Nhân dòng gen prion (prp) từ giống bò hanwoo (bos taurus coreanae) của Hàn Quốc

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ****0O0**** ĐẶNG QUỐC BẢO NHÂN DÕNG GEN PRION (PrP) TỪ GIỐNG BÕ HANWOO (Bos Taurus Coreanae) CỦA HÀN QUỐC LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh -Tháng 9/2006- BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ****0O0**** NHÂN DÕNG GEN PRION (PrP) TỪ GIỐNG BÕ HANWOO (Bos Taurus Coreanae) CỦA HÀN QUỐC LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện GS.TS. Kwon Moosik ĐẶNG QUỐC BẢO (Pr PGS.TS Nguyễn Ngọc Tuân KHÓA: 2002 – 2006 Thành phố Hồ Chí Minh -Tháng 9/2006- MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC FACULTY OF BIOTECHNOLOGY  GENE CLONING PRION (PrP) FROM KOREAN BOVINE: HANWOO (Bos taurus Coreanae) GRADUATION THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY Professor Student Ph.D Kwon Moosik DANG QUOC BAO Dr. Nguyen Ngoc Tuan TERM: 2002 - 2006 HCMC, 09/2006 iii LỜI CẢM TẠ Chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học. Các Thầy Cô Phòng Quan Hệ Quốc Tế Các Thầy Khoa Công Nghệ Di Truyền, Đại Học Sungkyunkwan, Hàn Quốc Đã truyền đạt cho em những kiến thức quý báu và giúp đỡ em trong thời gian em học tập tại trƣờng. Đặc biệt xin chân thành cảm ơn sâu sắc đến: TS. Kwon Moosik- Trƣởng bộ môn Công Nghệ Di Truyền, Đại Học Sungkyunkwan đã tận tình dạy bảo, hƣớng dẫn, giúp đỡ em trong nghiên cứu và thực hiện đề tài. TS. Nguyễn Ngọc Tuân- Trƣởng phòng Sau Đại Học, Đại Học Nông Lâm đã giúp đỡ rất nhiều và hƣớng dẫn tận tình trong quá trình viết khoá luận. TS. Trần Thị Dung- Trƣởng bộ môn Công Nghệ Sinh Học trƣờng Đại Học Nông Lâm đã tạo điều kiện cho em thực hiện đề tài này. Ths. Kim Yong Hwan và các anh chị trong phòng thí nghiệm Công Nghệ Di Truyền, Đại Học Sungkyunkwan đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo em trong suốt thời gian em thực hiện khóa luận. Xin cảm ơn các bạn trong và ngoài lớp đã động viên giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và làm khóa luận tốt nghiệp. Con xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến bố mẹ, những ngƣời đã sinh thành, nuôi dƣỡng, dạy dỗ con và luôn bên con trong mọi thời điểm. Thủ Đức, ngày 10 tháng 08 năm 2006 iv TÓM TẮT ĐẶNG QUỐC BẢO, Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2006. ―NHÂN DÒNG GEN PRION (PrP) TỪ BÒ HANWOO (BOS TAURUS COREANAE) CỦA HÀN QUỐC‖ Giáo viên hƣớng dẫn GS. TS. KWON MOOSIK PGS. TS. NGUYỄN NGỌC TUÂN BSE là một bệnh truyễn nhiễm do prion, là một trong những bệnh đƣợc quan tâm trong giới nghiên cứu. Hiện nay các nhà khoa học đang tiến hành nghiên cứu để có thể tạo ra một bộ kit chẩn đoán sớm bệnh BSE, các nghiên cứu này đều tập trung nghiên cứu cấu trúc protein PrPsc, dạng protein gây bệnh của prion. Bƣớc đầu trong nghiên cứu của chúng tôi về protein PrPsc, đã tiến hành nhân dòng và giải trình tự gen prion. Tách chiết DNA từ máu của bò Hanwoo và PCR để khuếch đại gen prion. Gen prion đƣợc khuếch đại có kích thƣớc 651 bp, sau đó đƣợc kết buộc vào véc tơ pGEM- T easy và chuyển vào vi khuẩn E. coli DH5α. Khuẩn lạc chứa véc tơ tái tổ hợp có màu trắng trên môi trƣờng LB chuyên biệt (Amp+, Xgal, IPTG). Plasmid thu đƣợc sau quá trình tinh sạch đƣợc giải mã trình tự. Kết quả giải trình tự thành công đã cho thấy sự giống nhau gần nhƣ hoàn toàn trong trình tự gen prion của bò Hanwoo và bò châu Âu. Việc thành công trong quá trình nhân dòng sẽ là bƣớc đầu quan trọng cho mục tiêu cuối cùng trong nghiên cứu của chúng tôi là tạo kit chẩn đoán bệnh BSE. v ABSTRACT Prion — short for proteinaceous infectious particle — is a unique type of infectious agent, as it is made only of protein. Prion was termed in 1982 by Prusiner, who was prized Nobel for his research on prion. Bovine spongiform encephalopathy (BSE) is one of the most notable prion diseases. BSE is not only potential risk on bovine but also on human. Until now Korea is free from BSE (Tae-Yung Kim et. al,2005), but the BSE is high risk damage society. The study on BSE is absolutelly remarkable. As the first step of our prion study, we were attempted cloning full gene of prion encoding bovine prion protein from Korean bovine. PrP gene was amplified from genome DNA (gDNA) of Korean bovine by PCR following 2 primers forward and reverses primer. The recombinant PrP of full sequence cDNA is 651bp long encoding 217 amino acids. Amplified gene was then transmitted in to pGEM-T easy vector. Subsequently, recombination vector was transformed into compentent cell E. coli DH5α. Recombinant plasmid of PrP was then further analyzed through sequencing. vi MỤC LỤC Lời cảm tạ ................................................................................................................... iii Tóm tắt ........................................................................................................................ iv Mục lục ....................................................................................................................... vi Danh sách các chữ viết tắt .......................................................................................... viii Danh sách các bảng .................................................................................................... xi Danh sách các bảng hình ảnh ..................................................................................... x CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU .............................................................................................. 1 1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................ 1 1.2. Mục tiêu ............................................................................................................... 1 1.3. Yêu cầu ................................................................................................................ 1 CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................... 2 2.1. Prion ..................................................................................................................... 2 2.2. Bệnh não dạng xốp ở bò và các bệnh khác có nguyên nhân do pion .................. 3 2.2.1. Bệnh não dạng xốp ở bò ................................................................................... 3 2.2.2 Các bệnh khác có nguyên nhân do prion ........................................................... 4 2.3. Sự nhân dòng ....................................................................................................... 5 2.3.1. Kỹ thuật PCR .................................................................................................... 5 2.3.2. Kỹ thuật điện di ................................................................................................ 6 2.3.3. Véc tơ plasmid .................................................................................................. 6 2.3.4. Sự kết buộc ....................................................................................................... 7 2.3.5. Biến nạp ở vi khuẩn E. coli .............................................................................. 7 2.3.6. Chọn lọc vi khuẩn đã đƣợc biến nạp ................................................................ 8 2.3.7. Giải trình tự ...................................................................................................... 9 2.3.7.1. Phƣơng pháp Sanger và Coulson ................................................................... 9 2.3.7.2. Phƣơng pháp Maxam – Gilbert ..................................................................... 9 2.3.7.3. Giải trình tự bằng hệ thống tự động .............................................................. 9 CHƢƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................. 10 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài ................................................................ 10 3.2. Vật liệu ................................................................................................................ 10 vii 3.3. Dụng cụ và hoá chất ............................................................................................ 10 3.3.1. Dụng cụ............................................................................................................. 10 3.3.2. Hóa chất ............................................................................................................ 10 3.3.3. Các dung dịch ................................................................................................... 11 3.4. Mồi PCR ............................................................................................................. 11 3.5. Khuếch đại gen prion từ bộ gen của bò Hàn Quốc bằng kỹ thuật PCR .............. 11 3.6. Kỹ thuật điện di trên thạch agarose phân tách gen prion ................................... 12 3.6.1. Kiểm tra sản phẩm PCR ................................................................................... 12 3.6.2. Thạch tinh sạch DNA ....................................................................................... 12 3.7. Tách chiết và tinh sạch DNA ............................................................................... 12 3.8. Sự kết buộc .......................................................................................................... 13 3.9. Biến nạp plasmid vào vi khuẩn E. coli ................................................................ 13 3.10. Chuẩn bị plasmid .............................................................................................. 14 3.11. Giải trình tự ....................................................................................................... 14 CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 15 4.1. Kết quả ................................................................................................................. 15 4.1.1. Khuếch đại gen prion bằng kỹ thuật PCR ........................................................ 15 4.1.2. Tinh sạch đoạn PCR từ sản phẩm PCR ............................................................ 16 4.1.3. Gắn đoạn DNA vào véc tơ pGEM-T easy ........................................................ 17 4.1.4. Biến nạp vào vi khuẩn E. coli ........................................................................... 17 4.1.5. Giải trình tự sản phẩm ...................................................................................... 18 4.2. Thảo luận ............................................................................................................. 18 CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................. 20 5.1. Kết luận................................................................................................................ 20 5.2. Đề nghị ................................................................................................................ 20 TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................... 21 PHỤ LỤC ................................................................................................................... 23 viii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT Amp ampicillin BSE Bovine spongiform encephalopathy (Bệnh viêm não dạng xốp ở bò) bp base pair (cặp base) cDNA complementary deoxyribonucleic acid CJD Creutzfeldt-Jakob disease dNTP deoxynucleoside triphosphate DNA deoxyribonucleic acid E. coli Escherichia coli EDTA ethylen diamine tetraacetic acid EtBr ethidium bromide g gram gDNA genome DNA (bộ gen) Kb kilobase LB Luria-Bertani-medium (môi trƣờng Luria-Bertani) M molar MBM meat and bone meal (bột xƣơng thịt) ml millilitre μl microlitre mM millimolar mRNA messenger ribonucleic acid NCBI National Center for Biotechnology Information Trung tâm thông tin công nghệ sinh học quốc gia OIE The International Office for Epizootic Diseases Văn phòng quốc tế về bệnh dịch PrP prion protein PrPc cellular prion protein PrPSc scrapie-associated prion protein Rpm round per minute (vòng/phút) ix TE Tris-HCl EDTA Tris Tris hydroxymethyl aminomethane TSE Transmissible Spongiform Encephalopathies UV ultraviolet V Volt vCJD variant Creutzfeldt-Jakob disease x DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng A.1: Các bệnh do prion ............................................................................... 23 DANH SÁCH CÁC HÌNH ẢNH HÌNH TRANG Hình 4.1: Gradient PCR ........................................................................................ 15 Hình 4.2: PCR gen prion ....................................................................................... 16 Hình 4.3: Thạch elution (tinh sạch) ...................................................................... 16 Hình 4.4: Sản phẩm sau qúa trình tinh sạch ......................................................... 17 Hình 4.5: Véc tơ pGEMT easy và gen PrP đƣợc cắt bởi EcoR I .......................... 18 Hình B.1: Cấu trúc protein PrP và vị trí đoạn mồi trên gen prion ........................ 24 Hình B.2: Mồi thiết kế cho dòng hoá .................................................................... 24 Hình B.3: Bản đồ của véc tơ pGEMT easy ......................................................... 25 Hình B.4: So sánh trình tự gen prion của bò Hanwoo và dòng bò khác ............... 26 1 CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Trong thời gian gần đây prion trở thành một thuật ngữ rất đƣợc lƣu ý trong giới khoa học. Prion là một tác nhân gây bệnh mới đƣợc chú ý từ khi gây nên bệnh bò điên vào thập niên 1980 tại Anh Quốc. Sau khi trở thành đại dịch trên bò, ngƣời ta còn tìm thấy đƣợc mối liên hệ giữa các tác nhân gây nên bệnh bò điên và bệnh vCDJ ở ngƣời. Trong suốt vài thập kỷ qua, bệnh bò điên đã gây thiệt hại đáng kể cho nền chăn nuôi các nƣớc kể cả các nƣớc có phát hiện đại dịch và các nƣớc nhập khẩu thịt. Các nghiên cứu về prion trong thời gian gần đây rất đƣợc chú ý, trong đó các nhà nghiên cứu chú trọng hơn vào việc tìm hiểu cơ chế gây bệnh của prion. Ngoài ra ngƣời ta còn tìm cách nghiên cứu trên protein của chúng để có thể tìm ra phƣơng thức nhằm xác định bệnh sớm nhất để tránh sự lây lan trên diện rộng có thể xảy ra. Cùng với các nghiên cứu về prion đã và đang đƣợc triển khai trên thế giới, tại phòng thí nghiệm công nghệ di truyền thuộc khoa công nghệ di truyền đại học Sungkyunkwan, Hàn Quốc, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu gen prion của bò Hanwoo (Hàn Quốc). Trong phạm vi đề tài này, nhƣ là bƣớc đầu trong nghiên cứu của chúng tôi về prion, đề tài tiến hành nhân dòng và giải mã trình tự của đoạn gen prion (mã hoá protein prion) nhằm chuẩn bị nguyên liệu cho các nghiên cứu sâu hơn về sau. 1.2. Mục tiêu Tiến hành nhân dòng và giải trình tự gen prion giải mã protein prion ở giống bò Hanwoo (Hàn Quốc). 1.3. Yêu cầu Thiết kế mồi phát hiện gen prion và thực hiện phản ứng PCR Chuyển gen prion vào véc tơ pGEM-T easy, biến nạp véc tơ tái tổ hợp vào vi khuẩn E. coli. Nhân dòng vi khuẩn, thu nhận vector tái tổ hợp và giải trình tự gen 2 CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Prion Prion - đƣợc viết tắt từ thuật ngữ proteinaceous infectious particle (hạt lây nhiễm có bản chất protein) là một tác nhân gây bệnh truyền nhiễm đặc biệt, đƣợc cấu thành từ protein. Bệnh do prion còn đƣợc gọi là các bệnh não dạng xốp truyền nhiễm (Transmissible Spongiform Encephalopathies: TSE) là các bệnh gây thái hóa thần kinh ảnh hƣởng trên cả ngƣời và động vật. Một số bệnh đƣợc liệt kê ở Bảng A.1(Prusiner, 1998). Prion đã đƣợc nghiên cứu cách đây gần một thế kỷ. Vào năm 1930, các nhà khoa học đã nhận thấy tỷ lệ mắc bệnh CJD (Creutzfeldt- Jakob) rất cao ở một số gia đình. Năm 1954 trong khi nghiên cứu bệnh run ngứa trên cừu ở Ireland, Bjorn Sigurdsson đã đƣa ra khái niệm nhiễm vi rút chậm. Sở dĩ nó đƣợc gọi là vi rút chậm vì sau khi lây nhiễm cho vật chủ, các triệu chứng bệnh không biểu hiện nhƣ: không sốt, không có dấu hiệu ung thƣ bạch cầu, không có đáp ứng miễn dịch dịch thể. Ngoài ra khả năng chịu nhiệt và các tác nhân hoá học khác cho thấy rằng prion có bản chất khác bản chất của vi rút. Vào năm 1982, căn cứ vào các nghiên cứu trƣớc đó, Prusiner đã cho rằng có sự tham gia của một loại đại phân tử trong quá trình lây nhiễm và nó có bản chất protein. Trong cùng nghiên cứu đƣợc đăng trên tạp chí Science vào năm 1982, Prusiner đã đặt tên tác nhân này là prion để phân biệt với các tác nhân lây nhiễm từ vi rút và thể vi rút (Prusiner, 1982). Khảo sát trên mRNA của gen prion cho thấy không có sự khác biệt trong trình tự base của dạng bình thƣờng và các mô bị bệnh run ngứa. Điều này cho thấy cấu trúc gen không phải là yếu tố quyết định tính lây nhiễm của prion (Chesebro và ctv, 1985). Gen prion mã hoá protein prion (PrP). Ở động vật có vú, protein prion bình thƣờng (PrPc) là một loại protein màng của tế bào thần kinh và tế bào đệm của não bộ và tuỷ sống, ngoài ra chúng còn xuất hiện trên một vài loại mô ngoại vi và bạch cầu. PrPc vẫn còn một số đặc tính cần đƣợc nghiên cứu thêm (Kang và ctv, 2004). PrPc có thể chuyển sang dạng PrPsc gây bệnh. PrPc đóng vai trò chính trong cách sinh bệnh và truyền lây bệnh, nhƣng dạng đột biến PrPsc lại là thành phần chính của các hạt prion bất thƣờng (Prusiner, 1991). Mặc dù PrPc và PrPsc có cùng trình tự acid amin, chúng 3 có cấu trúc bậc hai khác nhau. Chìa khoá chính để hiểu rõ cơ chế sinh bệnh của prion là ta phải hiểu rõ sự thay đổi cấu trúc bậc hai từ dạng bình thƣờng PrPc (glycoprotein bề mặt tế bào) sang dạng đồng phân gây bệnh PrPsc (Hình B.1.A). Khi khảo sát protein trên các đối tƣợng bị bệnh, ngoại trừ PrPsc đến thời điểm hiện tại, không có một tác nhân đặc hiệu nào khác đƣợc cho là nguyên nhân gây nên các bệnh viêm não dạng xốp. Nên các nhà khoa học khẳng định PrPc là nguyên nhân gây nên bệnh viêm não dạng xốp (Diedrich và ctv, 1993). PrPc có cấu trúc xoắn anpha (khoảng 40%) và một phần nhỏ dạng bê ta, trong khi đó PrPsc gây bệnh lại có ít cấu trúc xoắn alpha (30%) nhiều cấu trúc dạng phiến (khoảng 45%)(Pan và ctv, 1993; Pergami và ctv 1996). Sự khác biệt trong cấu trúc bậc hai làm tăng tính mẫn cảm với proteinase K (PK), và sự khác biệt trong tính hoà tan (Corsaro và ctv, 2002). 2.2. Bệnh não dạng xốp ở bò (BSE) và các bệnh khác có nguyên nhân do prion 2.2.1. Bệnh não dạng xốp ở bò Bệnh não dạng xốp ở bò là một trong những bệnh đáng chú ý nhất trong các loại bệnh do prion gây ra. Sở dĩ bệnh đƣợc gọi là bệnh não dạng xốp vì khi xét nghiệm mô học ngƣời ta thấy có các không bào trong chất xám của não trông giống nhƣ san hô. Bệnh đƣợc gọi là bệnh truyền nhiễm vì chúng có khả năng lây lan trong loài và giữa các loài với nhau (trích Nguyễn Ngọc Tuân, 2002). Sau khi lây nhiễm cho bò, thời gian ủ bệnh trung bình khoảng 5 năm. Đó cũng là lý do bệnh chỉ đƣợc phát hiện sau khi đã trở thành một đại dịch. Ví dụ nhƣ trong trƣờng hợp của Anh, BSE đã lây nhiễm 160.000 đại gia súc và bò sữa trong suốt thập niên 1980 cho đến khi chúng đƣợc quan tâm (Anderson và ctv, 1996). Một vài nghiên cứu đã cho thấy rằng BSE trở thành một đại dịch lớn và lây lan mạnh, nguyên nhân là do các nhà chăn nuôi sử dụng trực tiếp bột thịt xƣơng (MBM) vào khẩu phần ăn của bò sữa (Nathanson và ctv, 1997; Wilesmith và ctv, 1991). Bột thịt xƣơng đƣợc chế biến từ phủ tạng của cừu, bò, heo và gà, phó sản của lò mổ gia súc đƣợc xem nhƣ thức ăn bổ sung giàu đạm. Trong quá trình chế biến MBM đƣợc xử lý ở nhiệt độ thấp, kết quả là các tác nhân gây bệnh không đƣợc phá huỷ hoàn toàn. Thật ra prion có bản chất là protein nên rất khó tiêu diệt bằng các tác nhân vật lý và hoá học. Prion kháng rất 4 mạnh với nhiệt độ, formol, tia cực tím, phần lớn các dung môi nhƣ các chất kiềm, chất tẩy, muối đậm đặc. Prion có khả năng kháng bức xạ gấp 10 lần vi rút, bị biến tính ở 121 o C trong một giờ hoặc 240oC trong 1 phút (trích Nguyễn Ngọc Tuân, 2002). Vì nguyên nhân đó, để phòng tránh nguy cơ của prion, MBM đã bị cấm sử dụng làm thức ăn bổ sung trong chăn nuôi và các nƣớc có gia súc bị lây nhiễm prion đều chọn giải pháp thiêu hủy thú nghi bệnh. Đối với các nƣớc khác, việc cấm nhập khẩu thịt từ các nƣớc có dịch là giải pháp tối ƣu. Sau đợt đại dịch đầu tiên ở Anh Quốc vào năm 1986, BSE đã lan rộng khắp Châu Âu vào năm 2000. Sau đó, đại dịch lan rộng ra các quốc gia khác nhƣ Nhật Bản (2001), Israel (2002), Canada (2003), và tại Hoa Kỳ (2003, chỉ tìm thấy ở bò nhập từ Canada, nên OIE xếp hạng Hoa Kỳ là quốc gia chƣa bị BSE). Ghi nhận đến tháng 2 năm 2005 đã có 189.000 trƣờng hợp lây nhiễm tại 23 quốc gia (không bao gồm Hoa Kỳ). Đến thời điểm cuối năm 2005 vẫn chƣa có trƣờng hợp BSE nào đƣợc ghi nhận ở Hàn Quốc (Tae-Yung Kim và ctv, 2005), tuy nhiên vì khả năng lây nhiễm và nguy hại cho cộng đồng nên BSE vẫn là một nguy cơ đáng đƣợc quan tâm. 2.2.2 Các bệnh khác có nguyên nhân do prion BSE không chỉ là mối nguy cho bò mà còn có tiềm năng gây nguy hiểm cho ngƣời. Ngƣời ta tin rằng có mối liên quan đến BSE, bệnh vCJD (Creutzfeldt-Jakob biến thể) đƣợc phát hiện đầu tiên vào tháng 3 năm 1996 tại Anh Quốc. Khác với CJD thể bình thƣờng, vCJD biến thể lây nhiễm trên các bệnh nhân trẻ (trung bình 29 so với 65 tuổi), thời gian ủ bệnh cũng lâu hơn (14 tháng so với 4 tháng rƣỡi trong trƣờng hợp CJD). Khi quan sát những điểm tƣơng đồng trong các tác nhân gây bệnh vCJD và BSE và sự tƣơng đồng trong cách lây truyền của các tác nhân gây bệnh có thể giúp ta đƣa ra kết luận rằng vCJD và BSE có cùng tác nhân gây bệnh (WHO, 2002). Trong thực tế và thực nghiệm, ngƣời ta quan sát đƣợc prion còn có khả năng gây bệnh trên chuột nhắt, chuột cống, chồn, mèo, cừu, nai, dê và một vài loài linh trƣởng khác (Bảng A.1). 5 2.3. Sự nhân dòng Khoá luận này là bƣớc đầu trong quá trình nghiên cứu của nhóm nghiên cứu tại Hàn Quốc với mục tiêu thực hiện nhân dòng và giải mã đoạn gen của prion trên giống bò Hanwoo (Bos taurus coreanae) của Hàn Quốc. Gen prion đƣợc khuếch đại từ bộ gen (gDNA) của bò Hàn Quốc bởi kỹ thuật PCR nhờ vào 2 đoạn mồi: mồi xuôi và mồi ngƣợc (Hình B.2). Sản phẩm khuếch đại có 651 cặp base (bp) mã hoá 217 acid amin. Sau đó, đoạn gen đƣợc khuếch đại này đƣợc chuyển vào véc tơ pGEM-T easy. Véc tơ chứa đoạn gen mong muốn đƣợc chuyển vào vi khuẩn E. coli. Sản phẩm PrP tái tổ hợp này đƣợc dùng để giải trình tự và là vật liệu cho các nghiên cứu sau này. 2.3.1. Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reacton) Kỹ thuật PCR đƣợc sử dụng để khuếch đại một đoạn DNA đã đƣợc biết trƣớc trình tự. Phản ứng PCR phụ thuộc vào khả năng tách đôi của mạch đơn DNA và bắt cặp bổ sung trong điều kiện thí nghiệm đƣợc kiểm soát (in vitro). Nhân tố thứ hai ảnh hƣởng đến phản ứng PCR là đoạn mồi (primer), đoạn oligonucleotide có độ dài khoảng 18 - 20 base. Hai đoạn mồi này bắt cặp bổ sung với đoạn DNA cần khuếch đại đã đƣợc biến tính. Nhiệt độ ủ bắt cặp từ 50 – 60oC. Đoạn mồi sau khi bắt cặp với DNA mẫu đƣợc tiếp tục kéo dài nhờ vào các deoxynucleotide (dNTPs) và DNA polymerase chịu nhiệt có trong hỗn hợp phản ứng. Enzyme này đƣợc gọi là Taq polymerase, enzyme này vẫn có khả năng giữ hoạt tính ở 95oC trong quá trình duỗi DNA và 72oC trong quá trình kéo dài chuỗi. Khi phản ứng kết thúc, hỗn hợp đƣợc nâng lên 95oC để tách đoạn DNA mạch đôi mới. Sau đó nhiệt độ lại đƣợc hạ thấp xuống và bắt đầu một chu kỳ mới vì các đoạn mồi vẫn còn trong hỗn hợp. Các chu kỳ đƣợc lặp lại sẽ nhanh chóng khuếch đại đoạn gen mong muốn. Ở mỗi chu kỳ, số lƣợng DNA đƣợc tăng gấp đôi. Vì thế trong một thời gian ngắn chỉ khoảng hơn 20 chu kỳ, đoạn DNA mong muốn đƣợc tăng lên hàng triệu lần trong khi đoạn DNA gốc vẫn không đƣợc nhân lên. (Sandy Primrose và ctv, 2004) 6 2.3.2. Kỹ thuật điện di Kỹ thuật điện di không chỉ đƣợc sử dụng trong quá trình phân tích mà còn đƣợc sử dụng cho quá trình tinh sạch DNA. Kỹ thuật điện di thƣờng đƣợc tiến hành trên 2 loại thạch là agarose và polyacrylamide. Agarose thích hợp phân tách DNA có độ dài từ vài trăm base đến 20.000 base. Polyacrylamide thƣờng sử dụng cho các đoạn có kích thƣớc nhỏ hơn. Cơ chế của quá trình dựa trên sự khác biệt về trọng khối phân tử của DNA. Dƣới tác dụng của điện trƣờng, DNA tích điện âm sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dƣơng và xuyên qua các lỗ nhỏ trong thạch. Các phân tử có khối lƣợng nhỏ sẽ di chuyển nhanh hơn và ngƣợc lại. Thạch agarose có cấu trúc mạng phức tạp bao gồm các đại phân tử có kích thƣớc lỗ phụ thuộc vào nồng độ agarose đƣợc sử dụng. Kỹ thuật điện di là kỹ thuật cho phép xác định kích thƣớc đoạn DNA. DNA sẽ đƣợc xuyên qua chất nền đƣợc gọi là gel trong một điện trƣờng. DNA tích điện âm cho nên khi điện di mẫu đƣợc cho vào những giếng gần cực điện âm và DNA sẽ di chuyển về phía cực dƣơng. Sau quá trình điện di trên thạch, các đoạn DNA đƣợc phân tách theo khối lƣợng của chúng. Sự di chuyển tỷ lệ nghịch với kích thƣớc phân tử, DNA có khối lƣợng nhỏ di chuyển nhanh và ngƣợc lại. Các DNA này có thể đƣợc quan sát bằng tia UV sau khi nhuộm bằng các tác nhân nhuộm màu nhƣ EtBr. 2.3.3. Véc tơ plasmid Plasmid là phân tử DNA nằm ngoài nhiễm sắc thể có kích thƣớc biến thiên từ 1 Kb đến hơn 200 Kb. Các plasmid hầu hết là mạch đôi, dạng vòng và có thể tách ra từ vi khuẩn ở dạng siêu xoắn. Vì khả năng có thể nhân đôi với số lƣợng lớn và độc lập với tế bào chủ nên plasmid là vật liệu quan trọng trong công nghệ di truyền. Plasmid đƣợc phát triển từ thập kỷ 1970, đầu thập kỷ các tác nhân chọn lọc nhƣ kanr, ampr, hay terr đƣợc chuyển vào plasmid. Năm 1973, Cohen và cộng sự lần đầu tiên sử dụng plasmid nhƣ là một véc tơ cho quá trình nhân dòng - pSC101. Plasmid đầu tiên mang đầy đủ đặc tính cần thiết cho một véc tơ nhân dòng là plasmid pBR313. Từ năm 1983 đến nay, plasmid đã đƣợc phát triển rất nhiều đặc tính mới: mang các origin và các promoter có nguồn gốc từ thể thực khuẩn, các tác nhân chọn lọc mới, véc tơ plasmid biểu hiện (Brown, 2005). 7 Plasmid có các đặc điểm nhƣ sau : Plasmid có thể tìm thấy ở nhiều loài vi khuẩn, hầu hết các plasmid chỉ có khả năng lây nhiễm trong một số ít vật chủ. Là một DNA nằm ngoài nhiễm sắc thể (NST), có vật chất di truyền ổn định và nhân đôi độc lập với NST tế bào vật chủ. Có rất nhiều cơ chế để ổn định số lƣợng trong tế bào vật chủ. Phụ thuộc vào enzyme và protein tổng hợp từ tế bào chủ trong quá trình sao mã và dịch mã. Thƣờng chứa các enzyme cần thiết cho tế bào chủ. Đặc tính này rất cần thiết cho quá trình chọn lọc plasmid trong công nghệ di truyền nhƣ kháng sinh, phân hủy các hợp chất hữu cơ phức tạp, các enzyme cắt hạn chế và biến đổi. 2.3.4. Sự kết buộc (ligation) Tất cả các tế bào sống đều có khả năng sản sinh DNA ligase, nhƣng enzyme sử dụng trong công nghệ di truyền thƣờng đƣợc tinh sạch từ vi khuẩn E. coli đã bị nhiễm bởi thể thực khuẩn T4. Trong tế bào, enzyme này đó một vai trò rất quan trọng trong quá trình sửa chữa các lỗi trên mạch đôi DNA. Trong thực nghiệm, DNA ligase không chỉ có khả năng sửa chữa các lỗi trên mạch đôi mà còn có khả năng nối các phân tử DNA lại với nhau hoặc hai đầu của cùng một phân tử. T4 DNA ligase là một ligase phổ biến có nguồn gốc từ thể thực khuẩn T4. Nó có khả năng kết buộc mạch đôi của DNA hoặc RNA. Enzyme này có hoạt tính trên cả đầu dính và đầu bằng. Ngoài ra T4 DNA ligase còn có thể sửa chữa, thêm vào những base còn trống trên mạch đôi của DNA, RNA. Quá trình này đòi hỏi phải có ATP. 2.3.5. Biến nạp ở vi khuẩn E. coli Biến nạp vào vi khuẩn E. coli là một bƣớc cần thiết trong bất kỳ thí nghiệm nhân dòng nào, ngƣời ta luôn tìm cách nâng cao khả năng biến nạp của chúng. Mục tiêu là đƣa plasmid vào tế bào chủ nhằm nhân nhanh số lƣợng phục vụ cho nghiên cứu. Nguyên nhân của việc sử dụng E. coli là do chúng có cấu trúc di truyền đơn giản, hơn nữa chúng là đối tƣợng nghiên cứu đƣợc hiểu rõ nhất về sinh hóa cũng nhƣ các thông tin di truyền. Các nghiên cứu đã cho thấy rằng tế bào E. coli và plasmid DNA có khả 8 năng biến nạp cao nhất ở môi trƣờng có ion calci và nhiệt độ thấp (0 – 5oC), và bƣớc sốc nhiệt (37 – 45oC) cũng đóng một vai trò quan trọng. Một vài yếu tố khác nhƣng các ion kim loại ngoài canci cũng có vai trò trong quá trình biến nạp. Trạng thái khả nạp tự nhiên xuất hiện ở một vài loài vi khuẩn khi mà nồng độ chất dinh dƣỡng và hàm lƣợng oxy trong môi trƣờng giảm xuống thấp. Thực tế khi nghiên cứu biến nạp phải tiến hành xử lý tế bào để chúng ở trạng thái khả nạp, có khả năng hấp thu DNA. Để có đƣợc tế bào khả nạp ngƣời ta thƣờng xử lý tế bào bằng các phƣơng pháp vật lý và hóa học. Trong phƣơng pháp hóa học, các tế bào vi khuẩn bình thƣờng sẽ đƣợc xử lý bằng các hóa chất và DNA có thể xâm nhập vào các lỗ trên màng tế bào. Hoá chất quan trọng nhất trong phƣơng pháp hoá học là CaCl2. Quá trình biến nạp sử dụng tế bào khả nạp đƣợc chia thành hai bƣớc chính : Xử lý với CaCl2: biến tế bào E. coli bình thƣờng thành tế bào khả nạp. Sốc nhiệt: tạo sự mất cân bằng nhiệt bên trong và bên ngoài màng tế bào khiến DNA có thể dễ dàng xâm nhập vào tế bào. 2.3.6. Chọn lọc vi khuẩn đã đƣợc biến nạp Vì môi trƣờng nuôi cấy có chứa các tác nhân kháng sinh nên chỉ có những khuẩn lạc có sự hiện diện của vec tơ mới có gen tổng hợp kháng sinh và tồn tại trên môi trƣờng kháng sinh. Tuy nhiên, các véc tơ này có thể mang gen mong muốn hoặc tự đóng vòng. Để nhận biết đƣợc, chúng ta cần sử dụng thêm một phƣơng pháp nhận biết khác nhƣ : - PCR: sau khi tách plasmid của những khuẩn lạc tồn tại đƣợc trên môi trƣờng có chứa kháng sinh, thực hiện phản ứng PCR với các primer của gen chèn. Sau đó điện di để kiểm tra kết quả. - Xác định thể biến nạp có mang plasmid tái tổ hợp bằng phƣơng pháp lai khuẩn lạc. - Sử dụng enzyme cắt plasmid để xác định sự hiện diện của gen chèn. - Sử dụng phƣơng pháp α-complementation. Sự hoạt động của enzyme -galactosidase dễ dàng nhận biết trong môi trƣờng dinh dƣỡng có 5-bromo-4-chloro- 3-indolyl- -D-galactoside (Xgal). Hợp chất này không màu nhƣng khi bị cắt sẽ có màu 9 xanh. Trên môi trƣờng đặc, những khuẩn lạc có -galactosidase hoạt động sẽ có màu xanh trong khi những khuẩn lạc không có -galactosidase có màu trắng. Vì Xgal không có khả năng hoạt hoá -galactosidase, isopropyl- -D-thiogalactoside (IPTG) đƣợc cho vào môi trƣờng. -galactosidase đƣợc tổng hợp bởi gene lacZ. Với các véc tơ có đoạn chèn, gene lacZ sẽ bị cắt và không có khả năng tổng hợp -galactosidase nên có màu trắng. Các véc tơ tự đóng vòng hoặc nối véc tơ – véc tơ gene lacZ hoạt động làm khuẩn lạc có màu xanh (Lodisd và ctv, 2000) . 2.3.7. Giải trình tự Có 2 phƣơng pháp chính đƣợc sử dụng để giải trình tự DNA. 2.3.7.1 . Phƣơng pháp Sanger và Coulson Yêu cầu mạch đơn DNA và phân tử DNA đƣợc giải mã thƣờng đƣợc nhân dòng từ véc tơ M13. Nguyên tắc của phản ứng là dideoxynucleotide (ddNTP) đƣợc cho vào để nối dài mạch DNA, ddNTP có thể gắn vào mạch nhƣng không có khả năng kéo dài mạch do không có đƣờng ở đầu 3’. Các nhóm ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP lần lƣợt đƣợc phản ứng và có thể dễ dàng đọc trình tự bằng máy chụp phóng xạ 2.3.7.2 . Phƣơng pháp Maxam – Gilbert (Phân giải DNA) Để thực hiện phƣơng pháp Maxam – Gilbert đòi hỏi phải có DNA mạch đôi, do đó véc tơ M13 không cần phải sử dụng. Nguyên tắc của phƣơng pháp là cắt đoạn DNA có sử dụng các hoá chất để đánh dấu. 2.3.7.3 . Giải trình tự bằng hệ thống tự động Nguyên tắc chung của máy giải trình tự gene tự động dựa trên cơ sở phƣơng pháp Sanger và Coulson. Máy đọc trình tự cả trên hai mạch đơn, do vậy có thể phát hiện và giảm các nhầm lẫn do kỹ thuật. Giải trình tự theo phƣơng pháp tự động sử dụng các chất huỳnh quang để đánh dấu DNA, và đƣợc đọc bằng các đầu dò của máy dựa vào độ dài bƣớc sóng khác nhau. 10 CHƢƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 1 năm 2006 đến tháng 6 năm 2006 tại phòng thí nghiệm Công Nghệ Di Truyền, khoa Công Nghệ Di Truyền trƣờng Đại học Sungkyunkwan, Suwon, Hàn Quốc. 3.2. Vật liệu Gen prion đƣợc sử dụng có nguồn gốc từ giống bò Hanwoo, đƣợc cung cấp bởi viện Nông Nghiệp, thuộc Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn Hàn Quốc. Quá trình ly trích và tinh sạch bộ gen của bò đƣợc thực hiện bởi anh Kim Yong Hwan, phòng thí nghiệm Công Nghệ Di Truyền, khoa Công Nghệ Di Truyền trƣờng Đại học Sungkyunkwan. 3.3. Dụng cụ và hoá chất 3.3.1 Dụng cụ Micropipette Máy luân nhiệt Máy điện di ngang Máy đọc kết quả điện di bằng tia UV Máy ly tâm thƣờng và ly tâm lạnh Nồi hấp cách thủy 16 oC và 42 oC Tủ mát (4oC), tủ âm (-20oC) và âm sâu (-80oC) Nồi hấp Tủ sấy Lò vi sóng Cân điện tử Máy đo pH Buồng cấy vi khuẩn Máy vortex Máy khuấy từ Máy ủ và máy ủ lắc 3.3.2 Hóa chất 11 agarose type VII ampicillin D-(+)-glucose EDTA ethanol ethidium Bromide glacial acetic acid glucose glycerol IPTG isopropanol methanol màng nylon Mg2SO4 NaOH potassium acetate sodium acetate sodium chloride SDS tryptone X-gal 3.3.3. Các dung dịch EtBr: 10 mg/ml in H2O giữ trong môi trƣờng tránh ánh sáng, 4ºC TE : 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0 Môi trƣờng LB: 170 mM NaCl; 0,5% (w/v) dịch chiết nấm nem và 1% (w/v) peptone, pH 7,5 TAE: 50X TAE (Tris-Acetate-EDTA); 242 g Tris base; 57,1 ml acetic acid và 100 ml EDTA 0,,5 M Thêm nƣớc cất 2 lần sao cho dung dịch vừa đủ 1 lít và pH = 8,5. 3.4. Mồi PCR Mồi PCR đƣợc sử dụng để khuếch đại đoạn gen prion là đoạn oligonucleotide đƣợc thiết kế dựa theo trình tự đã đƣợc nghiên cứu và ấn bản trên Trung tâm Thông tin Công nghệ sinh học quốc gia Hoa Kỳ (NCBI), Ngân hàng gen NM_181015. Trình tự đoạn mồi đƣợc trình bày ở Hình B.2. Mồi đƣợc tổng hợp bởi công ty COSMO và kiểm tra bằng chƣơng trình DNAstart. 3.5. Khuếch đại gen prion từ bộ gen của bò Hàn Quốc bằng kỹ thuật PCR Kỹ thuật PCR đƣợc sử dụng để khuếch đại đoạn gen prion bằng cách sử dụng đoạn mồi đặc hiệu. Hỗn hợp phản ứng bao gồm 10 μl chứa 10 pM mồi xuôi và mồi 12 ngƣợc; 100 ng gDNA; 0,4 mM dNTPs; 10X dung dịch đệm PCR, 5 đơn vị Super Taq DNA polymerase (Super-Bio, Seoul, Hàn Quốc); 25 mM Mg2SO4 Quá trình chuẩn hoá phản ứng PCR đƣợc thực hiện bằng gradient PCR với nhiệt độ bắt cặp từ 55 - 60oC. Phản ứng khuếch đại bao gồm biến tính ở 95oC trong 3 phút; theo sau đó là 30 chu kỳ gồm biến tính 94oC trong 45 giây, ủ bắt cặp ở 58oC trong 30 giây, và kéo dài ở 72oC trong 30 giây; và cuối cùng là một chu kỳ kéo duỗi ở 72oC trong 3 phút. 3.6. Kỹ thuật điện di trên thạch agarose phân tách gen prion 3.6.1. Kiểm tra sản phẩm PCR Sản phẩm PCR đƣợc điện di trên thạch agarose 0.8%. Dung dịch mẫu bao gồm 5 μl DNA xét nghiệm, 1 μl dung dịch đệm 6X, và thang chuẩn 1 Kb (GeneRulerTM, Fermentas, Co.) đƣợc sử dụng để xác định độ dài của đoạn gen đƣợc khuếch đại. Điều kiện của phản ứng điện di là 100V trong 30 phút. Gel điện di sau đó đƣợc nhuộm với ethidium bromide (EtBr) và đặt trên máy lắc trong 30 phút. Sản phẩm sau khi nhuộm đƣợc quan sát bằng đèn UV. 3.6.2. Thạch tinh sạch DNA Để làm thạch tinh sạch DNA, thạch agarose 0,8% đƣợc cho thêm 2,5 μl EtBr trong quá trình làm nguội. Sau khi cho DNA đã đƣợc trộn với dung dịch đệm 6X và thang chuẩn cho vào giếng, tiến hành điện di ở 80V trong 10 phút sau đó tăng lên 120V trong 25 phút. 3.7. Tách chiết và tinh sạch DNA DNA đƣợc tách bằng kỹ thuật điện di. Dƣới đèn UV ta có thể nhận biết đƣợc phần DNA mong muốn, DNA này sau đó đƣợc cắt ra khỏi gel sao cho lấy đƣợc hết lƣợng DNA tuy nhiên dính càng ít gel càng tốt. Sau đó, đoạn gel đƣợc tách rửa sử dụng bộ Kit QUAquick Gel Extraction (Qiagene) theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất và đƣợc trình bày ở qui trình C.I. 13 Để kiểm tra kết quả sau quá trình tách DNA, 2 μl sản phẩm đƣợc trộn với 3 μl 1X dung dịch đệm TAE và 1 μl dung dịch đệm 6X, điện di trong thạch agarose 0,8%, dùng thang chuẩn 1 Kb. 3.8. Sự kết buộc DNA đƣợc buộc vào véc tơ pGEM-T easy (Promega, Madison, WI, U.S.A.) bằng enzyme ligase T4 (Promega). Véc tơ pGEM-T easy đƣợc trình bày ở Hình B.3. Hỗn hợp chứa 1 μl véc tơ pGEM-T easy, 4 μl đoạn DNA cần chèn vào, 5 μl buffer 2X, 1 μl ligase (T4). Phản ứng xảy ra ở nhiệt độ 16oC trong 1 giờ hoặc 4oC qua đêm. Sau quá trình kết buộc, 2 μl sản phẩm đƣợc kiểm tra bằng điện di trong thạch agarose 0,8%, phần còn lại đƣợc dùng để chuyển vào vi khuẩn E. coli DH5α. 3.9. Biến nạp plasmid vào vi khuẩn E. coli Plasmid tái tổ hợp đƣợc chuyển vào tế bào E. coli khả biến DH5α để tiến hành nhân dòng. E. coli sử dụng cho quá trình biến nạp là chủng E. coli khả nạp DH5α. Véc tơ pGEM-T easy đã đƣợc gắn đoạn gen prion đƣợc chuyển vào DH5α. Để nâng cao hiệu suất của quá trình biến nạp 5 μl plasmid đƣợc trộn chung với 100 μl E. coli và đƣợc tiến hành biến nạp trong CaCl2 (Sambrook, Russell et al. 2002). Hỗn hợp đƣợc lắc nhẹ và đặt vào nƣớc đá trong 30 phút. Sau đó, huyền phù đƣợc sốc nhiệt trong bồn nƣớc ở 42oC trong 90 giây. Cuối cùng huyễn dịch đƣợc đặt lại trong nƣớc đá khoảng 2 phút để sốc lạnh. Sau đó 1ml môi trƣờng LB đƣợc cho vào ống chứa sản phẩm và nuôi cấy trong máy ủ lắc ở 37oC trong 90 phút. Dung dịch nuôi cấy sau đó đƣợc ly tâm 12000 rpm trong 1 phút. Bỏ phần nổi và thêm 100 μl nƣớc tinh khiết vào ống eppendorf. Sau đó vortex để hoà tan tủa với nƣớc cất hai lần, dung dịch này sau đó đƣợc dàn lên đĩa LB-Amp+. Để có thể chọn đƣợc véc tơ tái tổ hợp, cho thêm vào mỗi đĩa LB 20 μl X-gal và 34 μl IPTG. Các đĩa này đƣợc ủ ở 37oC trong một đêm... 14 3.10. Chuẩn bị plasmid Chọn các khuẩn lạc có màu trắng (khuẩn lạc có chứa plasmid tái tổ hợp) và tiếp tục nuôi cấy trong môi trƣờng LB lỏng (5 ml LB và 5 μl Amp+) ở 37oC trong 12 giờ bằng máy ủ lắc. Sau quá trình nuôi cấy, 700 μl sản phẩm đƣợc trộn với 300 μl glycerol trữ âm ở -80oC để phục vụ cho các thí nghiệm sau. Phần còn lại đƣợc dùng vào việc chuẩn bị plasmid. Phƣơng pháp tách chiết sử dụng theo Kit tinh sạch plasmid (LaboPassTM) đƣợc trình bày rõ hơn ở qui trình C.II. 3.11. Giải trình tự Trƣớc khi mẫu đƣợc gởi đến công ty Macrogen để giải trình tự, DNA tinh khiết đƣợc cắt bởi EcoR I để kiểm tra plasmid có chứa đúng gen mong muốn hay không. Việc xác định trình tự DNA đƣợc thực hiện bởi công ty Macrogen, sử dụng phƣơng pháp tự động bằng máy giải mã trình tự gen. 15 CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 . KẾT QUẢ 4.1.1. Khuếch đại gen prion bằng kỹ thuật PCR Để khuếch đại đƣợc gen prion từ bộ gen DNA của bò Hanwoo, các đoạn mồi đƣợc thiết kế đặc hiệu dựa trên trình tự gen prion (GeneBank số NM_181015). Kết quả gradient PCR cho thấy phổ của nhiệt độ ủ bắt cặp của mồi rất rộng, trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng nhiệt độ bắt cặp ở 58oC (Hình 4.1). Hình 4.1: Gradient PCR. Băng M: Thang chuẩn DNA 1Kb , 1: Sản phẩm PCR của gen prion 650 bp ở 55 oC, 2: Sản phẩm PCR của gen prion 650 bp ở 60 oC, 3: Sản phẩm PCR của gen prion 650 bp ở 59 oC, 4: Sản phẩm PCR của gen prion 650 bp ở 60 oC, 5: Sản phẩm PCR của gen prion 650 bp ở 61 oC, 6: Sản phẩm PCR của gen prion 650 bp ở 62 oC, 7: Sản phẩm PCR của gen prion 650 bp ở 63 oC, 8: Sản phẩm PCR của gen prion 650 bp ở 64 oC. Đoạn gen prion đã đƣợc khuếch đại thành công (Hình 4.2). Trọng lƣợng phân tử của sản phẩm PCR vào khoảng 650 bp. 16 Hình 4.2: Sản phẩm PCR của gen prion M: Thang chuẩn DNA 1 Kb; 1: Sản phẩm PCR của gen prion 650 bp ở 58 oC 4.1.2. Tinh sạch đoạn DNA từ sản phẩm PCR Sản phẩm PCR đƣợc cho vào giếng của thạch tinh sạch và có kết quả nhƣ Hình 4.3. Hình 4.3 : Thạch tinh sạch DNA M: Thang chuẩn DNA 1 Kb, 1: Sản phẩm PCR của gen prion 650 bp ở 58 oC 17 Sau đó DNA đƣợc tinh sạch bằng bộ kit QIAquick Gel Extraction. DNA tinh khiết đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp điện di với thạch agarose 0,8% (Hình 4.4), sản phẩm thu đƣợc sử dụng cho bƣớc tiếp theo. Hình 4.4: Sản phẩm sau tinh sạch M: Thang chuẩn DNA 1 Kb, 1: Sản phẩm sau quá trình tinh sạch sản phẩm PCR của gen prion 4.1.3. Gắn đoạn DNA vào véc tơ pGEM-T easy Sau khi tinh sạch đoạn PrP thành công, đoạn DNA đƣợc gắn vào véc tơ pGEM-T easy (Real Biotech Corp). 4.1.4. Biến nạp vào vi khuẩn E. coli Véc tơ tái tổ hợp đã đƣợc biến nạp thành công vào vi khuẩn E. coli. Sau quá trình nuôi cấy và thu hoạch các khuẩn lạc, véc tơ tái tổ hợp đƣợc tinh sạch từ vi khuẩn bằng tinh sạch plasmid. Véc tơ pGEM-T easy có chứa gen prion đƣợc cắt bởi EcoR I và đƣợc ghi nhận ở hình 4.5. Theo đó ta thấy véc tơ tái tổ hợp đã bị enzyme EcoR I cắt tại 2 vị trí tạo thành 2 vạch trên thạch điện di. Vạch đầu tiên 3 Kbp là véc tơ pGEM-T easy ở dạng thẳng, vạch thứ hai khoảng 650 bp là gen prion. 18 Hình 4.5: Véc tơ pGEM-T easy + gen prion đƣợc cắt bởi EcoRI M: Thang chuẩn DNA 1 Kb; 1: véc tơ pGEM-T easy 3,6 Kbp + gen prion không cắt; 2: véc tơ pGEM-T easy dạng thẳng 3 Kbp và gen prion 650 bp 4.1.5. Giải trình tự sản phẩm Kết quả giải trình tự đƣợc trình bày ở Hình B.4. Kết quả cho thấy trình tự base và acid amin của prion bò Hàn Quốc giống 99% trình tự prion của giống bò ở châu Âu, chỉ khác nhau ở hai cặp base. 4.2. THẢO LUẬN Chúng tôi đã thành công việc nhân dòng và giải trình tự gen prion. Trƣớc khi tiến hành giải trình tự chúng tôi đã cắt plasmid tái tổ hợp bằng emzyme cắt EcoR I. Kết quả cho thấy đoạn gen có kích thƣớc khoảng 650 bp bằng kích thƣớc mong muốn. Plasmid tái tổ hợp sau đó đƣợc gởi đến công ty Macrogen để giải trình tự. Kết quả đƣợc trình bày ở Hình B.4. Theo kết quả trên ta thấy trình tự giống nhau đến 99% chỉ có 2 bp khác biệt ở vị trí 162 và 580 sau khi dịch mã sang acid amin ta thấy không có sự khác biệt, có thể xem sự sai khác của các base không ảnh hƣởng đến gen prion vì không làm thay đổi trình tự chuỗi polypeptide quy định cấu trúc protein. Theo chúng tôi sự sai khác này xảy ra có thể do các yếu tố không thể kiểm soát đƣợc trong quá trình thí nghiệm khi thực hiện các kỹ thuật nhƣ PCR, ligase, giải trình tự. Điều này nên đƣợc khảo sát kỹ hơn trong các thí 19 nghiệm sau. Từ đó chúng tôi cho rằng cấu trúc gen prion của bò Hàn Quốc và bò Châu Âu không khác nhau. Trên thế giới, việc nhân dòng prion khá phổ biến và đã thành công ở hầu hết các nghiên cứu. Tuy nhiên chúng tôi vẫn thực hiện nhân dòng vì một số lý do. Trƣớc hết để làm nguyên liệu cho các nghiên cứu về sau. Hơn nữa, việc nhân dòng và giải trình tự thành công còn cho thấy sự giống nhau của bò Hanwoo và các dòng bò khác, điều này khẳng định khả năng lây nhiễm prion từ các dòng khác cho bò Hanwoo là hoàn toàn có thể xảy ra. Việc nhân dòng thành công gen prion này tạo cơ sở và nguyên liệu cho các nghiên cứu xa hơn về cấu trúc protein. Gen prion đƣợc chèn trong véc tơ pGEM-T easy tái tổ hợp và đƣợc trữ lạnh ở -80oC. Trong quá trình nghiên cứu, plasmid tái tổ hợp đƣợc sử dụng nhƣ là nguồn gen nguyên liệu thay vì phải trực tiếp tiến hành PCR để thu đƣợc đoạn gen mong muốn. 20 CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Sau thời gian thực hiện, chúng tôi đã thành công trong việc nhân dòng gen prion. Gen prion có 651 bp mã hoá 217 acid amin. Trình tự gen prion của bò Hawoo Hàn Quốc giống với giống bò khác châu Âu. Véc tơ tái tổ hợp đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α thành công và đƣợc giữ lạnh ở -80oC. 5.2. Đề nghị - Thực hiện lại quá trình nhân dòng để kiểm tra kỹ sự khác biệt trình tự gen prion giữa bò Hanwoo của Hàn Quốc và bò châu Âu. - Trữ giống và cấy chuyển sau một thời gian trữ lạnh để đảm bảo hoạt lực của vi khuẩn. - Dùng sản phẩm tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về protein. 21 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Nguyễn Bá Sửu. 2004; Từ điển giải thích thuật ngữ Công nghệ sinh học lương thực và nông nghiệp; Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ Thuật, 304 trang Nguyễn Ngọc Tuân. 2002; Vệ sinh thịt; Nhà xuất bản Nông Nghiệp, trang 163-200 TIẾNG ANH Anderson R. M., Donnelly C. A., Ferguson N. M., Woolhouse M. E. J., Watt C. J., Udy H. J., MaWhinney S., Dunstan S. P., Southwood T. R. E., Wilesmith J. W., et al., 1996; Transmission dynamics and epidemiology of BSE in British cattle; Nature (London) 382: 779–788. Brown T. A., 2005; Gene cloning and DNA analysis; 4 th edition; Blackwell Pusblishing; p: 123-210. Corsaro A., Thellung S., Russo C., Villa V., Arena S., D'Adamo MC., Paludi D., Rossi Principe D., Damonte G., Benatti U., Aceto A., Tagliavini F., Schettini G., Florio T., 2002; Expression in E. coli and purification of recombinant fragments of wild type and mutant human prion protein; Neurochem Int., 41(1):55-63. Chesebro B., Race R., Wehrly K., Nishio J., Bloom M.,Lechner D., Bergstrom S., Robbins K., Mayer L., Keith J. M., et al., 1985; Identification of scrapie prion protein-specific mRNA in scrapie-infected and uninfected brain Nature (London) 315: 331–333. Diedrich J. F., Carp R. I. & Haase A. T., 1993; Increased expression of heat shock protein, transferrin, and beta 2-microglobulin in astrocytes during scrapie; Microb. Pathog.15: 1–6. Kang San-Gyun, Sung Keun Kang, Deog-Yong Lee, Yong-Ho Pack, Woo-Suk Hwan, and Han-Sang Yoo; 2004; Cloning, sequencing, and expression for DNA encoding bovine prion protein; J.Microbiol. Biotechnol. 14(2): 417-421 Lodish, Berk, Zipursky, Matsudaira, Baltimore, Darnell, 2000; Molercular cell biology; 4 th edition; Freeman Publishing; p: 375-377; 580-612 Nathanson N., Wilesmith J. & Griot C., 1997; A new variant of Creutzfeld-Jakob disease; Am. J. Epidemiol. 145: 959–969. 22 Pan K.-M., Baldwin, M., Nguyen J., Gasset M., Serban A.,Groth D., Mehlhorn I., Huang Z., Fletterick R. J., Cohen F. E. & Prusiner, S. B., 1993; Conversion of alpha- helices into beta-sheets features in the formation of the scrapie prion proteins Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 10962–10966. Pergami P., Jaffe H. & Safar J., 1996; Semipreparative chromatographic method to purify the normal cellular isoform of the prion protein in nondenatured form; Anal. Biochem. 236: 63–73 Prusiner S. B. 1982; Novel Proteinaceous Infectious Particles Cause Scrapie; Sciene; 216: 136–144. Prusiner, 1998; Prion; Pro. Nalt. Acad. Sci. USA Vol. 95: 13363-13383. Prusiner, 2004; Prion biology and diseases 2 nd Ed, CSHL press: 1-87. Prusiner, 1991; Molecular biology of prion diseases Science 252: 1515–1522 Sambrook J. G., Russell R., et al., 2002; Fugu orthologues of human major histocompatibility complex genes: a genome survey; Immunogenetics 54(6): 367- 80. Sandy Primrose, Sandy Primrose, Richard Twyman and Bob Old, 2004; Principle of Gene Manipulation; 4 th edition; Blackwell Pusblishing; p: 319 Kim T. Y., Kim Y. S., Kim J. K., Shon H. J., Lee Y. H., Kang C. B., Park J. S., Kang K. S. and Lee Y. S., 2005; Rist analysis of BSE in Korea; J.Vet. Med. Sin. 67(8): 743- 752. Wilesmith J. W., Ryan J. B. M. & Atkinson M. J.; 1991; Bovine spongiform encephalopathy: epidemiological studies on the origin; Vet.Rec. 128: 199–203. 23 PHỤ LỤC PHỤ LỤC A Bảng A.1. Các bệnh do prion Kuru Ngƣời tiền sử Lây nhiễm do tục lệ ăn thịt ngƣời iCJD Ngƣời Lây nhiễm do prion vCJD Ngƣời Lây nhiễm do prion từ bò? fCJD Ngƣời Đột biến trong giai đoạn phôi ở gen prion GSS Ngƣời Đột biến trong giai đoạn phôi ở gen prion FFI Ngƣời Đột biến trong giai đoạn phôi ở gen prion (D178N, M129) sCJD Ngƣời Đột biến tế bào sinh dƣỡng hoặc do chuyển đổi cấu trúc PrPc thành PrPSc? FSI Ngƣời Đột biến tế bào sinh dƣỡng hoặc do chuyển đổi cấu trúc PrPc thành PrPSc? Scrapie Cừu Thƣờng gây bệnh di truyền trên cừu BSE Bò Lây nhiễm do prion có trong MBM TME Chồn Lây nhiễm do prion từ bò hoặc cừu CWD La, hƣơu,nai Không rõ FSE Mèo Lây nhiễm do prion có trong mô bò hoặc MBM Exotic ungulate Greater kudu, Cảm nhiễm do prion gây bệnh từ MBM Encephalopathy nyala, oryx iCJD, iatrogenic CJD; vCJD, variant CJD; fCJD, familial CJD; sCJD, sporadic CJD; GSS, Gerstmann–Stra¨ussler–Sheinker disease; FFI, fatal familial insomnia; FSI, fatal sporadic insomnia; BSE, bovine spongiform encephalopathy; TME, transmissible mink encephalopathy; CWD, chronic wasting disease; FSE, feline spongiform encephalopathy; HGH, human growth hormone; MBM, meat and bone meal. Bệnh Vật chủ Cơ chế gây bệnh 24 PHỤ LỤC B A B Hình B.1: Cấu trúc protein PrP và vị trí của đoạn mồi trên gen prion A: Cấu trúc của polypeptide PrP, protein PrPc và PrPsc; B: vị trí đoạn mồi trên gen prion. Bo-F : 5’- aag aag cga cca aaa cct gga gga – 3’ K K R P K P G G Bo-R : 5’ - tgc ccc tcg ttg gta ata agc ctg – 3’ Q A Y Y Q R G A Hình B.2: Các đoạn mồi đƣợc thiết kế cho dòng hoá 25 Hình B.3: Bản đồ gen và các vị trí cắt của véc tơ pGEM-T easy 26 Hình B.4: Phân tích trình tự gen prion của bò Hanwoo và dòng bò của châu Âu Ori : Bò châu Âu, 58: Gen prion của bò Hanwoo, PCR ở 58oC; 64: Gen prion của bò Hanwoo, PCR ở 64oC và consensus: so sánh trình tự 27 PHỤ LỤC C C.I. Qui trình C.I: QIAquick Kit ly trích DNA từ thạch agarose 1. Cắt đoạn DNA từ thạch agarose với dao sạch và bén. Chú ý cắt càng nhỏ càng tốt sao cho không dính phần agarose không cần thiết. 2. Bỏ vào tube và cân miếng thạch vừa đƣợc cắt. Thêm 3 đơn vị dung dịch đệm QG vào 1 đơn vị thạch (100 mg = 100 µl) Ví dụ: Thêm thêm 300 µl dung dịch đệm QG vào mỗi 100 µl thạch 3. Ủ ở 500C trong vòng 10 phút cho đến khi thạch tan hoàn toàn. Để tăng khả năng tan của thạch, vortex mỗi 2 - 3 phút trong suốt quá trình ủ. 4. Sau quá trình ủ, thạch phải tan hoàn toàn và có màu vàng nhạt (cùng màu với dung dịch đệm QG khi chƣa có thạch). 5. Thêm 1 đơn vị isopropanol vào mẫu và trộn. Ví dụ: nếu mẫu thạch agarose có khối lƣợng 100 mg, thêm 100 µl isopropanol. Bƣớc này có thể ảnh hƣởng lên DNA có chiều dài dƣới 500 bp hoặc trên 4 Kbp, đối với mẫu nằm giữa hai độ dài trên thì ảnh hƣởng không đáng kể. Cần chú ý không ly tâm trong suốt quá trình này. 6. Đặt cột quay QIAquick vào tube thu DNA 2 ml. 7. Để thu nhận DNA, cho mẫu vào cột quay và thực hiện ly tâm ở 12000 vòng/phút (rpm) trong 1 phút. Tối đa chỉ có thể cho 800 µl vào một cột quay, đối với mẫu nhiều hơn phải ly tâm thêm 1 lần. 8. Bỏ phần dung dịch và đặt cột quay QIAquick trở lại tube thu DNA 9. (Không bắt buộc) thêm 0,5 ml dung dịch đệm QG vào cột quay và ly tâm ở 12000 rpm trong 1 phút. Bƣớc này sẽ loại bỏ tất cả agarose. Bƣớc này chỉ bắt buộc khi DNA đƣợc sử dụng trực tiếp cho việc giải trình tự, dịch mã in vitro hoặc vi tiêm. 10. Để rửa sạch isopropanol, thêm 0,75 ml dung dịch đệm PE vào cột quay QIAquick và ly tâm ở 12000 rpm trong 1 phút. Chú ý: Nếu DNA sẽ đƣợc sử dụng cho ứng dụng nhạy với muối, nhƣ kết buộc với đầu bằng và giải trình tự trực tiếp, để yên cột trong vòng 2-5 phút và thêm dung dịch đệm PE trƣớc khi ly tâm. 28 11. Đổ bỏ phần dịch nổi và ly tâm cột QIAquick thêm 1 phút ở tốc độ trên 10000 rpm Chú ý: ethanol trong dung dịch đệm PE sẽ không đƣợc loại bỏ hoàn toàn nếu không đổ bỏ phần dịch nổi trƣớc khi ly tâm. 12. Đặt cột QIAquick vào tube sạch 1,5ml 13. Để hoà tan DNA, thêm 20 µl dung dịch đệm EB (10 mM Tris-Cl, pH 8,5) hoặc nƣớc vào giữa màng QIAquick và ly tâm trong 1 phút ở tốc độ tối đa. Để tăng nồng độ DNA, thêm 30 µl dung dịch hoà tan vào giữa màng QIAquick và để yên trong khoảng 1 phút trƣớc khi tiến hành ly tâm. Chú ý: chắc chắn rằng dung dịch hoà tan đƣợc cho vào trực tiếp lên màng cột QIAquick để DNA có thể bám vào. Trung bình lƣợng hoà tan thu đƣợc là 48 µl từ 50 µl dung dịch hoà tan hoặc 28 µl từ 30 µl. Hiệu quả của quá trình tinh sạch phụ thuộc vào pH. Quá trình này hoạt động tốt nhất ở pH từ 7,0 đến 8,5. Khi sử dụng nƣớc, đảm bảo rằng pH phải đƣợc ổn định, và không nên trữ lạnh ở -20oC vì có thể làm thái hoá DNA khi không có một số tác nhân trong dung dịch đệm. DNA tinh khiết có thể hoà tan trong TE (10 mM Tris-Cl; 1 mM EDTA, pH 8,0) tuy nhiên EDTA có thể làm mất hoạt tính của phản ứng enzyme. 29 C.II. Qui trình C.II: Chuẩn bị plasmid (Phƣơng pháp kiềm) 1. Chuyển khuẩn lạc vào 5 ml môi trƣờng LB có chứa chất kháng sinh thích hợp. Ủ mẫu để nuôi cấy ở 37oC qua đêm trong máy ủ lắc. 2. Cho 1,5 ml dịch nuôi cấy vào tube. Ly tâm ở 12000 rpm trong 30 giây ở 4oC. 3. Loại bỏ phần nổi, làm khô phần tủa càng khô càng tốt. 4. Cho vào phần tủa 100 µl dung dịch 1 đƣợc giữ lạnh và vortex mạnh. 5. Thêm 200 µl dung dịch 2 vừa đƣợc chuẩn bị. Trộn hỗn hợp bằng cách đảo nhanh tube 5 lần. 6. Thêm 150µl dung dịch 3 đƣợc giữ lạnh. Trộn hỗn hợp bằng cách đảo nhanh tube 5 lần. Để tube trong vòng 3-5 phút. 7. Ly tâm ở 12000 rpm trong 15 phút ở 4oC. Chuyển phần dịch nổi sang tube mới. 8. Kết tủa DNA bằng 2 phần EtOH, vortex. Bỏ hỗn hợp vào trữ lạnh ở -20oC trong 20 phút. 9. Ly tâm ở 12000 rpm trong 15 phút ở 4oC. 10. Nhẹ nhàng loại bỏ phần dịch nổi, để yên tube, mở nắp và đậy bằng giấy thấm cho đến khi tube khô hoàn toàn. 11. Rửa DNA với 1ml EtOH ở 4oC. Loại bỏ phần dịch nổi nhƣ ở bƣớc 10, để phẩn kết tủa trong không khí cho đến khi không còn mùi cồn (thƣờng 10 phút). 12. Hoà tan DNA với 50µl TE hoặc nƣớc cất, vortex. Dung dịch 1 50 mM đƣờng glucose 25 mM Tris-Cl (pH 8,0) 10 mM EDTA (pH 8,0) Dung dịch 2 0,2N NaOH 1% SDS Dung dịch 3 5M potassium acetate 60 ml glacial acetic acid 11,5 ml H2O 28,5 ml