Nhân giống cây dâu tây Nhật (fragaria ananassa “penihuble”) từ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

An Giang University Journal of Science – 2018, Vol. 19 (1), 19 – 27 19 NHÂN GIỐNG CÂY DÂU TÂY NHẬT (FRAGARIA ANANASSA “PENIHUBLE”) TỪ NUÔI CẤY ĐỈNH SINH TRƯỞNG Trần Thị Ngọc Lan1 1Trường Cao đẳng Kinh tế Kỹ thuật Lâm đồng Thông tin chung: Ngày nhận bài: 18/01/2018 Ngày nhận kết quả bình duyệt: 18/02/2018 Ngày chấp nhận đăng: 04/2018 Title: The process of micropropagation of Fragaria ananassa “Penihuble” through apical meristem culture Keywords: α-naphtaleneacetic acid (NAA), 6-benzyladenine (BA), Apical meristem, Fragaria ananassa “Penihuble”, somatic embryos Từ khóa: α-naphtaleneacetic acid (NAA), 6-benzyladenine (BA), cây dâu tây, đỉnh sinh trưởng, Fragaria ananassa “Penihuble”, phôi sinh dưỡng ABSTRACT A regeneration system was carried out to examine the competence of micropropagation from apical meristem culture of strawberry Fragaria ananassa “Penihuble”. The results showed that calli and somatic embryos were formed from apical meristem culture of runner tips on the MS medium supplemented with 30 g/l sucrose, 7 g/l agar, 0.2 mg/l NAA, 0.5 mg/l BA (with the highest survival rate of 93.33%, the best induction callus rate of 60%, 5.33 somatic embryos/sample). Calli which was multiplied with 8.56 - fold fresh mass, formed somatic embryos with 15.78 embryos/initial callus when they were subcultured on the MS medium supplemented with 30 g/l sucrose, 7 g/l agar, 0.5 mg/l BA. These embryos converted into normal plants on the ½ MS medium with the best regeneration rate of 100% without plant growth regulators. Histological observation showed that these calli contained embryogenic cells. In the ex-vitro culture, the highest survival rate was observed with mixture of Tribat substrate and rice husk ash in the ratio of 1:1 (72.33%) and no morphological variations were observed in these plantlets. TÓM TẮT Nghiên cứu khảo sát khả năng nhân giống dâu tây Nhật “Penihuble”. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng từ các ngó dâu tây đạt tỷ lệ sống 93,33%, hình thành mô sẹo 60%, phôi sinh dưỡng (5,33 phôi/mẫu) trên môi trường MS bổ sung 0,2 mg/l NAA, 0,5 mg/l BA. Mô sẹo được tiếp tục nhân lên đạt tỷ lệ tăng trưởng 8,56 lần, hình thành phôi sinh dưỡng (15,78 phôi/mẫu) trên môi trường MS bổ sung 30 g/l sucrose, 7 g/l agar, 0,5 mg/l BA. Môi trường ½ MS là phù hợp cho phôi sinh dưỡng phát triển thành cây với tỷ lệ 100% mà không cần bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật. Quan sát mô học mô sẹo cho thấy có nhiều tế bào có tiềm năng phát sinh phôi. Cây con trồng trong tự nhiên với giá thể thích hợp là hỗn hợp đất sạch Tribat và trấu hun (tỷ lệ 1:1), tỷ lệ sống 72,33%. Không có các sai hình nào được ghi nhận từ những cây này sau 30 ngày nuôi trồng. 1. GIỚI THIỆU Cây dâu tây (Fragaria ananassa) thuộc họ Hoa hồng (Rosaceae) là loại cây cho quả ngon, màu sắc và hương thơm quyến rũ, được sử dụng làm thực phẩm với nhiều món ăn ngon, đa dạng. Quả của cây dâu tây giàu chất khoáng, các hợp chất nhóm flavonoid... chống oxi hóa, giàu các loại vitamin nhóm B và đặc biệt là lượng vitamin C khá cao, cao hơn cả cam, dưa hấu. Đây là đặc điểm ưu việt của quả dâu tây, giúp tăng sức đề An Giang University Journal of Science – 2018, Vol. 19 (1), 19 – 27 20 kháng, chống nhiễm trùng, nhiễm độc, cảm cúm, tốt cho tim mạch và chống stress. Quả dâu tây cũng chứa nhiều acid ellagic, được xem là chất kháng ung thư (ICAR news, 2005). Vì vậy, đây là loại quả có tiềm năng kinh tế lớn. Trong các giống dây tây, giống dâu tây Nhật nhập nội cho quả to, màu sắc đỏ, đẹp, đặc biệt có độ ngọt và mùi hương hấp dẫn. Tuy nhiên, trong nhân giống dâu tây, phương pháp nhân giống sinh dưỡng từ ngó dâu thường dễ nhiễm bệnh và thoái hóa giống, phương pháp gieo hạt thường cho cây biến dị, quả nhỏ. Trên thế giới đã có các công bố về vi nhân giống dâu tây. Wang, Wergin và Zimmerman (1984), nuôi cấy các phôi chưa trưởng thành của quả dâu tây để tạo phôi sinh dưỡng. Hassan và cs. (2010), nhân giống các mắt đốt dâu tây Fragaria x ananassa Duch trên môi trường MS bổ sung 1 mg/l BA và 0,1 mg/l NAA để nhân chồi, ra rễ trên môi trường MS bổ sung 0,1 mg/l IAA và cho thấy sử dụng GA3 hay nước dừa không ảnh hưởng đáng kể đến quá trình nhân chồi của dâu tây. Mir và cs. (2010), nhân chồi từ các mắt đốt dâu tây trên môi trường MS bổ sung 2 mg/l BA và 0,5 mg/l NAA. Moradi, Otroshy và Azimi (2011), nhân giống các mắt đốt của cây dâu tây gieo hạt in vitro trên môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l BA và 0,2 mg/l kinetin để nhân chồi, ra rễ trên môi trường MS bổ sung 0,1 mg/l BA và 0,2 mg/l IBA. Ashrafuzzaman và cs. (2013) đã nhân giống chồi từ các ngó dâu tây trên môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l BA, ra rễ trên môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l IBA. Husaini và cs. (2008) đã có công bố về sự hình thành phôi sinh dưỡng từ mô sẹo dâu tây được hình thành từ những mẫu lá trên môi trường MS bổ sung 4 mg/l TDZ. Tuy nhiên, phương pháp tạo phôi sinh dưỡng từ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng thì chưa được đề cập. Đây cũng là phương pháp hữu hiệu trong nhân giống và gia tăng tỷ lệ không nhiễm virus. Vì vậy, trong nghiên cứu này, mục tiêu mà chúng tôi hướng đến là nhân giống hàng loạt cây con từ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng qua con đường phát sinh phôi sinh dưỡng với giống dâu tây Nhật nhập nội có giá trị kinh tế cao. 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu Đối tượng nghiên cứu: các ngó của giống dâu tây (Fragaria ananassa “Penihuble”), có xuất xứ từ Nhật, là các giống dâu cho trái to, ngọt và đẹp được nhập nội (Hình 1a, 1b). Trên thị trường tại Đà lạt, 1 kg dâu tây loại này có giá khoảng 400000 Việt Nam đồng. Hình 1. Cây dâu tây (Fragaria ananassa “Penihuble”). a. Cây mang quả. b. Một đoạn ngó dâu tây. An Giang University Journal of Science – 2018, Vol. 19 (1), 19 – 27 21 Môi trường nuôi cấy cơ bản: MS (Murashige, Skoog, 1962), pH được điều chỉnh 5,7, hấp vô trùng ở 121 οC, 1 atm. 2.2 Phương pháp 2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên quá trình nuôi cấy đỉnh sinh trưởng cây dâu tây Xử lý nhiệt chồi dâu tây Các ngó dâu tây được bỏ các lá ngoài, có chiều dài từ 1 cm – 1,25 cm, rửa sạch dưới vòi nước đang chảy, rửa lại bằng nước rửa chén Sunlight, rửa lại dưới vòi nước đang chảy, khử trùng trong tủ cấy bằng ethanol 900, rửa nước đã hấp vô trùng, khử trùng tiếp bằng HgCl2 0,1% trong 6 phút, bỏ bớt các lá ngoài, chỉ còn lại các chồi mang từ 4 - 5 lá non, rửa nước đã hấp vô trùng 3 lần. Nuôi cấy các chồi này trong môi trường MS bổ sung 30 g/l sucrose, 7 g/l agar, cường độ ánh sáng 2000 lux và độ ẩm không khí 70%, ủ trong điều kiện chiếu sáng 16/24 giờ ở 37 οC trong 7 ngày nhằm tiêu diệt virus (nếu có). Nuôi cấy 1 mẫu/bình có thể tích 250 ml với 20 ml môi trường nuôi cấy. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Các chồi đã được nuôi in vitro như trên được tách tiếp các lá bao chồi, rửa nước đã hấp vô trùng 3 lần, dùng dao và kẹp tách lấy đỉnh sinh trưởng mang từ 2 - 3 lá sơ khởi (thao tác được thực hiện dưới kính lúp, Hình 2a1.) và cấy vào môi trường MS bổ sung BA (0, 0,5 hoặc 1 mg/l), có kết hợp hay không kết hợp NAA (0, 0,2 mg/l), 30 g/l sucrose và 7 g/l agar. Mỗi nghiệm thức gồm 5 mẫu. Nuôi cấy 1 mẫu/bình có thể tích 250 ml với 20 ml môi trường nuôi cấy. Theo dõi sự sống sót, sự phát sinh mô sẹo, phôi sinh dưỡng hay chồi của mẫu cấy sau 15 ngày và 30 ngày nuôi cấy. 2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA lên sự tăng trưởng của mô sẹo và hình thành phôi sinh dưỡng dâu tây có nguồn gốc từ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Các mô sẹo dâu tây hình thành từ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (50 mg/mẫu) được nuôi cấy tiếp tục trên môi trường MS bổ sung 30 g/l sucrose, 7 g/l agar và các nồng độ khác nhau của BA (0, 0,5 mg/l) và NAA (0, 0,2 mg/l). Nuôi cấy 5 mẫu có khối lượng 50 mg/bình, thể tích 250 ml với 40 ml môi trường nuôi cấy. Mỗi nghiệm thức gồm 5 bình. Quan sát và thu nhận số liệu về tỷ lệ tăng trưởng (khối lượng mô sẹo sau nuôi cấy/khối lượng mô sẹo trước nuôi cấy), số phôi sinh dưỡng trung bình hình thành sau 30 ngày nuôi cấy. 2.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ môi trường MS lên sự sinh trưởng của phôi sinh dưỡng cây dâu tây Các phôi sinh dưỡng thu nhận từ các thí nghiệm trên được nuôi cấy trên 3 loại môi trường: MS. ¾ MS và ½ MS bổ sung 20 g/l sucrose, 1 g/l than hoạt tính (AC) và 7 g/l agar để khảo sát sự sinh trưởng, hình thành cây và phát triển của các phôi này. Nuôi cấy 20 mẫu/bình có thể tích 500 ml với 70 ml môi trường nuôi cấy. Quan sát và thu nhận số liệu về tỷ lệ hình thành cây con (số phôi hình thành cây con trên số phôi nuôi cấy *100), chiều cao, màu sắc của cây, số lá, số rễ và chiều dài rễ trung bình/cây sau 30 ngày nuôi cấy. 2.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của giá thể môi trường lên khả năng sống sót và sinh trưởng của cây dâu tây sau 30 ngày nuôi trồng trong điều kiện ex vitro Cây con từ nuôi cấy in vitro được giữ nguyên trong bình, chuyển ra ngoài vườn ươm trong 1 tuần để thích ứng. Sau đó, cây con được lấy ra, rửa sạch môi trường bám lên rễ, trồng trong các loại giá thể: vỏ trấu hun, đất sạch (Tribat 10 kg/bao) hay hỗn hợp tro trấu hun và đất sạch (tỷ lệ 1:1), có độ ẩm 85%. Cây được trồng trong các bầu nhựa polyethylene, đường kính bầu 8 cm; tưới cây 2 lần/ngày. Quan sát sự sống sót và sự sinh trưởng của cây dâu tây. Số liệu được thu nhận sau 30 ngày nuôi trồng. 2.2.5 Quan sát mô học Làm các loại tiêu bản về mô sẹo với việc cắt lát theo chiều ngang mẫu mô sẹo cần quan sát, ngâm trong dung dịch javel 10% trong 15 phút, rửa nước, ngâm trong dung dịch acid acetic 45% trong 15 phút, rửa nước, nhuộm màu bằng thuốc An Giang University Journal of Science – 2018, Vol. 19 (1), 19 – 27 22 nhuộm hai màu đỏ carmin và xanh iod trong 15 phút, rửa nước và quan sát trên kính hiển vi quang học Olympus, Nhật với độ phóng đại 40 - 400 lần. Quan sát đỉnh sinh trưởng cây dâu tây ở độ phóng đại 100 lần. 2.2.6 Điều kiện thí nghiệm Tất cả các thí nghiệm nhân giống in vitro và ex vitro được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, lặp lại ba lần. Nhiệt độ phòng nuôi: 25 οC ± 1 οC, cường độ ánh sáng 2000 lux và độ ẩm không khí 70%. Chu kỳ chiếu sáng trong ngày: 16 giờ sáng và 8 giờ tối. Trong thí nghiệm khảo sát sự thích nghi của cây con trong điều kiện ex vitro thì sử dụng vườn ươm (có lưới che 50% ánh sáng trong 15 ngày đầu), có nhiệt độ dao động ngày đêm là 17 οC – 25 οC ± 1 οC, cường độ ánh sáng: 7000 lux và độ ẩm không khí: 80%. 2.2.7 Phương pháp xử lý số liệu Các thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Các số liệu thu được là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại. Số liệu thu thập được xử lý trên phần mềm Excel 2010 và được phân tích thống kê bằng phép thử Duncan (sự khác biệt có ý nghĩa ở mức xác suất P < 0,05) với phần mềm xử lý thống kê SPSS (Statistical Program Scientific System) 16.0. 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Ảnh hưởng của NAA và BA lên quá trình nuôi cấy đỉnh sinh trưởng cây dâu tây Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng cây dâu tây với việc bổ sung các nồng độ khác nhau của NAA và BA, kết quả nhận được thể hiện qua Bảng 1. Quan sát mẫu đỉnh sinh trưởng cây dâu tây trên kính hiển vi có hình vòm (Hình 2a1). Đây là nơi chứa các tế bào mô phân sinh với những tế bào kích thước nhỏ, nhân to và có tiềm năng phân chia mạnh mẽ. Có thể gọi đỉnh sinh trưởng là nơi chứa các tế bào gốc, nơi biệt hóa các cơ quan sau này. Thông thường, các virus di chuyển dễ dàng trong cơ thể thực vật thông qua hệ thống mạch dẫn, là cấu trúc mà ở đỉnh phân sinh không có. Chính vì vậy, mô phân sinh đỉnh thường khó nhiễm virus (Morel, 1960). Hơn nữa, hoạt tính trao đổi chất cao trong quá trình phân chia của các tế bào mô phân sinh cũng như nồng độ auxin nội sinh cao ở trong các đỉnh chồi có thể ức chế sự sinh sản, sao chép của virus. Bảng 1. Ảnh hưởng của NAA và BA lên quá trình nuôi cấy đỉnh sinh trưởng cây dâu tây sau 30 ngày nuôi cấy. Môi trường nuôi cấy bổ sung Tỷ lệ sống sót (%) Tỷ lệ hình thành mô sẹo (%) Số phôi/mẫu Tỷ lệ hình thành chồi (%) NAA(mg/l) BA(mg/l) 0 0 66,67b* 20,00d 1,67c 46,67a 0,2 0 26,67d 26,67c 1,67c 0,00e 0 0,5 66,67b 40,00b 2,00c 26,67c 0,2 0,5 93,33a 60,00a 5,33a 33,33b 0,2 1 53,33c 40,00b 3,67b 13,33d Chú thích: *: Các mẫu tự khác nhau (a,b,...) trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa với P <0,05 bằng phép thử Duncan. Đỉnh sinh trưởng có thể hình thành phôi sinh dưỡng với tiềm năng nhân phôi. IAA được hình thành từ đỉnh sinh trưởng làm cho môi trường nuôi cấy nếu có bổ sung IAA sẽ làm giảm khả năng nhân lên của phôi, vì vậy, nghiệm thức chỉ bổ sung 0,2 mg/l NAA là không khả thi. Ở nghiệm thức bổ sung 0,2 mg/l NAA và 0,5 mg/l BA cho tỷ lệ sống sót cũng như tỷ lệ hình thành mô sẹo và phôi sinh dưỡng là cao hơn cả (tương ứng lần lượt là 93,33% và 60% với số phôi trung An Giang University Journal of Science – 2018, Vol. 19 (1), 19 – 27 23 bình đạt 5,33 phôi/mẫu). Mô sẹo phôi màu vàng đã hình thành sau 15 ngày nuôi cấy (Hình 2a2). Mô sẹo hình thành và các phôi phát triển độc lập sau 30 ngày nuôi cấy (Hình 2b). Các auxin như NAA cần kết hợp với IAA nội sinh ở mô phân sinh đỉnh chồi, kích thích tế bào cảm ứng thành phôi (Jiménez & Thomas, 2005). Đây cũng có thể là yêu cầu chủ yếu trong quá trình phát sinh phôi. Sự kết hợp giữa NAA và BA làm tế bào mô phân sinh dãn vách, tăng kích thước, tăng khả năng phân chia, giúp tế bào sống sót và biệt hóa khả năng tế bào gốc của mình để hình thành phôi sinh dưỡng. Sự tham gia tuy với nồng độ thấp của NAA đã phối hợp với BA gia tăng khả năng phân bào của các phôi sinh dưỡng. Sự kết hợp giữa NAA và BA trong nuôi cấy phôi thường áp dụng trong nuôi cấy nhân phôi họ Lan (Orchidaceae) hay nhân chồi từ các đoạn thân như công bố của Mir và cs. (2010) trên đối tượng dâu tây Fragaria x ananassa. Sự hình thành phôi sinh dưỡng từ phôi non của cây dâu tây đã được báo cáo bởi Wang và cs. (1984). Tuy nhiên, sự biệt hóa từ phôi non thường có kiểu di truyền không giống với cây mẹ. Nhân giống tạo phôi sinh dưỡng từ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng thường cho thế hệ cây con tương đồng về kiểu di truyền với cây mẹ. Đây cũng là ưu thế của việc nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (Morel, 1964). 3.2 Ảnh hưởng của NAA và BA lên lên sự tăng trưởng của mô sẹo, hình thành phôi sinh dưỡng có nguồn gốc từ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng dâu tây Các mẫu mô sẹo tiếp tục nuôi cấy sẽ tăng trưởng và hình thành phôi sinh dưỡng (Hình 2c, 2e) Các số liệu về sự tăng trưởng của mô sẹo và sự hình thành phôi sinh dưỡng dâu tây được trình bày qua Bảng 2. Bảng 2. Ảnh hưởng của NAA và BA lên quá trình nhân lên của phôi sinh dưỡng có nguồn gốc từ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng cây dâu tây sau 30 ngày nuôi cấy. Môi trường nuôi cấy bổ sung Tỷ lệ tăng trưởng của mô sẹo Số phôi/mẫu (%) NAA (mg/l) BA (mg/l) 0 0 2,25d 4,16d 0,2 0 4,12c 7,34c 0,2 0,5 6,63b 10,25b 0 0,5 8,56a 15,78a Chú thích: *: Các mẫu tự khác nhau (a, b,...) trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa với P <0,05 bằng phép thử Duncan. Các nghiên cứu nhân giống dâu tây từ ngó của Moradi và cs. (2011) hoặc của Nayem và cs. (2011) cho thấy, ngoài 0,5 mg/l BA, cần bổ sung vào môi trường nuôi cấy từ 0,2 mg/l – 2 mg/l kinetin để nhân chồi nhưng trong nghiên cứu này chỉ cần bổ sung 0,5 mg/l BA là đủ để mô sẹo phát triển với tỷ lệ tăng trưởng gấp 8,56 lần so với khối lượng ban đầu và số phôi hình thành/mẫu đạt cao nhất trong các nghiệm thức (15,78 phôi/mẫu). Điều này cho thấy, tiềm năng phát sinh phôi khi nuôi cấy đỉnh sinh trưởng dâu tây, chỉ cần 1 lượng vừa đủ chất điều hòa sinh trưởng thực vật (CĐHSTTV) là đủ để chúng phát sinh phôi và biệt hóa thành cây. Trong nghiên cứu sự hình thành phôi sinh dưỡng, sự giảm nồng độ auxin và bổ sung hàm lượng citokinin thường kích thích các mô sẹo hình thành phôi. Sự bổ sung chỉ BA trong nghiên cứu này một lần nữa đã khẳng định điều này. Sự quan trọng của BA trong việc nhân chồi dâu tây cũng đã được trình bày ở một số nghiên cứu (Adel & Sawy, 2007; Biswas & cs., 2007; Hasan, Nigar, Rabby, Mizan & Rahman, 2010). An Giang University Journal of Science – 2018, Vol. 19 (1), 19 – 27 24 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ môi trường MS lên sự sinh trưởng của phôi sinh dưỡng dâu tây Nồng độ các chất dinh dưỡng ảnh hưởng đến khả năng biệt hóa và phát triển thành cây của phôi sinh dưỡng dâu tây với các kết quả nhận được, thể hiện qua Bảng 3. Tỷ lệ hình thành cây con đạt cao nhất trên môi trường ½ MS (100%). Tỷ lệ hình thành cây con trên hai môi trường còn lại có thấp hơn do một phần số phôi tiếp tục nhân lên (Hình 2f). Điều này cho thấy, bản chất nhân phôi của các phôi sinh dưỡng dâu tây trên môi trường đủ dinh dưỡng mặc dù không bổ sung CĐHSTTV. Trên môi trường MS, phôi phát triển thành cây con nhưng cây cao, lá mọng, xanh không đậm. Trên môi trường ½ MS tuy chiều cao cây có thấp hơn hai môi trường còn lại nhưng cây cho lá xanh đậm, cứng cáp với số rễ và chiều dài rễ đạt tương đương với hai môi trường trên (Bảng 3, Hình 2g). Các nghiên cứu của Adel và Sawy (2007) hay Ashrafuzzaman và cs. (2013) đã sử dụng IBA để kích thích ra rễ các chồi dâu tây in vitro, trong nghiên cứu của chúng tôi đã không sử dụng CĐHSTTV nhưng các phôi dâu vẫn phát triển, hình thành cây con hoàn chỉnh, minh chứng cho bản chất tự lập của phôi sinh dưỡng dâu tây. Việc sử dụng than hoạt tính nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của rễ nhờ hấp phụ các chất thải có tính ức chế do cây tiết ra; đồng thời làm giảm cường độ ánh sáng đến môi trường vùng rễ. Bảng 3. Ảnh hưởng của nồng độ môi trường MS lên sự sinh trưởng của phôi sinh dưỡng cây dâu tây sau 30 ngày nuôi cấy. Môi trường nuôi cấy Tỷ lệ hình thành cây con (%) Chiều cao cây (cm) Số lá/cây Số rễ/cây Chiều dài rễ (cm) MS 81, 33c* 7,82a 5,95a 6,91a 2,17a ¾ MS 90,67b 7,55a 4,71b 6,23a 2,24a ½ MS 100,00a 5,42b 4,54b 6,34a 2,45a Chú thích: *: Các mẫu tự khác nhau (a, b,...) trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa với P <0,05 bằng phép thử Duncan. 3.4 Ảnh hưởng của giá thể môi trường lên khả năng sống sót và sinh trưởng của cây dâu tây sau 30 ngày nuôi trồng Nuôi cấy cây con dâu tây trong điều kiện ex vitro thường khó, tỷ lệ chết rất cao do cây mọng nước, dễ nhiễm khuẩn. Chính vì vậy, giá thể nuôi trồng là yếu tố quan trọng trong sự sống sót và phát triển của cây trong điều kiện ex vitro. Bảng 4. Ảnh hưởng của giá thể môi trường lên khả năng sống sót và sinh trưởng của cây dâu tây sau 30 ngày nuôi trồng. Giá thể môi trường Tỷ lệ cây sống sót (%) Chiều cao cây (cm) Số rễ mới/cây Hình thái của cây Vỏ trấu hun 10, 67*b 6,12b 3,65b Cây cao, lá mọng, xanh không đậm, rễ phát triển kém Đất sạch Tribat 70,33a 8,55a 6,11a Cây có chiều cao vừa phải, lá cứng cáp, xanh đậm, rễ phát triển An Giang University Journal of Science – 2018, Vol. 19 (1), 19 – 27 25 Giá thể môi trường Tỷ lệ cây sống sót (%) Chiều cao cây (cm) Số rễ mới/cây Hình thái của cây Hỗn hợp đất sạch Tribat và trấu hun (tỷ lệ 1:1) 72,33a 8,22a 5,84a Cây có chiều cao vừa phải, lá xanh đậm, rễ phát triển Chú thích: *: Các mẫu tự khác nhau (a, b,...) trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa với P <0,05 bằng phép thử Duncan. Giai đoạn đầu (15 ngày), khi mới đưa ra vườn ươm, cây rất dễ mất nước nên cây được trồng trong điều kiện che sáng 50%. Sau đó, cây được trồng trong vườn ươm có giàn che polyethylene. Các kết quả khảo sát nhận được thể hiện qua Bảng 4. Từ Bảng 4 cho thấy, việc sử dụng giá thể đất sạch Tribat hay hỗn hợp đất sạch Tribat và trấu hun đều cho tỷ lệ sống sót khá cao (tương ứng lần lượt 70,33% và 72,33%), cây cho lá xanh đậm, hình thành rễ mới, phát triển tốt sau 30 ngày nuôi trồng (Hình 2h). Tuy nhiên, sử dụng hỗn hợp đất sạch Tribat và trấu hun sẽ có giá thành thấp hơn so với việc sử dụng giá thể đất sạch Tribat. Các nghiên cứu về trồng cây dâu vi nhân giống trong điều kiện ex vitro trong và ngoài nước hầu hết đều sử dụng giá thể là đất sạch đóng gói sẵn hay hỗn hợp than bùn và vermiculite (Moradi & cs., 2011). Vì vậy, việc sử dụng bổ sung trấu hun (một vật liệu dễ kiếm và rẻ tiền) trong trồng cây dâu con có lẽ là hữu hiệu và khả thi. 3.5 Quan sát mô học Quan sát các tiêu bản vi phẫu mô sẹo cho thấy có sự phân chia vô tổ chức của các tế bào mô sẹo, tồn tại các tế bào đẳng kính, nhân to là những tế bào có khả năng hình thành phôi (Hình 2d). Nuôi cấy tiếp tục các mô sẹo này trên môi trường không bổ sung CĐHSTTV, chúng sẽ biệt hóa thành các phôi sinh dưỡng. Các phôi tiếp tục phát triển và hình thành cây con, phát triển độc lập mà không liên kết với mẫu mô mẹ (Hình 2b, 2e). Vì vậy, nhân giống dâu tây qua con đường phát sinh phôi sinh dưỡng có nguồn gốc từ đỉnh sinh trưởng là biện pháp hữu hiệu và khả thi. 4. KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Qua con đường vi nhân giống cây dâu tây cho thấy, nuôi cấy đỉnh sinh trưởng cây dâu tây đã hình thành mô sẹo (tỷ lệ đạt 60%) trên môi trường MS bổ sung 0,2 mg/l NAA, 0,5 mg/l BA. Các mô sẹo này được nhân lên với tỷ lệ tăng trưởng đạt 8,56 lần, hình thành phôi sinh dưỡng với số phôi trung bình là 15,78 phôi/mẫu trên môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l BA. Môi trường ½ MS là phù hợp cho các phôi dâu tây phát triển thành cây con với tỷ lệ hình thành cây con đạt 100% mà không cần bổ sung CĐHSTTV. Trong nuôi trồng ex vitro, hỗn hợp đất sạch Tribat và trấu hun (tỷ lệ 1:1) là giá thể thích hợp để trồng cây trong điều kiện tự nhiên, tỷ lệ sống sót đạt 72,33%. 4.2 Khuyến nghị Cần có các khảo sát về sự sinh trưởng và phát triển của những cây dâu con này để có thể áp dụng trong nhân giống đại trà giống cây có giá trị này (Thực tế, những cây dâu trong ống nghiệm này đã được bán cho bà con nông dân đường Đa Phú, phường 7, thành phố Đà lạt. Đến nay, cây đã cho quả đạt chất lượng). An Giang University Journal of Science – 2018, Vol. 19 (1), 19 – 27 26 Hình 2. Nhân giống cây dâu tây (Fragaria ananassa “Penihuble”) qua con đường nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. a1. Đỉnh sinh trưởng; a2.Mô sẹo hình thành từ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (mũi tên) sau 15 ngày nuôi cấy; b. Sự hình thành phôi sinh dưỡng (mũi tên liền), mô sẹo mang phôi (mũi tên ngắt quãng) và cây con sau 30 ngày nuôi cấy; c. Sự nhân lên của mô sẹo; d. Tiêu bản nhuộm màu mẫu mô sẹo có khả năng phát sinh phôi; e. Sự hình thành cây con từ phôi sinh dưỡng; f. Phát sinh cây con từ mô sẹo cây dâu tây; g. Các cây con dâu tây hình thành và phát triển từ phôi sinh dưỡng; h. Trồng cây con trong điều kiện vườn ươm. LỜI CẢM ƠN Tác giả trân trọng cảm ơn Trường Cao đẳng Kinh tế Kỹ thuật Lâm Đồng đã tạo điều kiện vật chất cho nghiên cứu này. TÀI LIỆU THAM KHẢO Adel, E.L. & Sawy, M. (2007). Somaclonal variation in micro-propagated strawberry detected at the molecular level. International Journal of Agricultural Biology, 9, 720 - 725. Ashrafuzzaman, M., Faisal, S., Yadav, M., Khanam, D. & Raihan, F. (2013). Micropropagation of strawberry (Fragaria ananassa) through runner culture. Bangladesh Journal of Agricultural, 38(3), 467 - 472. Biswas, M.K., Hossain, M., Ahmed, M.B., Roy, U.K., Karim, R., Razvy, M.A., Salahin M. & Islam, R. (2007). Multiple shoots regeneration of strawberry under various colour illuminations. American-European Journal of Science Res, 2, 133 -135. Hasan, M.N., Nigar, N., Rabbi, M.A.K., Mizan, S.B. & Rahman, M.S. (2010). Micropropagation of strawberry (Fragaria x An Giang University Journal of Science – 2018, Vol. 19 (1), 19 – 27 27 ananassa Duch.). Int Journal Sustain Crop Pro, 5(4), 36 - 41. Husaini, C.A., Samina, A., Mukhtar, B., Tabassum, Q. & Malik, Z.A. (2008). A high efficiency direct somatic embryogenesis system for strawberry (Fragaria x ananassa Duch.) cultivar. Journal Crop Science Biotechnology, 11 (2), 100 - 107. ICAR News. (2005). Indian council of agriculture research, 11(4). New Delhi, India. Jiménez, V.M. & Thomas, C. (2005). Participation of plant hormones in determination and progression of somatic embryogenesis. In: Somatic embryogenesis, Mujib, A., Šamaj, J. (eds.). Plant Cell Monogr, Springer-Verlag Berlin Heidelberg,103 - 118. Mir, J.I., Ahmed, N., Rizwan, R., Shabir. H., Hidayatullah, M. & Sheikh, M.A. (2010). Micropropagation of strawberry (Fragaria x ananassa). Crop Improvement, 37 (2), 153 - 156. Moradi, K., Otroshy, M. & Azimi, M.R. (2011). Micropropagation of strawberry by multiple shoots regeneration tissue cultures. Journal Agricultural Technology, 7(6), 1755 - 1763. Morel, G.M. (1960). Producing virus-free Cymbidium. Am Orchid Society Bull, 29, 495 - 497. Morel, G.M. (1964). Tissue culture − A new means of clonal propagation of orchids. American Orchid Society Bull, 33, 473 - 478. Murashige, T. & Skoog, F. (1962). A revised medium for rapid growth and bioassays with tobaco tissue culture. Physiology Plant, 15, 473 - 497. Nayem, Z., Shamsul, H., Saif, U., Fazle, A. & Ashrafuzzaman, M. (2011). Study of shoot multiplication of strawberry (Fragaria ananassa). Int. J. Agri. Res. Innov. Tech, 1 (1 & 2), 69 - 72. Wang, D.Y., Wergin, W.P. & Zimmerman, R.H. (1984). Somatic embryogenesis and plant regeneration from immature embryo of strawberry. Horticulture Science, 19, 71 - 72. Website. (2004). .html.