sinh của nĩ khi số lần cấy chuyền tăng lên ( Gautht, 1962). Vì vậy khi nuơi cấy mơ sẹo nhằm mục đích tái sinh chồi, nhất thiết phải cố gắng tìm điểu kiện mơi trường thích hợp cho sự hình thành các khối mơ sẹo cứng, chắc; các mơ sẹo xốp cần được loại bỏ trong các lần cấy chuyền vì đơi khi dạng mơ sẹo này phát triển rất nhanh và lấn át cả các mơ sẹo cứng cĩ khả năng tái sinh phơi. 3-Tính bất định về mặt di truyềnKỹ thuật nhân giống vơ tính áp dụng với mục đích tạo quần thể cây trồng đồng nhất với số lượng lớn nhưng phương pháp cũng tạo ra những biến dị tế bào soma qua nuơi cấy mơ sẹo. Những biến dị này cũng là cơ sở nghiên cứu ứng dụng vào cải thiện giống cây trồng nhưng thực tế cĩ rất ít biến dị cĩ lợi được báo cáo. Tần số biến dị thì hồn tồn khác nhau và khơng lặp lại (Creissen và Karp 1985; Fish và Karp 1986). Nuơi cấy mơ sẹo cho biến dị nhiều hơn nuơi cấy chồi đỉnh. Cây trồng bị biến dị tế bào soma qua nuơi cấy thường là biến dị về chất lượng , số lượng và năng suất và biến dị này khơng di truyền. Đến nay việc gây ra biến dị chưa được làm sáng tỏ nhưng được đồng ý nhất là do thay đổi vị trí DNA. Nhân tố thường gây ra biến dị tế bào là số lần cấy chuyền. Số lần cấy chuyền càng nhiều càng cho độ biến dị cao. Biến dị nhiễm sắc thể nhiều hơn khi nuơi cấy kéo dài (Amstrong và Phillips, 1988). Số lần cấy chuyền ít và thời gian giữa hai lần cấy chuyền ngắn làm giảm sự biến dị. 4-So sánh vi nhân giống và nuôi cấy mô sẹo Các chồi nhân ban đầu thường được tạo từ đỉnh chồi hoặc đỉnh mô phân sinh trên môi trường thạch chứa các muối khoáng, cabonhydrat, vitamin và các chất điều hòa sinh trưởng. Vi nhân giống được bắt đầu bằng tách đỉnh chồi hoặc mô phân sinh từ các cây định nhân sau đó khử trùng và đưa vào nuôi cấy ở môi trường phù hợp. Sự phát triển nhanh của mô nuôi cấy phụ thuộc vào ánh sáng và nhiệt độ. Chồi được nhân lên sau 3 đến 4 tuần. Các chồi hình thành lại được tách ra chuyển sang môi trường mới và qui trình cứ thế được lặp lại. Trong một số trường hợp, rễ có thể tạo ngay trên môi trường nhân, trong một số trường hợp khác, chồi nhân phải chuyển sang môi trường có auxin hoặc không có auxin để tạo rễ. Đây là phương pháp nhân cho hệ số nhân thấp hơn phương pháp nhân qua giai đoạn mô sẹo hoặc phôi, nhưng các chồi nhân giữ lại được những đặc điểm của phôi gốc, ít hoặc không bị thay đổi về mặt di truyền. Hiện nay nhờ phát triển những môi trường và hệ thống nhân phù hợp, hệ số nhân đã được tăng lên nhiều (58 – 515 chồi/tháng). Đặc biệt là nhân chồi trong môi trường lỏng có lắc hoặc nhân trong các reactor. Trong một số trường hợp, vi nhân giống có thể thực hiện thông qua việc tạo phôi hoặc tái sinh cây thẳng từ mô sẹo. Phương pháp này cho hệ số nhân cao hơn, nhưng thường kéo theo sự biến dị sôma nên trước khi chuyển sang giai đoạn nhân đại trà cần kiểm tra kỹ những thay đổi về di truyền. B-Nuơi cấy dịch huyền phù tế bào đơn: Nuơi cấy tế bào đơn: Nuơi cấy tế bào đơn là nuơi cấy dịch huyền phù chứa nhiều tế bào liên kết với nhau. Những tế bào trải qua quá trình nuơi cấy và sinh trưởng trong dịch huyền phù gọi là dịng tế bào. Bản thân những tế bào thực vật là một đơn vị độc lập, nĩ chứa đựng tất cả những thơng tin di truyền của cơ thể từ đĩ nĩ sinh ra. Cho nên mỗi tế bào cĩ thể xây dựng lại tồn bộ cơ thể mới nhờ vào tính tồn thế. Thực vật bậc cao là một nguồn cung cấp các hợp chất hố học và dược liệu rất quan trọng. Tuy nhiên trong những năm gần đây, sản lượng các thực vật đĩ rất khĩ đảm bảo ở mức ổn định do hậu quả của một số yếu tố như: Điều kiện tự nhiên khơng thuận lợi Chi phí lao động ngày càng tăng Khĩ khăn kỵ thuật & kinh tế trong trồng trọt Phương pháp nuơi cấy tế bào dịch huyền phù (dịch lỏng) của thực vật cĩ khả năng gĩp phần giải quyết những khĩ khăn trên. Những tế bào trải qua quá trình nuơi cấy và sinh trưởng trong dịch huyền phù gọi là dịng tế bào. Dịng tế bào cĩ những đặc điểm sau: Khả năng tách tế bào cao. Phát sinh hình thái đồng nhất. Nhân to và tế bào chất đậm đặc. Nhiều hạt tinh bột. Cĩ những dẫn liệu tạo cơ quan. Cĩ khả năng nhân đơi trong 24-72 giờ. Mất tính tồn thế. Cân bằng chất sinh trưởng. Tăng mức đa bội thể. Dịch huyền phù được tạo ra do sự nuơi cấy một mảnh mơ sẹo cĩ khả năng biệt hĩa trong mơi trường lỏng, và được chuyển động trong suốt thời gian nuơi cấy. Dù thời gian nuơi cấy kéo dài, cĩ thể nuơi cấy một mảnh mơ biệt hĩa vào trong mơi trường (thân mềm hay lá mầm), thì những tế bào nuơi cấy sẽ ở trạng thái tự do. Tuy nhiên, khơng cĩ dịch huyền phù nào chỉ cĩ tế bào đơn, các tế bào liên kết với nhau với các kích thước khác nhau, các tế bào đang phân chia và các tế bào chết. Danh từ xốp dùng để chỉ tế bào tách rời nhau sau khi phân chia. Sự hình thành dịch huyền phù hồn hảo là một phức hợp cĩ thể thực hiện được hơn là tìm điều kiện tách rời tế bào. Mức độ tách rời tế bào trong nuơi cấy phụ thuộc vào khả năng tạo nhiều tế bào xốp, và được điều khiển bởi mơi trường. Tăng tỷ lệ cytokinin/auxin, trong vài trường hợp, sản xuất nhiều tế bào xốp. Việc chọn lựa mơi trường và điều kiện nuơi cấy thích hợp là nghiên cứu đầu tiên trong nuơi cấy tế bào đơn. Cần cĩ một lượng mơ sẹo ban đầu thích hợp là 2-3g/100cm3. Khi mơ sẹo được cấy vào dịch lỏng ta cĩ ngay giai đoạn lag-phase, đây là giai đoạn đầu tiên cho tới khi cĩ dấu hiệu phân chia tế bào đầu tiên, sau đĩ là giai đoạn exponenial-phase và linear-phase, là giai đoạn tế bào phân chia, tế bào tăng số lương và tăng quần thể nhanh, sau cùng tế bào đi vào giai đoạn stationary-phase, là giai đoạn tế bào khơng phân chia, lượng tế bào sinh ra và chết cân bằng nhau, và tế bào được cấy truyền vào cuối giai đoạn linera-phase. Vì thời gian của tế bào trong giai đoạn stationary-phase khác nhau đối với các vật liệu tế bào khác nhau, nên thường cấy truyền vào giai đoạn này được xác định là do kinh nghiệm, và tế bào được cấy truyền khi độ đậm đặc của tế bào đạt cao nhất, thường 18-20 ngày sau cấy, trong sự cấy truyền đầu tiên, thường dùng một rây lọc để tách tế bào mơ sẹo cấy vào đầu tiên và những tế bào dính cụm và cuối cùng dùng pipet để hút dung dịch huyền phù cấy truyền. Lượng tế bào cấy truyền cần phải xác đinh vì dưới mức đĩ tế bào khơng sinh trưởng, như ở Acer pseudoplantanus là 9-15x103 tb/cm3. Nuơi cấy tế bào thường thực hiện trong bình tam giác 250-300ml, dịch huyền phù cấy vào chiếm 20% thể tích, bình tam giác được đặt trong một máy lắc, tốc độ 100-120 vịng/phút cho sự trao đổi khí được thuận lợi. Hiện nay cĩ những hệ thống nuơi cấy lỏng hiện đại cho phép nghiên cứu một cách sâu sắc: sự sinh trưởng của tế bào, sinh lý dinh dưỡng, sản xuất các chất thứ cấp, phát sinh phơi soma, di truyền đột biến ở thực vật. Những tiến bộ của kỹ thuật này trong những năm gần đây đã được nhiều cơng trình tổng kết. Nuơi cấy tế bào thực vật trong điều kiện in vitro để sản xuất các chất tự nhiên cĩ một số ưu điểm sau: - Các tế bào thực vật cĩ thể được nuơi cấy trong các điều kiện nhân tạo mà khơng phụ thuộc vào thời tiết và địa lý. Khơng cần phải vận chuyển và bảo quản một số lượng lớn các nguyên liệu thơ. - Cĩ thể kiểm sốt chất lượng và hiệu suất của sản phẩm bằng cách loại bỏ các trở ngại trong quá trình sản xuất thực vật, như là chất lượng của nguyên liệu thơ và sự đồng nhất giữa các lơ sản xuất. - Một số sản phẩm trao đổi chất cĩ thể được sản xuất từ nuơi cấy dịch huyền phù cĩ chất lượng cao hơn trong cây hồn chỉnh. Thách thức lớn nhất đối với cơng nghệ tế bào thực vật là sự ổn định cho phép nuơi cấy tế bào thực vật trên quy mơ lớn và đạt hiệu suất tối đa cho sự tích lũy và sản xuất các hợp chất tự nhiên (hay cịn gọi là các sản phẩm thứ cấp). Điều này cĩ thể thực hiện bằng cách chọn lọc các kiểu gen thích hợp và các dịng tế bào cĩ sản lượng cao, xây dựng các cơng thức mơi trường dinh dưỡng hợp lý để nuơi cấy tế bào, thiết kế và vận hành các hệ thống nuơi cấy tế bào (bioreactor) hiệu quả. Chúng ta cũng cĩ thể sử dụng kinh nghiệm và kiến thức cĩ được từ nuơi cấy vi sinh vật để áp dụng cho nuơi cấy tế bào thực vật. Tuy nhiên, tế bào thực vật và vi sinh vật cĩ một số đặc điểm khác nhau, vì thế cần phải cải biến và điều chỉnh các điều kiện nuơi cấy cũng như cấu hình của nồi phản ứng (bioreactor) để tìm được các yêu cầu đặc thù của nuơi cấy tế bào thực vật. Những hệ thống nuơi cấy dịch huyền phù tế bào đơn: Nuơi cấy batch trên máy lắc: Nuơi cấy batch cĩ thể được hiểu nuơi cấy một thể tích DHPTB cố định tăng sinh khối do sự phân bào và sinh trưởng tế bào ngay cả khi một tác nhân trong mơi trường cĩ giới hạn.Trong đĩ mơi trường khơng thay đổi,tế bào dịch huyền phù phát triển ổn định theo các pha. Mơi trường nuơi cấy DHPTB tương tự như mơi trường nuơi cấy tăng sinh mơ sẹo tốt nhất; tuy nhiên, mơi trường cần bổ sung các hormone thực vật thích hợp để tốc độ tăng sinh nhanh và tách tế bào tốt nhất trong mơi trường nuơi cấy tạo mơ sẹo để tạo mơ xốp. Máy lắc vịng được sử dụng phổ biến để nhân nhanh sinh khối DHPTB. Tốc độ thay đổi 30-150 vịng/phút. Máy lắc đặt trong phịng thí nghiệm cĩ nhiệt độ 24-300C. Hệ thống đèn chiếu trắng được thiết kế bên trên máy lắc và cĩ thể bao các bình nuơi cấy bằng giấy nhơm nếu muốn nuơi cấy trong tối. Nuơi cấy batch trong qui mơ cơng nghiệp: Trong đĩ sự sục khí và phân tán tế bào thực hiện được trong những bình cĩ trục quay cĩ tốc độ 120 vịng/phút với độ nghiên 450 so với mặt nằm ngang được sử dụng để nghiên cứu động thái và trao đổi nucleic acid. Mơi trường ban đầu ổn định,nhưn sau đĩ cĩ thể được thay đổi để điều khiển sự biệt hĩa. Bằng cách điều khiển sự trao đổi khí và phân bố tế bào bằng áp lực thổi khí hay thổi khí kết hợp với cuốn dịng chảy theo từ trường cĩ khả năng thiết kế các hệ thống nuơi cấy batch chuyên biệt hơn và từ đĩ phát triển hệ thống nuơi cấy liên tục kín hay mở. Ưu điểm: Tăng qui mơ tế bào và mơi trường nuơi cấy để phân tích hĩa sinh. Cĩ thể nghiên cứu tiến trình sinh trưởng và trao đổi chất trong cùng một bình nuơi cấy. Cĩ thể thay đổi mơi trường nuơi cấy. Cĩ thể xác định tiến trình biệt hĩa bằng cách điều khiển các điều kiện trong giai đoạn nhân nhanh tế bào. Sự phân chia tế bào cùng lúc sau 5 thế hệ nuơi cấy, trong những thế hệ nuơi cấy đĩ cho phép phân tích trình tự những thay đổi hĩa sinh giữa các lần phân bào... Hệ thống nuơi cấy liên tục kín: Nuơi cấy kín là một hệ thống mà tế bào được duy trì cĩ sự gia tăng về mật độ tế bào trong khi sinh trưởng vẫn tiếp tục. Một hệ thống nuơi cấy liên tục kín là một hệ thống dinh dưỡng cĩ thể được bổ sung liên tục trong quá trình nuơi cấy và được cân bằng với mơi trường loại thảy đi. Tính chất đặc biệt của hệ thống này cĩ các dây dẫn và các van mở. Mơi trường đã sử dụng sẽ chảy vào hệ thống này, các tế bào được giữ lại bằng màng chắn, và mơi trường khơng chứa tế bào qua van ra ngồi. Hệ thống này rất thích hợp cho trình tự xử lí, vì mơi trường đã sử dụng cĩ thể đưa ra ngồi, được phân tích về hấp thu dinh dưỡng và các chất thứ cấp sinh ra trong quá trình nuơi cấy so với mơi trường chuẩn. Tuy nhiên, vẫn chưa cĩ các nghiên cứu là quần thể tế bào trong nuơi cấy duy trì sự ổn định và khơng phân chia trong bao lâu. Nếu sự nuơi cấy duy trì cĩ thể thực hiện được, cĩ thể đưa tế bào vào con đường biệt hĩa bằng cách bổ sung hỗn hợp các chất điều hịa sinh trưởng ngoại sinh. Trong nuơi cấy duy trì cĩ thể tích tụ các chất thứ cấp trong dịch huyền phù tế bào khi sự sinh trưởng bị giới hạn. Nuơi cấy duy trì trong hệ thống nuơi cấy liên tục kín cĩ khả năng sản xuất các chất được thu hồi liên tục từ sinh khối nuơi cấy cố định. Hạn chế: Trong nuơi cấy tế bào thực vật cĩ tiềm năng là hệ thống sinh tổng hợp mang tính thương mại sinh trưởng rất chậm so với vi sinh vật. Nếu sinh khối lớn bị mất chức năng, qua nuơi cấy kéo dài, một sản phẩm thứ cấp hay một dẫn xuất từ một tiền chất được cung cấp, kế đến là thời gian cần thiết để sinh trưởng đạt sinh khối thì hiệu quả kinh tế sẽ thấp. Hơn nữa, khả năng của một hệ thống nuơi cấy liên tục kín cĩ thể sản xuất khơng đổi các chất trao đổi trong biến dưỡng cĩ thể là một bể nguồn sinh học, ngăn chặn bất kỳ các phản ứng ức chế ngược quá trình tổng hợp. Nĩ cĩ thể ngưng sản xuất các chất thứ cấp khi cĩ một tác nhân ảnh hưởng ngăn chặn tích tụ. Nếu tế bào nuơi cấy tổng hợp và duy trì một chất nào đĩ cĩ thể phát hiện bằng phương pháp hấp thu hay so màu bằng màu hay bằng các phản ứng hĩa sinh với các chất xúc tác khơng độc hại, cĩ thể phát hiện những chất đột biến bằng cách dịng hĩa tế bào và phân tích vùng mơi trường bán rắn xung quanh colony. Hệ thống nuơi cấy liên tục mở: Hệ thống nuơi cấy liên tục mở là hệ thống cĩ điều khiển mơi trường cho vào và cân bằng mơi trường được lấy ra. Nĩ cho phép hình thành trạng thái sinh trưởng và trao đổi chất, nghiên cứu những thay đổi xuất hiện khi chuyển từ trạng thái này sang trạng thái khác, và xác định được các tác nhân kiểm sốt. Hệ thống mở cĩ thể là chemostat hay turbidostat. Hệ thống chemostat được áp dụng để nghiên cứu trạng thái vào lúc mà tốc độ sinh trưởng tế bào thì thấp hơn tốc độ sinh trưởng cực đại cĩ thể cĩ với các dịng tế bào đặc biệt, mơi trường nuơi cấy và những điều kiện vật lý trong nuơi cấy được kiểm sốt. Mật độ tế bào ổn định cĩ thể đạt được trong chemostat khi một kết quả của một thể tích giữa tộc độ hịa tan và thời gian trung bình của một thế hệ tế bào khi D và µ bằng nhau. Sự tương quan giữa µ và g là loge2/g=0,69/g=µ. Bằng cách tăng tốc độ dịng chảy và tơc độ hịa tan và việc cung cấp dinh dưỡng giới hạn, thì tốc độ sinh trưởng đặc biệt, mới và đồng dạng và một kết quả mới về nồng độ tế bào thấp, cố định và mới xuất hiện. Cuối cùng nếu tốc độ hịa tan gia tăng phát triển, thì sẽ đạt tới tốc độ hịa tan mà thể tích =µmax. Bất kỳ một sự gia tăng tốc độ hịa tan đều dẫn đến rửa sạch tế bào. Nếu hệ thống chemostat được điều khiển chỉ khi nào dưới tốc độ hịa tan. Ngược lại, trong hệ thống turbidostat, thực nghiệm được tiến hành với mật độ tế bào thấp vào thời điểm sinh trưởng tiếp cận hay là ở µmax. Khơng cĩ vấn đề rửa sạch tế bào như nếu hoạt động ở mật độ tế bào cao sự nuơi cấy gia tăng dẫn đến ngừng sinh trưởng. Sự phát triển của các hệ thống nuơi cấy liên tục được thiết kế cho nuơi cấy vơ trùng kéo dài và đạ DHPTB cao được bổ sung bởi các thí nghiệm mở rộng nhằm nghiêm cứu về sinh lý tế bào một lĩnh vực cịn chưa được tiếp cận sâu sắc. Để giới thiệu về hướng nghiêm cứu mới này, điều cần ghi nhận là các thành phần sinh trưởng và trao đổi chất được nghiên cứu trong nuơi cấy batch và được nhìn thấy sự liên quan như thế nào đến trạng thái ổn định đạt được trong những hệ thống nuơi cấy liên tục. Sinh trưởng và trao đổi chất ở tế bào thực vật trong nuơi cấy batch: Trong suốt giai đoạn lag-phase, tế bào giai đoạn stasionary- phase trong nuơi cấy phát triển một sinh khối tổng hợp tế bào chất mới và các cơ quan tử liên hệ, lặp lại DNA và bắt đầu phân chia. Kế là giai đoạn cĩ tốc độ phân bào giới hạn khơng đổi và cực đại (µmax). Trong suốt giai đoạn này, thể tích tế bào trung bình giảm nhanh. Sự sinh trưởng bắt đầu giảm, và tế bào đi vào giai đoạn stationary-phase. Nếu trong giai đoạn này thành phần sinh trưởng đã được xác định, trên cơ sở một tế bào, các hoạt động sinh lý, thành phần trong từng tế bào, và sự hoạt động của từng enzyme, cĩ thể gia tăng hay giảm thấp các thành phần trao đổi. Như vậy trong tiến trình nuơi cấy batch, tế bào nuơi cấy trải qua một loạt tình trạng sinh lý trái ngược nhau vây quanh tế bào trong chuyển hĩa vào trạng thái meristem: tế bào thể hiện hoạt động đỉnh sinh trưởng cao, tế bào trải qua các con đường trao đổi chất giới hạn nhất định. Cĩ những thay đổi nhỏ trong sinh lý được quan tâm phản ảnh sự điều khiển aloosteric và các tiến trình điều khiển trao đổi chất, được gọi là modul để nhận ra chúng từ biệt hĩa tế bào. Sự chuyển hĩa tự nhiên một cách nhất định những thay đổi được thảo luận ở trên cĩ liên hệ với nuơi cấy batch tế bào xác nhận khả năng chuyển hĩa ngược. Tuy nhiên, việc chấp nhận tính tồn thế khi nĩ được phát triển từ nghiên cứu nuơi cấy mơ thực vật cho thấy cĩ những thay đổi trong biệt hĩa tế bào thì đều trái ngược: là tế bào thực vật biệt hĩa đang sinh trưởng cĩ thể, dưới những kích thích thích hợp, một lần nữa trở về điều kiện phát sinh hợp tử. Hơn nữa, ngay cả khi, trong sự phát sinh mơ sẹo, sự đạt đến khả năng hoạt động phân bào ở tế bào thực vật thì khơng liên quan đến sự đạt đến tính tồn thế, tế bào xuất hiện mất các tính chất đặc biệt cĩ liên quan đến cơ quan nơi mà nĩ xuất phát. Trạng thái ổn định về sinh trưởng và trao đổi chất trong những hệ thống nuơi cấy liên tục mở: Trong nuơi cấy DHPTB Acer pseudoplatanus L, sử dụng mơi trường nuơi cấy đơn cho thấy trạng thái ổn định kéo dài cĩ thể đạt được. Trạng thái cân bằng của tế bào: Cĩ đặc tính được xác định bằng số tế bào đầu tiên, thể tích tế bào đậm đặc, trọng lượng khơ tế bào, thành phần protein, DNA và RNA và tốc độ hơ hấp. Cĩ tốc độ khơng đổi đồng hĩa nitrogen, khơng đổi nồng độ các amino acid và sự hoạt động của các enzyme cĩ liên quan đến sự đồng hĩa nitrogen, và trong hơ hấp protein. Khi trạng thái ổn định được thiết lập trong chemostat, mơi trường nuơi cấy cũng cĩ thành phần khơng đổi. Những thay đổi về tế bào học và sinh lý, cĩ thể phát sinh qua những thay đổi về mơi trường, hồn tồn chuyển hĩa ngược và tính chất tự nhiên của mỗi trạng thái ổn định được xác định qua mơi trường nuơi cấy cân bằng. (thay đổi ở mức độ từng enzyme và protein cấu trúc và tất cả các khía cạnh về trao đổi RNA). Turbidostat cĩ thể được sử dụng để khảo sát, trong nuơi cấy đạt tới tốc độ cao sản xuất sinh khối tương tự, chất điều hịa sinh trưởng kiểm sốt sự cân bằng giữa sự phân bào và sự nở lớn tế bào. Tạo và chọn dịng đột biến qua nuơi cấy tế bào: Đột biến chống chịu amino acid: Cĩ ý nghĩa trong dinh dưỡng: Tách dịng tế bào ngơ chống chịu mức kiềm hãm sinh trưởng của: Lysine + Threonine (LT) → hàm lượng Lysine, Threonine, Isoleusine và Methionine tăng 2-9 lần. Những cây ngơ tái sinh từ dịng tế bào LT đã duy trì được tính chống chịu LT và di truyền được là do một gen trội nằm trong nhân tế bào. Cây thuốc lá siêu sản xuất Lysine (10-15 lần) từ dịng tế bào Nicotiana sylvestris qua chọn dịng chống chịu Amino Ethylcysteine (AEC) → tính chống chịu AEC truyền qua hạt. Kháng amino acid và các đồng đẳng của amino acid: Một số amino acid trong đĩ cĩ valine và threonine ức chế sinh trưởng tế bào khi đưa chúng vào mơi trường dùng đường nuơi cấy, vì chúng ức chế tế bào sử dụng -3 NO hoặc ngăn cản amino acid cùng nguồn gốc. Ngồi ra, nếu bổ sung các chất đồng đẳng của amino acid vào mơi trường nuơi cấy chúng cĩ thể được sử dụng như amino acid vào việc tổng hợp ra các phần tử protein, kết quả các phân tử này bị mất hoạt tính. Hiện tượng ức chế này cĩ thể khắc phục bằng cách cung cấp cho tế bào thêm các amino acid khác hoặc các hợp chất dẫn xuất bình thường khác của chúng. Đối với tế bào, chúng cĩ thể tự khắc phục bằng cách tăng cường tổng hợp các amino acid thích ứng. Và đây là nguyên nhân vì sao các dịng tế bào kháng được các chất đồng đẳng của amino acid lại sản xuất dư thừa amino acid. Cơ chế của hiện tượng sản xuất dư thừa là quá trình ức chế ngược (feed-back inhibition) kém mẫn cảm hơn. Trong dịng tế bào kháng 5-methyl-tryptophan cơ chế ức chế sản phẩm ngược này kém mẫn cảm vì vậy hoạt tính của anthranilat synthetase vẫn cao và lượng Tryp được tạo ra cao gấp năm lần so với bình thường. Ở các dịng kháng p-fluorophenyl alanine cơ chế ức chế sản phẩm ngược hoạt động của enzyme chorismat mutase kém mẫn cảm với phenylalanine và tyrosine. Vì vậy lượng phenyl được tạo ra rất cao. Đột biến chống chịu bệnh: Dựa vào kỹ thuật chọn dịng đột biến in vitro. Chọn dịng mía chống chịu bệnh mắt én, bệnh này do Helminthosporium sacchari, một loại nấm sinh snr ra độc tố helminthosporoside, giống mía này được trồng ra đơng và chọn lựa tiếp tục. Tạo dịng mía Pinda 70-31 chống chịu bệnh Fiji do virut gây ra, nĩ cịn chống chịu bệnh phấn trắng, do nấm Sclerospora sacchari. Thu được những dịng tế bào và cây ngơ chống chịu độc tố Helminthosporium maydis. Đột biến chống chịu mặn: Chọn được dịng tế bào N. Tabacum cĩ thể sinh trưởng trên mơi trường chứa 0,16% NaCl, 0,52% NaCl. Thu được những cây thuốc lá tái sinh từ những dịng tế bào chống chịu NaCl chọn được in vitro, theo dõi qua 3 thế hệ vẫn giữ được những đặc tính đã chọn. Đột biến chống chịu nhiệt: Những tế bào của mía dịng H49-5, loại mía sinh trưởng tốt nhất trong điều kiện lạnh và mưa lớn đã khơng sinh trưởng tốt hơn trong nhiệt độ tăng. Cịn mía dịng NCO-310, cĩ phản ứng trung bình đối với nhiệt độ ngồi đồng ruộng, và khi tăng nhiệt độ cũng cho kết quả tương tự. Những tế bào của dịng H50-7209 sinh trưởng tốt ở điều kiện nĩng ẩm phản ứng một cách mạnh mẽ qua sự tăng nhịp điệu tăng trưởng khi nhiệt độ tăng. →kỹ thuật nuơi cấy tế bào in vitro cĩ thể được áp dụng trước hết để xác định phản ứng nhiệt của những giống mía khác nhau. Nuơi cấy tế bào đơn cây mía và chọn dịng tế bào chống chịu amino acid: Kĩ thuật nuơi cấy tế bào thực vật cĩ những ứng dụng rất lớn, trước hết là trong chọn dịng đột biến. Phần lớn nghiên cứu nuơi cấy tế bào đơn trong đĩ cĩ chọn dịng chống chịu các amino-acid được thực hiện trên cây hai lá mầm ( thuốc lá –cà rốt), các cây lương thực quan trọng nhất thuộc họ hịa thảo ( cây mía) cĩ đĩng gĩp nhất định cho cơng tác chọn dịng , giống mía dễ dàng hơn đối với cây lương thực. Mía là cây nhân giống vơ tính, các đột biến nếu cĩ thì dễ dàng duy trì, khơng bị ảnh hưởng phức tạp của quá trình trao đổi chéo khi nhân giống bằng hạt. Tạo mơ sẹo Cấy những mảnh lá non lên mơi trường dinh dưỡng bán rắn mơi trường cơ bản là MS cĩ bổ sung 10% nước dừa, 2% đường sucrose, 50mg/l arginnine, 2-6mg/l 2,4D. Sau khi cấy, mẫu được để trong tối, nhiệt độ 26 -280 C. Mơ sẹo hình thành tốt trên mơi trường cĩ 3mg/l 2,4D. Cĩ 2 loại mơ sẹo mơ xốp và mơ cứng. Mơ sẹo cứng được duy trì và nuơi cấy sau 25 lần cấy truyền (1,5-2 năm) vẫn cĩ khả năng tái sinh. Mơ xốp mất khả năng tái sinh sau 7-8 lần cấy truyền. Thời gian giữa 2 lần cấy truyền mơ sẹo là 20 ngày. Tái sinh cây từ mơ sẹo: Mơi trường như trên cĩ bổ sung thêm 2mg/l IBA, và 1-2mg/l BA, cường độ chiếu sáng 2500-3000lux, ở nhiệt độ 26-280C. Sau 20-30 ngày nuơi cấy, những cây mía tái sinh từ mơ sẹo xuất hiện. Đối với mơ sẹo xốp, trên mơi trường tái sinh cây cùng với những tổ hợp và nồng độ chất kích thích sinh trưởng như trong thí nghiệm với mơ sẹo cứng cho thấy khơng cĩ sự phát sinh phơi và phân hĩa cơ quan. Chính vì vậy mà mơ sẹo cứng được dùng làm nguyên liệu tách và nuơi cấy tế bào đơn. Kĩ thuật tách và nuơi cấy tế bào đơn trong mơi trường lỏng: Cấy mơ sẹo cứng vào bình tam giác cĩ chứa mơi trường lỏng(MS), bổ sung 5% nước dừa, 2mg/l 2,4D ,500mg/l yeast extract(YE) và 2% đường sucrose. Bình tam giác được đặt trên máy lắc với tốc độ 90-100 vịng/phút. Theo dõi sinh trưởng của huyền phù tế bào: cứ hai ngày lấy mẫu một lần và xác định sự tăng số lượng tế bào trên 1ml mơi trường qua đếm số tế bào bằng buồng đếm hồng cầu. Sau 1-2 tuần lắc mơ sẹo trong mơi trường lỏng, lọc và gạn thu được huyền phù: phần lớn là tế bào đơn và cụm tế bào nhỏ. Trong huyền phù cĩ hai loại tế bào chính : tế bào sinh phơi, tế bào khơng phát sinh phơi. Muốn thu được huyền phù gồm phần lớn tế bào phát sinh phơi cần tiếp tục gạn huyền phù trong các lần cấy truyền tiếp theo. Số lượng tế bào cực đại ở ngày thứ 8 của chu kì nuơi cấy. Muốn duy trì huyền phù tế bào ở trạng thái tốt, cứ 3-5 ngày cấy truyền một lần theo tỉ lệ 5ml dịch huyền phù nuơi cấy trong 40-45 ml mơi trường mới cĩ mật độ tế bào ban đầu 5x104 -105 tế bào/ml. Kĩ thuật gieo tế bào đơn trên đĩa petri và tái sinh cây từ tế bào đơn Huyền phù tế bào 3-5 ngày tuổi, được gieo trên mặt mơi trường thạch trong đĩa petri cĩ đường kính 5cm. Mật độ gieo 1-5x105tế bào/ml. Mơi trường nuơi cấy cĩ 5% nước dừa, 50mg/l arginne, 500mg/l YE, 0,25 -2mg/l 2,4D, 2-6% đường sucrose, và 1g/l IBA và BA cĩ nồng độ 0,2 và 2mg/l, than hoạt tính 1g/l cường độ chiếu sáng 2500-3000lux, nhiệt độ 26-280C. Quá trình phân chia của tế bào và sự hình thành mơ sẹo từ tế bào trên cho kết quả tốt nhất thể hiện ở tỉ lệ mơ sẹo hình thành từ tế bào và loại mơ phát sinh phơi. Mơ sẹo hình thành được cấy tái sinh trên mơi trường như trên. Ảnh hưởng của Lysine, Threonine, Methionine và Homoserine đến sinh trưởng của mơ sẹo, cây non, cụm chồi , tế bào đơn mía. Đánh giá ảnh hưởng của các amino –acid đến sinh trưởng của mơ sẹo qua chỉ tiêu trọng lượng tươi. Chỉ tiêu đánh giá kiềm hãm sinh trưởng : chiều cao cây, số lá tươi, chiều dài rễ và số rễ. Cấy những chồi mía vào bình tam giác chứa mơi trường thạch cĩ tổ hợp Lys+Thr ở nồng độ 0,5 -2mM. Chỉ tiêu theo dõi là độ sống sĩt. Chỉ tiêu đánh giá là tỉ lệ mơ sẹo hình thành trên mật độ gieo. Chọn dịng tế bào chống chịu ngược Lys+Thr(2mM+2mM) và khảo sát hàm lượng amino-acid của dịng chống chịu. Để đánh giá khả năng duy trì tính chống chịu của dịng mơ sẹo chọn được, các truyền dịng mơ sẹo sống sĩt LT2 sang mơi trường khơng cĩ Lys+Thr(LTO) sau đĩ cấy ngược lại trên mơi trường cĩ Lys+Thr. Khả năng chống chịu thể hiện qua sự sinh trưởng của mơ sẹo. Sau 21 ngày nuơi cấy trên bề mặt mơi trường thạch cĩ Lys+Thr(2mM+2mM) xuất hiện một số dịng mơ sẹo kích thước 1-2mm. Chúng được gắp ra và tiếp tục cấy truyền trên mơi trường mới. Qua nhiều thí nghiệm liên tục thu được 30 dịng mơ sẹo cĩ khả năng sinh trưởng bình thường trên mơi trường trên, nghĩa là chúng chống chịu được sự kiềm hãm ngược Lys+Thr. Tầng số xuất hiện dịng mơ sẹo chống chịu là 4x10-6. Khả năng này được duy trì ở lần cấy truyền thứ 3 sau khi cấy lại trên mơi trường cĩ Lys+Thr vẫn sinh trưởng bình thường so với chứng. Khảo sát hàm lượng amino-acid của mơ sẹo dịng đối chứng và dịng chống chịu LT tăng từ 4,1-4,6 lần so với dịng đối chứng. Thu nhận được dịng tế bào ngơ chống chịu tác động kìm hãm Lys+Thr và cho thấy hàm lượng Lys tự do của mơ sẹo dịng chống chịu tăng 2-9 lần so với đối chứng. C- Nuơi cấy tế bào để sản xuất hợp chất thứ cấp Cây xanh bao phủ hành tinh như một nhà máy lọc sạch bầu khí quyển. Cây xanh cịn là ”nhà máy” sản xuất ra rất nhiều chất hữu cơ cĩ giá trị dùng làm thực phẩm hoặc dược phẩm (khoảng 25% các loại dược phẩm cĩ nguồn gốc thực vật). Tuy nhiên, sử dụng các dược liệu này vẫn rất hhạn chế do chỉ cĩ thể chiết xuất trực tiếp một lượng rất ít từ thực vật nên cần cĩ giải pháp để sản xuất, tăng hàm lượng và ổn định nguồn cung cấp. Giải pháp đĩ chính là ứng dụng cơng nghệ sinh học, mà cụ thể là cơng nghệ nuơi cấy tế bào thực vật. Những nghiên cứu về hợp chất thứ cấp thực vật phát triển từ những năm 1950. Cĩ khoảng hơn 30.000 hợp chất được chiết xuất từ thực vật cĩ hoạt tính và rất cĩ giá trị đối với cuộc sống.. Các hợp chất thứ cấp thường chỉ được tạo ra ở một số loại tế bào nhất định như các tế bào rễ tơ, biểu mơ, hoa, lá… Các hợp chất thứ cấp thực vật Các chất thứ cấp ở thực vật là những hợp chất trong cơ thể thực vật nhưng không có vai trò đối với các quá trình sống cơ bản, những hợp chất này giữ vai trò thứ cấp trong cây. Thực ra về mặt tiến hoá, các chất thứ cấp đóng vai trò hết sức quan trọng trong quá trình đấu tranh sinh tồn vì đây là những chất độc đối với động vật và vi sinh vật, các chất có tác dụng quyến rũ côn trùng hoặc có mầu sắc và hương vị đặc biệt. Sự phát triển của kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào trong những năm gần đây đã mở ra triển vọng sử dụng kỹ thuật này để nuôi sinh khối lớn có khả năng tổng hợp các chất thứ cấp. Thực vật là nguồn cung cấp các hợp chất dùng làm hĩa học ,dược liệu hoặc phụ gia thực phẩm cĩ giá trị. Những sản phẩm này được biết như là các chất trao đổi thứ cấp, thường được hình thành với một lượng rất nhỏ trong cây và chức năng trao đổi chất chưa được biết đầy đủ. Chúng dường như là sản phẩm của các phản ứng hĩa học của thực vật với mơi trường hoặc là sự bảo vệ hĩa học chống lại vi sinh vật và động vật. Một trong những hợp chất thứ cấp rất cĩ giá trị trong điều trị ung thư là taxol. Nhu cầu taxol trên thế giới rất cao nhưng hàm lượng chiết xuất từ các loại thơng tự nhiên rất ít do lớp vỏ mỏng của cây thơng đỏ chứa khoảng 0,001% taxol. Các hợp chất thứ cấp cĩ giá trị như vậy cĩ thể được sản xuất bằng cơng nghệ nuơi cấy tế bào. Đây là một kỹ thuật quan trọng trong cơng nghệ sinh học mà ưu điểm lớn nhất là cĩ thể chủ động tăng nguồn cung cấp các nguồn dược liệu  bằng cách tách chiết một tỷ lệ lớn lượng hoạt chất từ tế bào thực vật nuơi cấy. Những chất thứ cấp như: alkaloid, antibiotic, tinh dầu, resin,taxol, tannin, các glycoside, sterol, polysaccharide, hormone thực vật và saponin. Các chất trao đổi thứ cấp cĩ thể xếp trong ba nhĩm chính là alkaloid, tinh dầu và glycoside. Các alkaloid cĩ dạng tinh thể là các hợp chất chứa nitrogen, cĩ hoạt tính sinh lý trên tất cả động vật và được sử dụng trong cơng nghiệp dược. Họ alkaloid bao gồm: codein, nicotine, caffeine và morphine. Một số lồi thực vật chứa nhiều alkaloid như: cây thuốc phiện;cây canh-ki-na. Người ta thường gặp trong một cây tập hợp các alkaloid cĩ cấu trúc hĩa học gần giống nhau. Đơi khi tồn cây chứa alkaloid,đơi khi chỉ tập trung trong lá(thuốc lá,chè,ca cao),trong quả(thuốc phiện),trong vỏ(canh ki na),trong rể(cây cà độc dược) Trong cùng 1 cây tùy theo các bộ phận mà tạo ra các alkaloid khác nhau(họ Taxaceae). Các alkaloid cĩ hoạt tính sinh học rất khác biệt,cĩ loại tác dung lên hệ thần kinh,cĩ loại lên hệ cơ,1 số tác dụng lên mạch máu (hydrastin, ephedrin...), một số khác tác dụng lên bộ máy hơ hấp.1 số cĩ tác dụng làm thuốc chữa bệnh (Misawa, 1994). Các tinh dầu chứa hỗn hợp terpenoid, được sử dụng như chất mùi, chất thơm và dung mơi. Giống như những lipit khác,các terpenoid khơng tan trong nước.Terpene được xây dựng từ những đơn vị 5 cacbon và được thiết lập từ nhiều đơn vị isoprene. Ví dụ monoterpene chứa 2 đơn vị isoprene, sesquiterpene chứa 3 đơn vị isoprene, diterpene chứa 4 đơn vị isoprene (Lee 2001). Các glycoside bao gồm các hợp chất phenol và flavonoid, saponin và các cyanogenic glycoside, một số trong chúng được sử dụng làm thuốc nhuộm, chất mùi thực phẩm và dược phẩm (Lee 2001). Nuơi cấy tế bào thực vật Cho đến nay sự ứng dụng trong thực tiễn vẫn cịn hạn chế do: -Tốc độ sinh trưởng chậm. -Hàm lượng chất sản xuất ra thường thấp hơn chính thực vật đĩ sản xuất . -Các chất thứ cấp được sản xuất ra khơng ở một thời điểm nhất định trong chu trình sinh trưởng và tế bào cĩ thể bị biệt hĩa hay khơng biệt hĩa. Để giải quyết vấn đề này, hiện nay các nhà khoa học đang đi theo hướng gây đột biến và chọn những dịng đột biến cĩ năng suất cao và sinh trưởng nhanh trên những mơi trường đơn giản hoặc phương pháp tái sinh mơ sẹo và dich huyền phù. Ưu thế về mặt nguyên lý của kỹ thuật nuơi cấy tế bào thực vật là cĩ thể cung cấp liên tục nguồn nguyên liệu để tách chiết một tỷ lệ lớn lượng hoạt chất từ tế bào thực vật nuơi cấy. 2.1-Phương pháp tái sinh mơ sẹo và dịch huyền phù: Nuơi cấy tế bào huyền phù thường khởi đầu bằng cách đặt các khối callus dễ vỡ vụn trong mơi trường lỏng chuyển động (lắc hoặc khuấy). Trong quá trình nuơi cấy, các tế bào sẽ dần dần tách ra khỏi mẫu do những chuyển động xốy của mơi trường. Sau một thời gian ngắn trong dịch huyền phù sẽ cĩ các tế bào đơn, các cụm tế bào với kích thước khác nhau, các mẫu nuơi cấy cịn thừa chưa phát triển và các tế bào chết. Tuy nhiên, cũng cĩ những dịch huyền phù hồn hảo, chứa tỷ lệ cao các tế bào đơn và tỷ lệ nhỏ các cụm tế bào. Mức độ tách rời của tế bào trong nuơi cấy phụ thuộc vào đặc tính của các khối tế bào xốp và cĩ thể điều chỉnh bằng cách thay đổi thành phần mơi trường (Misawa, 1994). Bên cạnh nuơi cấy tế bào huyền phù, nuơi cấy callus (trên mơi trường rắn) cĩ ưu điểm là thao tác thí nghiệm đơn giản, dễ vận chuyển mẫu nhưng nhược điểm là thể tích nuơi cấy bé nên khĩ phát triển ở quy mơ cơng nghiệp, mẫu nuơi cấy chỉ tiếp xúc được một mặt với nguồn dinh dưỡng, những sản phẩm do mẫu nuơi cấy tạo ra trong quá trình trao đổi chất sẽ tích tụ xung quanh dẫn đến làm chậm sự sinh trưởng của tế bào. Vì thế, nuơi cấy tế bào huyền phù thích hợp hơn cho việc sản xuất sinh khối tế bào thực vật vì cĩ thể duy trì và thao tác tương tự với các hệ thống lên men vi sinh vật ngập chìm trong mơi trường lỏng. Bước đầu tiên trong nghiên cứu tái sinh là tạo mơ sẹo hay tế bào dịch huyền phù . Mơ nuơi cấy cho thấy tiêu biểu của sự phân chia tế bào, những chức năng đặt biệt của tế bào, và sự hình thành cơ quan như cấu trúc hệ thống mạch dẫn. Sự hình thành mơ sẹo từ mơ nuơi cấy cho thấy sự phân chia tế bào , những tế bào ít cĩ tính chuyên biệt và mất khả năng hình thành cấu trúc cơ quan. Khi cấy truyền mơ sẹo trên mơi trường agar tế bào mơ sẹo phát triển theo hình chữ S. Cĩ 5 phase trong sự phát triển mơ sẹo: -Lag phase: tế bào chuẩn bị phân chia -Exponential phase : tốc độ phân chia tế bào cao nhất -Linear phase: tế bào phân chia chậm lại và phát triển kích thước -Deceleration phase: tốc độ phân chia và kéo dài tế bào giảm -Stationary phase: số lượng và kích thước tế bào ổn định Sự phát triển của mơ sẹo cĩ thể đo được trọng lượng tươi. Tế bào dịch huyền phù là do khi chúng ta lắc khối tế bào mơ sẹo trên máy lắc ( cung cấp sự trao đổi khí ở tế bào).Khi những tế bào mới hình thành chúng trơi nổi trong dịch huyền phù, kết cụm và liên kết nhau lại. Tế bào dịch huyền phù cĩ tốc độ phân chia cao hơn tế bào mơ sẹo. Dịch huyền phù cĩ thuận lợi khi tốc độ phân bào nhanh hay nhiều thế hệ tế bào hịa trộn với nhau, hay khi một ứng dụng xử lí đồng nhất cho thấy cần thiết trong suốt quá trình chọn lọc tế bào. Sự sinh trưởng dịch huyền phù tế bào cĩ thể theo dõi qua đo đếm số lượng tế bào trên mơt đơn vị thể tích, cĩ liên quan đến trọng lượng tươi. Mật độ đậm đặc của tế bào cĩ thể đo đếm bằng buồng đếm hồng cầu. Trọng lượng khơ cho phép đánh giá chính xác sự tăng lên tế bào. Dịch huyền phù cĩ thể duy trì qua cấy truyền trong bình tam giác gọi là nuơi cấy dịch batch tế bào. Sau khi đã cĩ dịch huyền phù tế bào mẹ dịch huyền phù bắt đầu phát triển nhưng thời gian ngắn hơn mơ sẹo. Dịch huyền phù tế bào cĩ thể sinh trưởng trong hệ thống nuơi cấy liên tục. Một hệ thống nuơi cấy liên tục mở cĩ thể thay thế dần mơi trường dinh dưỡng đang sử dụng và tế bào với mơi trường dinh dưỡng sẽ được thay thế cùng với tốc độ những tế bào mới hình thành, cho thấy rõ trạng thái trao đổi chất. Một hệ thống nuơi cấy liên tục kín sẽ thay thế mơi trường dinh dưỡng đang sử dụng bằng mơi trường mới mà khơng mất tế bào, cho thấy cĩ sự tích lũy sinh khối. Tế bào trong dịch huyền phù cĩ thể thu hoạch hay chuyển sang mơi trường agar và sinh trưởng như mơ sẹo. 2.2-Phương pháp chọn lọc dịng đột biến: a)Kỹ thuật dịng hĩa tế bào đơn: Nguyên tắc: dựa trên kỹ thuật trải tế bào trên đĩa petri cĩ agar. Mục đích: phân bố tế bào hay tế bào liên kết hay protolast trên lớp mỏng agar mơi trường dinh dưỡng với mật độ tế bào thấp được gọi là hiệu suất trải tế bào. Cĩ 2 kĩ thuật thường được sử dụng để trải tế bào: Nuơi cấy khối mơ sẹo dinh dưỡng bên trên lớp tế bào được trải để lớp tế bào này nhận những chất thúc đẩy sinh trưởng tiết ra từ mơ sẹo. Nuơi cấy tế bào trên mơi trường điều kiện. b)Phát sinh đột biến : Chất gây đột biến được dùng với nồng độ thích hợp và xử lí với thời gian ngắn gây chết tế bào với tỉ lệ cao. Những nghiên cứu cơ bản về độc tố của những chất gây đột biến chọn lọc trên những dịng tế bào đơn bội và nhị bội tạo ra những dịng tế bào đột biến. Mục tiêu nghiên cứu là thu nhận với tỉ lệ cao những dịng tế bào đột biến. c) chọn dịng tế bào đột biến : Những dịng tế bào đột biến cĩ những tính chất sau : Ổn định khi nuơi cấy khơng cĩ chất gây đột biến Xuất hiện tức thời. Xuất hiện với tần số thấp. Năng suất các chất thứ cấp hoạt tính sinh học cao. Những sự thay đổi này khơng mất đi trong quá trình tái sinh và di truyền khi lai hữu tính và cĩ thể được phân tích di truyền. Những dịng tế bào cho thấy : Những yêu cầu về sinh trưởng thấp hơn so với nuơi cấy tế bào cây bố mẹ. Nâng cao tính kháng với dược chất và kháng lại quá trình trao đổi chất. Giảm quá trình sinh tổng hợp. 3. Sự tích lũy các hợp chất thứ cấp trong tế bào thực vật Sự tiến bộ vượt bậc của cơng nghệ sinh học trong nuơi cấy mơ và tế bào thực vật giúp nhân giống các cây trồng cĩ giá trị và tách chiết các hĩa chất quý hiếm mang lại nhiều ý nghĩa về mặt thương mại. Phương pháp này sẽ mở rộng và tăng khả năng thu hồi các hĩa chất giá trị cĩ nguồn gốc thực vật, một sự thay thế từ quy mơ nơng nghiệp truyền thống lên quy mơ cơng nghiệp trong sản xuất các hợp chất thứ cấp (Dicosmo và Misawa 1995). Kỹ thuật nuơi cấy tế bào được khởi xướng từ cuối những năm 60 của thế kỷ 20 như là một cơng cụ hữu ích để nghiên cứu và sản xuất hợp chất thứ cấp thực vật. Kỹ thuật này được phát triển với mục tiêu cải thiện hiệu suất các sản phẩm cĩ hoạt tính sinh học. Ưu điểm của chúng là cĩ thể cung cấp sản phẩm một cách liên tục và đáng tin cậy dựa trên những lý do sau: (1) tổng hợp các hợp chất thứ cấp cĩ giá trị diễn ra dưới sự điều khiển các yếu tố mơi trường nuơi cấy, độc lập với khí hậu và điều kiện đất trồng. (2) phủ định ảnh hưởng sinh học đến các sản phẩm là hợp chất thứ cấp trong tự nhiên (vi sinh vật và cơn trùng). (3) cĩ thể chọn lọc các giống cây trồng cho nhiều loại hợp chất thứ cấp khác nhau (4) với việc tự động hĩa điều khiển sự sinh trưởng của tế bào và điều hịa quá trình chuyển hĩa chi phí cĩ thể giảm và lượng sản phẩm tăng lên. Bên cạnh đĩ, những kết quả nghiên cứu gần đây cho thấy nuơi cấy tế bào huyền phù của thực vật cũng được sử dụng để sản xuất các sản phẩm protein tái tổ hợp (Fisher và cs 1999). Trong nuơi cấy tế bào, việc chọn lựa cẩn thận các tế bào cĩ khả năng phát triển và điều kiện nuơi cấy tối ưu sẽ giúp tăng khả năng tích lũy một vài sản phẩm ở mức cao hơn. Để thu được hiệu suất cao cho khai thác thương mại, người ta đã sử dụng nhiều phương pháp khác nhau trong nỗ lực tập trung vào việc kích thích hoạt động sinh tổng hợp của các tế bào nuơi cấy (Rao 2000, Dixon 1999). Sự tích lũy các hợp chất thứ cấp trong tế bào thực vật phụ thuộc vào: Tối ưu hĩa điều kiện nuơi cấy. Các thơng số hĩa học và vật lý như thành phần và pH mơi trường, chất điều hịa sinh trưởng, nhiệt độ nuơi cấy, sự thơng khí, sự lắc hoặc khuấy, và ánh sáng ảnh hưởng đến hàm lượng các hợp chất thứ cấp đã được nghiên cứu nhiều Các thơng số vật lý và yếu tố dinh dưỡng trong một mẻ cĩ thể gần như là yếu tố cơ bản cho việc tối ưu hĩa hiệu suất nuơi cấy. Chọn lọc các dịng tế bào cho năng suất cao. Các tế bào thực vật trong nuơi cấy là một tập hợp các đặc điểm sinh lý độc lập. Chọn lọc tế bào dựa vào khả năng tổng hợp một vài hợp chất cĩ giá trị cao trong nuơi cấy đã được ứng dụng rộng rãi. Cung cấp tiền chất (precursor feeding). Bổ sung các tiền chất của quá trình sinh tổng hợp nội bào vào mơi trường nuơi cấy cũng cĩ thể tăng lượng sản phẩm mong muốn do một số hợp chất trung gian nhanh chĩng bắt đầu sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp và vì thế làm tăng lượng sản phẩm cuối cùng. Phương pháp này hữu ích khi dùng các tiền chất cĩ giá thành rẻ. Sự kích kháng bảo vệ thực vật (elicitation). Thực vật sản xuất các hợp chất thứ cấp trong tự nhiên như một bộ máy bảo vệ chống lại các yếu tố gây bệnh. Chất kích kháng bảo vệ thực vật (elicitor) báo hiệu việc hình thành các hợp chất thứ cấp. Sử dụng các elicitor của bộ máy bảo vệ cây, tức sự kích kháng bảo vệ thực vật, là phương thức để thu được các sản phẩm hợp chất thứ cấp cĩ hoạt tính sinh học một cách hiệu quả nhất. Sử dụng các elicitor sinh học và phi sinh học (được phân loại dựa trên nguồn gốc của chúng) để kích thích hình thành các hợp chất thứ cấp trong quá trình nuơi cấy tế bào, cĩ thể giúp rút ngắn thời gian và đạt hiệu suất cao (DiCosmo và Tallevi, 1985). Những nhân tố ảnh hưởng đến quá trình thu nhận các chất thứ cấp cĩ hoạt tính sinh học: Một trong những nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến việc sản xuất các hợp chất thứ cấp từ tế bào thực vật là sự phân hĩa hình thái. Nhiều hợp chất thứ cấp được sản xuất trong suốt quá trình phân hĩa tế bào, vì thế chúng được tìm thấy trong các mơ cĩ khả năng phân hĩa cao như rễ, lá và hoa. Do sự phân hĩa hình thái và sự trưởng thành khơng xuất hiện trong nuơi cấy tế bào nên các chất thứ cấp cĩ khuynh hướng ngưng tạo thành trong quá trình nuơi cấy. Tuy nhiên, các tế bào khơng phân hĩa trong nuơi cấy huyền phù thường tạo thành một khối vài trăm tế bào, các tế bào ở giữa khối cĩ sự tiếp xúc với mơi trường khác với các tế bào ở bên ngồi nên sự phân hĩa sẽ xuất hiện tới một mức độ nào đĩ trong khối để tạo thành các chất thứ cấp (Lee 2001). Ngồi ra cĩ: Sản phẩm thứ cấp trong nuơi cấy tế bào: Khả năng tổng hợp các chất thứ cấp được duy trì qua nuơi cấy tế bào: Cĩ sự khác nhau về chất lượng dịng tế bào trong cùng dịch huyền phù qua nuơi cấy tế bào Điều kiện nuơi cấy tế bào ảnh hưởng đến việc sản xuất các chất thứ cấp Giả thiết về sản xuất các chất thứ cấp qua nuơi cấy tế bào Những thành tựu trong nuơi cấy tế bào thực vật sản xuất các hoạt chất sinh học Những năm gần đây, thuốc truyền thống trở thành một đề tài quan trọng mang tính tồn cầu. Mặc dù ở các nước phát triển người ta thường sử dụng tân dược trong điều trị nhưng các loại thuốc cĩ nguồn gốc thảo mộc vẫn được dùng phổ biến do yếu tố lịch sử và văn hĩa. Theo các đánh giá về mặt khoa học, nhiều lồi thảo mộc cĩ thể ứng dụng trong y học. Vấn đề đặt ra là vùng sinh trưởng của cây thuốc đang biến mất nhanh chĩng do sự khơng ổn định của điều kiện mơi trường và các yếu tố khác. Như vậy, thật khĩ cĩ một nguồn nguyên liệu đủ lớn để tách chiết các hợp chất thứ cấp dùng trong dược phẩm. Ngay từ năm 1971, Wani và các cộng sự đã tìm ra một diterpene amide mới cĩ khả năng chống ung thư gọi là “taxol” chiết từ cây thơng đỏ Pacific (Taxus brevifolia). Đến năm 1983, taxol được Cục quản lý Dược phẩm và Thực phẩm Hoa Kỳ (FDA) đồng ý đưa vào thử nghiệm ở giai đoạn I điều trị cho ung thư buồng trứng. Sau đĩ, FDA đã cho phép sử dụng taxol trong điều trị các trường hợp ung thư buồng trứng và ung thư vú. Ngồi ra, taxol cũng cĩ tác dụng đối với các bệnh nhân cĩ khối u ác tính, ung thư phổi và các dạng u bướu khác (Wickremesinhe và Arteca 1993 và 1994), và nĩ được xem như là chất đầu tiên của một nhĩm mới trong hĩa trị liệu ung thư (Cragg và cs 1993). Tuy nhiên, sử dụng taxol trong điều trị bị hạn chế do chỉ tách chiết được một lượng rất ít từ vỏ của cây thơng đỏ tự nhiên. Lớp vỏ mỏng này chứa khoảng 0,001% taxol tính theo khối lượng khơ. Ở cây 100 năm tuổi trung bình chỉ thu được 3 kg vỏ (khoảng 300 mg taxol), lượng này ứng với một liều trong tồn đợt điều trị ung thư. Sở dĩ nguồn taxol khan hiếm như vậy là do các cây tự nhiên sinh trưởng rất chậm (Cragg và cs 1993). Do đĩ, cần cĩ những nguồn khác để thay thế mới đáp ứng được nhu cầu sử dụng ngày càng tăng trong y học. Nuơi cấy tế bào các lồi Taxus được xem như là một phương pháp ưu thế để cung cấp ổn định nguồn taxol và dẫn xuất taxane của nĩ (Slichenmyer và Von Hoff 1991). Hiện nay, việc sản xuất taxol bằng nuơi cấy tế bào các lồi Taxus đã trở thành một trong những ứng dụng rộng rãi của nuơi cấy tế bào thực vật và đang tạo ra các giá trị thương mại to lớn. Fett- Neto và cs (1994) đã nghiên cứu ảnh hưởng của các chất dinh dưỡng và một số yếu tố khác lên sự tích lũy taxol trong nuơi cấy tế bào T. cuspidata. Srinivasan và cs (1995) nghiên cứu quá trình sản xuất taxol bằng nuơi cấy tế bào của T. baccata. Lee và cs (1995) đã nghiên cứu sản xuất taxol bằng nuơi cấy tế bào huyền phù của cây T. mairei, một lồi được tìm thấy tại Đài Loan ở độ cao 2000 m so với mực nước biển. Các dịng tế bào thu được từ callus cĩ nguồn gốc thân và lá, và một trong những dịng này sau khi được bổ sung các tiền chất vào mơi trường nuơi cấy, thì sau 6 tuần cứ một lít dịch huyền phù tế bào sẽ cĩ khoảng 200 mg taxol. Tsay và cs (1994) đã nghiên cứu sản xuất imperatorin từ nuơi cấy tế bào huyền phù của cây Angelica dahurica var. Formosana. Đây là một lồi cây bản địa lâu năm ở Đài Loan, được sử dụng để chữa chứng đau đầu và bệnh vảy nến. Imperatorin được xem là thành phần hoạt động chính trong điều trị các bệnh về da. Nếu sản xuất cây Angelica dahurica var. formosana bằng phương pháp nhân giống truyền thống sẽ mất một thời gian dài mới cĩ thể đáp ứng được nhu cầu. Vì vậy, phương pháp nuơi cấy tế bào huyền phù sản xuất imperatorin đã được chọn lựa sử dụng. Nghiên cứu đã cho thấy trong chu kỳ sinh trưởng của tế bào huyền phù, sản phẩm imperatorin đạt giá trị cực đại trong khoảng giữa 10 và 14 ngày. Benzylamino purine ở nồng độ từ 0,5-1,0 mg/L đã kích thích tổng hợp imperatorin, một tỷ lệ thích hợp ammonium nitrate và nitrate (2:1) cũng như tăng nồng độ phosphate từ 1-2 mM sẽ làm tăng lượng impertatorin. Glucose là nguồn carbon tốt hơn saccharose và fructose về hiệu quả sản xuất imperatorin. Vai trị của elicitor cũng đã được khảo sát, bổ sung thêm vanadyl sulphate trong mơi trường sẽ tăng tích lũy imperatorin, quyết định nồng độ và thời gian sinh trưởng của tế bào. Bổ sung vanadyl sulphate ở nồng độ 30 mg/L vào mơi trường đã cho hiệu quả tốt nhất sau 10 ngày nuơi cấy. Hoặc bổ sung 20 g/L chất hấp phụ amberlite XAD-7 vào mơi trường, quá trình tổng hợp imperatorin cũng tăng mạnh ở ngày nuơi cấy thứ 10. Hàm lượng imperatorin sản xuất bởi phương thức này đạt 460 µg khối lượng tươi cao hơn đối chứng 140 lần. Berberine là một isoquinoline alkaloid cĩ trong hệ rễ của cây Coptis japonica và vỏ của cây Phellondendron amurense. Berberine chloride được sử dụng để chữa bệnh rối loạn tiêu hĩa. Để thu được nguyên liệu thơ từ rễ cây Coptis phải mất 5-6 năm. Sau đĩ, cơng ty hĩa dầu Mitsui (Nhật Bản) đã cải thiện được năng suất bằng cách thêm 10-8 M gibberellic acid vào mơi trường, hiệu suất rất nhiều tới 1,66 g/L (Misawa 1994). Rễ của cây Panax ginseng, một loại thảo dược lâu năm cịn gọi là nhân sâm được sử dụng rộng rãi như một vị thuốc bổ, một dược phẩm quý giá, cĩ tác dụng chữa bệnh rối loạn tiêu hĩa, bệnh đái đường, suy nhược cơ thể . Trong đĩ, ginsenoside-Rb cĩ hoạt tính an thần, cịn Rg cĩ hoạt tính kích thích. Từ 1973, Furuya và cs đã nuơi cấy mơ callus P. ginseng để phân lập saponins và sapogenins. Năm 1994, Choi bắt đầu nghiên cứu nuơi cấy P. ginseng trên quy mơ cơng nghiệp. Đến nay, đây là một trong các đối tượng được các nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu nhiều nhất. Merkli và cs (1997) đã nuơi cấy rễ tơ của cây Trigonella foenum-graecum bằng cách gây nhiễm chủng A4 của Agrobacterium rhizogenes. Các rễ tơ này đã sản xuất diosgenin, một spirostanol quan trọng cho sự bán tổng hợp (semi-synthesis) của các hormone steroid. Hàm lượng diosgenin thu được cao nhất là 0,040 % khối lượng khơ gần gấp 2 lần so với các rễ khơng biến nạp chủng A4 8 tháng tuổi (0,024 %). Các tác giả này đã nghiên cứu ảnh hưởng của cholesterol, pH mơi trường và chitosan đến khả năng sản xuất diosgenin. Kết quả cho thấy bổ sung 40 mg/L chitosan vào mơi trường nuơi cấy sẽ tăng hàm lượng diosgenin lên gấp 3 lần so với đối chứng. Yeh và cs (1994) nghiên cứu sản xuất diosgenin bằng nuơi cấy tế bào huyền phù của cây Dioscorea doryophora. Phương pháp này được sử dụng như một cách thay thế quá trình tổng hợp steroid. Nuơi cấy tế bào huyền phù được thiết lập bằng cách đưa callus vào mơi trường cĩ 0,2 mg/L 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D). Nồng độ saccharose tối thích cho tổng hợp diosgenin là 3%. Lượng diosgenin thu được trong trường hợp này đạt tới 3,2% khối lượng khơ. Sản xuất diosgenin từ cây D. doryophora bằng nuơi cấy tế bào huyền phù hiện nay đã được ứng dụng trên quy mơ cơng nghiệp. Gentiana davidii var. formosana là thảo mộc bản địa sống lâu năm ở Đài Loan. Từ xưa nĩ đã được sử dụng như một loại thuốc thơ sơ trong y học cổ truyền Trung Quốc nhằm ngăn chặn béo phì và lão hĩa, bảo vệ phổi khỏi các chất độc (Zheng và cs 1997). Secoiridoid glycoside là hợp chất chính với đặc tính y học ở trong rễ của chi Gentiana (Skrzypczak và cs 1993). Chueh và cs (2000) nghiên cứu tối ưu hĩa điều kiện nuơi cấy tế bào huyền phù của G. davidii var. formosa để sản xuất gentipicroside và swertiamarin, hai dược chất quan trọng. Tế bào huyền phù sinh trưởng tối ưu khi nuơi cấy callus trong mơi trường bổ sung 1,2 mg/L kinetin và 3% saccharose, pH 4,2-5,2, tốc độ lắc 80-100 vịng/phút. Sự tích lũy cao nhất 2 hợp chất swertiamarin và gentipicroside trong tế bào được xác định lần lượt sau 12 và 24 ngày nuơi cấy. Miyasaka và cs (1989) đã nghiên cứu sản xuất cryptotanshinone từ nuơi cấy callus cây Salvia miltiorrhiza. Salvia là một chi quan trọng của họ Lamiaceae và một vài lồi của Salvia mọc hoang dại trên khắp thế giới dùng làm thuốc dân gian. Hiệu quả của BA đối với việc hình thành cryptotanshinone trong nuơi cấy callus S.miltiorrhiza đã được khảo sát. Callus sơ cấp được tạo ra từ nuơi cấy mảnh lá ở trong tối trên mơi trường bổ sung 1,0 mg/L 2,4-D. Callus sau đĩ phát triển nhanh hơn trên mơi trường cĩ 1,0 mg/L 2,4-D và 0,5 mg/L BA. Kết quả phân tích HPLC cho thấy callus chứa một lượng nhỏ cryptotanshinone (0,26 mg/g khối lượng khơ). Loại bỏ 2,4-D khỏi mơi trường nuơi cấy cho kết quả là lượng cryptotanshinone trong callus tăng lên. Nồng độ cao nhất của cryptotanshione thu được trong callus nuơi cấy trên mơi trường cĩ 0,2 mg/L BA trong 6 ngày là 4,59 mg/g khối lượng khơ (Wu và cs 2003). Shikonin, một loại sắc tố đỏ cĩ khả năng diệt khuẩn, cĩ trong rễ cây Lithospermum erythrorhizon.người ta đã tạo được dịng tế bào rễ cây Lithospermum cĩ khả năng tích lũy đến 15% shikonin và đã hồn chỉnh cơng nghệ nuơi cấy tế bào sản xuất shikonin. Cơng nghệ này cho phép trong một chu kỳ nuơi cấy thu hoạch tới 5 kg hoạt chất và giúp giảm nhiều giá thành của shikonin. Podophyllotoxin là một aryltetralin lignan chống khối u được tìm thấy ở các cây Podophyllum peltatum và Podophyllum hexandrum. Nĩ cũng được dùng để tổng hợp các dẫn xuất etoposide và teniposide, sử dụng rộng rãi trong điều trị chống khối u (Issell và cs 1984). Tuy nhiên, trong tự nhiên những cây này sinh trưởng rất chậm và vì thế đã hạn chế việc cung cấp podophyllotoxin, bắt buộc chúng ta phải hướng tới một phương thức thay thế khác. Nuơi cấy tế bào để sản xuất podophyllotoxin đã được Kadkade và cs thực hiện lần đầu tiên vào năm 1981 và 1982. Woerdenberg và cs (1990) đã dùng một phức hợp precursor là coniferyl alcohol và b-cyclodextrin bổ sung trong mơi trường nuơi cấy tế bào huyền phù của P. hexandrum. Bổ sung phức hợp 3 mM coniferyl alcohol đã tăng hiệu suất podophyllotoxin lên 0.013% theo khối lương khơ, trong khi các nuơi cấy khơng cĩ precursor chỉ sản xuất được 0.0035% podophyllotoxin. Smollny và cs (1992) đã thơng báo callus và tế bào huyền phù của Lilium album đã sản xuất được 0.3% podophyllotoxin. Các hợp chất thứ cấp đã được sản xuất từ nuơi cấy mơ và tế bào thực vật (Mulbagal and Tsay 2004) Lồi thực vật Hợp chất thứ cấp mang hoạt tính sinh học Dạng nuơi cấy Tham khảo Agave amaniensis Saponins Callus Andrijany và cs 1999 Ailanthus altissima Alkaloids Huyền phù Anderson và cs 1987 Ailanthus altissima Canthinone alkaloids Huyền phù Anderson và cs 1986 Allium sativum Alliin Callus Malpathak và David 1986 Aloe saponaria Tetrahydroanthracene glucosides Huyền phù Yagi và cs 1983 Ambrosia tenuifolia Altamisine Callus Goleniowski và Trippi (1999) Anchusa officinalis Rosmarinic alkaloids Huyền phù De-Eknamkul vàEllis (1985) Brucea javanica Canthinone alkaloids Huyền phù Liu và cs 1990 Bupleurum falcatum Saikosaponins Callus Wang và Huang (1982) Camellia sinensis Theamine, dẫn xuất của -glutamyl Huyền phù Orihara&Furuya 1990 Canavalia ensiformis L-Canavanine Callus Ramirez và cs 1992 Capsicum annuum Capsaicin Huyền phù Johnson và cs 1990 Cassia acutifolia Anthraquinones Huyền phù Nazif và cs 2000 Catharanthus roseus Indole alkaloids Huyền phù Moreno và cs 1993 Catharanthus roseus Catharanthine Huyền phù Zhao và cs 2001 Choisya ternata Furoquinoline alkaloids Huyền phù Sejourne và cs 1981 Chrysanthemum cinerariaefolium Pyrethrins Callus Rajasekaran&cs1991 ... ... ... ... 5.Thu nhận taxol từ nuơi cấy mơ cây thơng đỏ- dược phẩm chủ yếu trong hố trị ung thư A-Tổng quan về cây thơng đỏ:A.1. Phân loại họ thơng đỏ:- Cây thơng đỏ ( Taxus wallichiana zucc )- Giới (regnum): Plantae- Ngành (divisio): Pinophyta- Lớp (class): Pinopsida- Bộ (ordo): Pinales- Họ (familia): Taxaceae - Các chi: gồm 2 nhĩmTaxaceae CephalotaxaceaeA.2. Đặc điểm:- Một họ của 3 chi và khoảng 7 tới 12 lồi thực vật quả nĩn.- Họ của 6 chi và khoảng 30 lồi. - Lồi cây bụi hay cây thân gỗ nhỏ nhiều cành.- Lá sắp xếp theo hình xoắn ốc.- Lá cĩ dạng thẳng hay hình mũi mác, với dải khí khổng màu lục nhạt hay trắng ở mặt dưới. - Các lồi phần lớn là đơn tính khác gốc, ít khi đơn tính cùng gốc. - Các nĩn đực dài khoảng 2-5 mm, tung phấn ra vào đầu mùa xuân.- Các nĩn cái bị suy giảm mạnh, chỉ cĩ một lá nỗn và một hạt à- Khi hạt chín lá nỗn phát triển thành áo hạt nhiều thịt, bao phủ một phần của hạt.- Áo hạt khi chín cĩ màu sáng, mềm, nhiều nước và ngọt. A.3. Phân bố :- Cây thơng đỏ phân bố hẹp ở các nước Châu Á như: Việt Nam, Ấn Độ, Trung Quốc, Myanmar, Philippines, Indonesia, Nepal, Afghanistan…- Ở Việt Nam,thơng đỏ lồi Himalaya.àđược phát hiện nhiều nhất ở Lâm Đồng - Năm 1995, ở Pà Cị, 5 cây thơng đỏ T. chinensis (cịn gọi là thơng đá, cây tra)àMai Châu, Hịa Bình A.4. Một số giá trị từ cây thơng đỏ - Lá của lồi cây này để trị hen suyễn, viêm phế quản, nấc, tiêu hố.- Cành và vỏ dùng trị bệnh thực tích, giun đũa; nước sắc của thân non dùng trị bệnh đau đầu.- Từ cây thơng đỏ Taxol - Taxol chiết xuất từ vỏ các lồi: T.brevifolia, T. cuspidata, T. yunnanensis, T. baccata và T. wallichiana.- Taxol được dùng để "chữa trị ung thư buồng trứng, ung thư vú, ung thư đầu, cổ và cĩ triển vọng xử lý hắc tố (melanomas)..." Quả cây thơng đỏ- Hiện tại trong hố trị ung thư, sử dụng 2 loại dược phẩm chủ yếu: Taxol và Taxotere. Paclitaxel,à- Taxol đều được chiết xuất từ cây thơng đỏ.è Docetaxel àTaxotere - Thơng thường 1 kg lá thơng đỏ chiết xuất được 20 mg Taxol và giá 1 mg Taxol trên thị trường thế giới hiện nay là 4,87 USD. một liềuà- Ví dụ: 1kg taxol/7.000kg vỏ thơng đỏ 6 cây thơng đỏ trưởng thành.àthuốc trị bệnh ung thư B-Nuơi cấy thơng đỏ để thu nhận taxol B.1. Một số thơng tin về hoạt chất từ cây thơng đỏ:Ở nước ta, lồi thơng Taxus wallichiana được nhân giống khá dễ dàng bằng phương pháp giâm cành cổ điển ở Đà Lạt, và gần đây là phương pháp nhân In vitro.B.2. Sản xuất dược chất taxol từ thơng đỏ bằng con đường sinh học:Tổng hợp bằng con đường bánàĐể sản xuất các hợp chất thứ cấp taxol bằng các enzyme trong các cây thơng đỏ.àtổng hợp hữu cơ - Sử dụng các kỹ thuật di truyền ở vi khuẩn để sản xuất Taxol theo con đường tổng hợp sinh học sẽ loại bỏ các bước mà bắt buộc phải che chắn các nhĩm hoạt tính trong quá trình tách chiết, kiểm tra tính lập thể, vùng hoạt tính đối với phương pháp tổng hợp ngày nay. - Ngồi ra, các kỹ thuật di truyền cĩ thể sản xuất các enzyme acyltransferase mong muốn cĩ khả năng chuyển hố các chất trung gian cao cấp thành baccatin III, các sản phẩm trung gian tự nhiên ở giai đoạn cuối trong con đường chuyển hố Taxol.- Việc tổng hợp Taxol địi hỏi khoảng hơn 19 gene acyltransferase để cĩ thể tạo vịng ba và thực hiện 8 bước baccatin IIIàbiến đổi oxyhố, 5 bước acyl hố và 11 bước tạo trung tâm lập thể và biến đổi baccatin III nhanh chĩng, tuy nhiên việc này rất khĩ khăn. B.3. Kỹ thuật nuơi cấy thơng đỏ để sản xuất taxol:Chuẩn bị mẫu nuơi cấyXử lý mẫu thực vậtNuơi cấy tạo trong mơi trường agar thích hợp đản bảo điều kiện mơi trường để mẫu phát triển biệt hĩa thành mơ sẹoSau khi biệt hĩa thành mơ sẹo ở giai đoạn thich hợp,chuyển sang nuơi cấy trong mơi trường lỏng trong các bình thủy tinh cĩ dung tích nhỏ, lắc liên tục để các tế bào rời ra và đồng nhất với mơi trường về õi và dinh dưỡng. Nuơi cấy trong các thiết bị lên men cĩ dung tích lớn, khuấy đảo liên tụcLy tâm hoặc lọc bã Dịch lọc được xử lý để thu nhận sản phẩmĐặc biệt, "Trong thời gian sắp tới, sẽ tiếp tục tiến hành thử nghiệm hình thức nuơi cấy tế bào thơng đỏ dạng bioreactor ("lắc lớn") trong mơi trường lỏng để cĩ thể tạo nguồn nguyên liệu tách chiết taxol một cách nhanh chĩng: Cứ 32.000 lít vừa tế bào vừa dung dịch được nuơi cấy dạng bioreactor sẽ thu được 1kg taxol". C-Kết luận:- Thơng đỏ là một nguồn nguyên liệu vơ cùng quý giá chúng ta cần phải cĩ những biện pháp bảo tồn nguồn gen này một cách hợp lý.- Cần tiến hành đa dạng các phương pháp nuơi cây tế bào đơn để thu được những sản phẩm thứ cấp cĩ giá trị kinh tế cao và đáp ứng nhu cầu cuộc sống cũng như việc sử dụng taxol để điều trị bệnh ung thư ( từ thơng đỏ).