Nguyên nhân có hạt trở lại của quả bưởi năm roi [Citrus grandis (L.) OBS. CV. "Nam roi"] - Lê Văn Bé

51 32(1): 51-56 Tạp chí Sinh học 3-2010 NGUYÊN NHÂN Có Hạt TRở LạI CủA QUả BƯởI NĂM ROI [CITRUS GRANDIS (L.) Obs. cv. ‘NAM ROI’] LÊ VĂN Bé, NGUYễN VĂN KHA Tr−ờng đại học Cần Thơ Cây ăn quả không hạt hoặc hạt lép đ−ợc xem nh− là một đặc điểm quý của giống. B−ởi Năm Roi [Citrus grandis (L.) Obs. cv. Nam Roi] là giống b−ởi ngon nổi tiếng, không hạt có nguồn gốc ở huyện Bình Minh, tỉnh Vĩnh Long. Theo thống kê, tổng diện tích trồng giống b−ởi này tại tỉnh này khoảng 3.000 ha. Hầu hết quả b−ởi Năm Roi đ−ợc tiêu thụ trong n−ớc và một phần xuất khẩu sang thị tr−ờng châu Âu với tổng th−ơng phẩm khoảng 600 tấn vào năm 2005. Tuy nhiên, trong những năm gần đây, quả b−ởi Năm Roi có nhiều hạt xuất hiện trong quả. Hiện t−ợng này làm giảm giá trị của quả và gây khó khăn cho nhà xuất khẩu. Kết quả điều tra cho thấy có khoảng 95% v−ờn b−ởi Năm Roi đ−ợc trồng xen với các loại cây cam quýt khác đều xuất hiện hạt [14]. Về hình dạng quả bên ngoài của quả, ng−ời trồng và th−ơng lái khó lòng phân biệt đ−ợc quả có hạt và quả không hạt [11]. Hiện t−ợng xuất hiện nhiều hạt này cũng xảy ra với giống b−ởi Da Xanh và nguyên nhân đ−ợc cho rằng do thụ phấn chéo [1]. Trên một số giống b−ởi không hạt nh−ng khi thụ phấn chéo thì có nhiều hạt, số hạt/quả thông th−ờng khoảng 100 [10]. Hiện t−ợng bất thụ của cam quýt tạo quả không hạt có 3 tr−ờng hợp: đực bất dục, cái bất dục và tự bất t−ơng hợp. ống phấn không kéo dài trong vòi nhuỵ, do vậy không có sự thụ tinh mặc dù có sự thụ phấn. Sự kéo dài ống phấn liên quan đến hoạt động của enzim PME (pectin methylesterase) [3]. Sự kéo dài ống phấn phụ thuộc vào sự hình thành vách tế bào của ống phấn. Ngay tại chóp của ống phấn, hiện diện duy nhất là chất pectin mà không thấy có xen-lu-lô hoặc ca-lô trong điều kiện bình th−ờng [7]. Khi có mặt enzim PME thì nhóm cac-bô-xin sẽ liên kết với can-xi làm cho vách tế bào của ống phấn trở nên dày hơn bất th−ờng. Kết quả là ống phấn không kéo dài đ−ợc trên vòi nhụy. Enzim này có nhiều trong hạt phấn, ống phấn của cây thuốc lá mà không thấy có mặt trong các bộ phận khác và nó đ−ợc tổng hợp bởi gien NtPPME1 [3]. Tuy vậy, cho đến nay, ch−a có nghiên cứu nào công bố nguyên nhân của hiện t−ợng quả b−ởi Năm Roi không hạt cũng nh− có hạt. Đây cũng là mục tiêu nghiên cứu của công trình này. I. PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU 1. Khảo sát cấu tạo của hoa b−ởi Năm Roi Vào sáng sớm, thu ngẫu nhiên 30 hoa b−ởi ‘Năm Roi’ có một cánh hoa vừa nở; các hoa này đ−ợc thu về phòng thí nghiệm để đếm số bao phấn/hoa. Tách lấy tất cả các bao phấn của hoa, gieo vào môi tr−ờng dinh d−ỡng [4], 30 lần lập lại, mỗi lần lập lại là 1 hoa, để trong tối ở nhiệt độ phòng thí nghiệm. Hạt phấn đ−ợc đếm 24 giờ sau khi gieo, mỗi hoa đếm 5 lần, mỗi lần quan sát bằng 3 thị tr−ờng vật kính 10X. Bầu noun đ−ợc cắt thành lát mỏng để đếm số tiểu noun/bầu noun bằng kính lúp Olympus SZX9. 2. Khảo sát sự v−ơn dài của ống phấn trên hoa b−ởi Năm Roi tự thụ và thụ phấn chéo Chọn ngẫu nhiên 2 chùm hoa/cây, tỉa bỏ các hoa khác chừa lại 2 hoa/chùm, 5 lần lập lại, mỗi lần lập lại là một cây. Thí nghiệm bao gồm 4 nghiệm thức là hoa b−ởi Năm Roi tự thụ, b−ởi Năm Roi x b−ởi Lông, b−ởi Năm Roi x Da Xanh và b−ởi Năm Roi x cam Sành. Khi các hoa có kích th−ớc tối đa (cánh hoa ch−a mở), tiến hành khử đực, bao lại. Sáng hôm sau, chọn các bao phấn vừa hé mở của giống b−ởi Lông (giống b−ởi có nhiều hạt) thụ chéo trên n−ớm của hoa b−ởi Năm Roi đu khử đực bằng tay, bao lại. T−ơng tự nh− vậy với tr−ờng hợp hoa b−ởi Năm Roi tự thụ. Bộ phận cái của hoa b−ởi Năm Roi sau 3 ngày thụ phấn đ−ợc cắt ra thành 4 đoạn nhỏ: n−ớm, vòi đoạn trên, vòi đoạn d−ới và bầu 52 noun. Quan sát sự v−ơn dài của ống phấn bằng cách nhuộm với a-ni-lin xanh 0,1% [9]. Để quan sát sự v−ơn dài của ống phấn, cần cố định mẫu trong ống nhựa bằng dung dịch cố định: axit a- xê-tic/ê-ta-nôn theo tỷ lệ (1: 3) ít nhất trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng thí nghiệm. Chuyển mẫu đu cố định sang 70% ê-ta-nôn và để 10 phút trong phòng thí nghiệm. Làm tuần tự nh− vậy đối với ê-ta-nôn 50% và 30%. Rửa với n−ớc cất vài lần sau mỗi công đoạn. Chuyển mẫu cẩn thận qua đĩa péc-tric chứa dung dịch an-ka-lin 8 M NaOH. Đậy nắp lại, để qua đêm tại phòng thí nghiệm. Rửa mẫu bằng n−ớc cất rất cẩn thận vì nó rất mềm. Tại giai đoạn này, mẫu rất sạch và trắng. Để mẫu 10 phút ở phòng thí nghiệm. Chuyển mẫu sang dung dịch 0,1% (trọng l−ợng/thể tích) a-ni-lin xanh trong 108 mM K3PO4 (pH = 11) ít nhất trong 2 giờ và đặt trong tối của phòng thí nghiệm. Không cần rửa mẫu khi giai đoạn nhuộm chấm dứt. Đặt mẫu cẩn thận trên lam và đậy lại bằng la-men, tránh có bọt. Bầu noun có thể bị tách ra do sự đè nén của la-men. Quan sát d−ới ánh sáng có b−ớc sóng ngắn UV 330-385 nm, bằng kính Olympus BX40. 3. Tỷ lệ đậu quả, rụng quả non và số hạt/quả trên hoa b−ởi Năm Roi tự thụ và thụ phấn chéo Thí nghiệm này đ−ợc tiến hành t−ơng tự nh− thí nghiệm quan sát sự v−ơn dài của ống phấn. Chọn ngẫu nhiên 2 chùm hoa/cây, tỉa bỏ các hoa khác chỉ chừa lại 2 hoa/chùm, lập lại 5 lần, mỗi lần lập lại là một cây. Ghi nhận tỷ lệ đậu quả và rụng quả non mỗi tuần 1 lần, liên tục đến 60 ngày sau khi đậu quả. Quả đ−ợc thu ở tất cả các nghiệm thức sau 6-7 tháng. Đếm số hạt/quả. II. KếT QUả Và THảO LUậN 1. Khảo sát cấu tạo của hoa b−ởi Năm Roi Quan sát cho thấy, hoa b−ởi Năm Roi là hoa l−ỡng tính với n−ớm nhụy cái −ớt lúc hoa nở và sẵn sàng nhận phấn. Trung bình có khoảng 30 bao phấn/hoa, mỗi bao phấn chứa nhiều hạt phấn; mỗi bầu noun có khoảng 150 tiểu noun (hình 1). Hạt phấn của giống b−ởi này có tỷ lệ nẩy mầm khá cao trong môi tr−ờng nuôi hạt phấn, trung bình khoảng 33 ± 1,45%, 40 ± 0,84% b−ởi Da Xanh (Citrus grandis cv. ‘Da Xanh’) thấp hơn so với hạt phấn của b−ởi Lông (giống b−ởi có hạt - Citrus grandis cv. ‘Long’) nh−ng cao hơn hạt phấn của cam Sành [giống cam ít hạt - Citrus nobilis (Lour.)] có ý nghĩa thống kê bằng kiểm định Student (P < 0,05) (bảng 1). Kết quả khảo sát cấu tạo hoa của b−ởi Năm Roi cho thấy, hoa có cấu trúc nh− loại hoa l−ỡng tính hoàn chỉnh, có bộ phận đực và cái đầy đủ. Hơn nữa, hạt phấn nẩy mầm khá tốt trong môi tr−ờng in vitro. Tính bất thụ trên cây cam quýt tạo quả không hạt có 3 tr−ờng hợp: đực bất dục, cái bất dục và tự bất t−ơng hợp [10]. Tr−ờng hợp đực bất dục thông th−ờng tạo quả ít hạt hoặc không hạt nh−ng hai tr−ờng hợp còn lại sẽ cho ra quả có hạt nếu có sự thụ phấn chéo. Câu hỏi đặt ra là b−ởi Năm Roi tạo quả không hạt hoặc quả có hạt theo cách nào? Để trả lời câu hỏi này chúng tôi khảo sát sự v−ơn dài của ống phấn khi tự thụ và thụ phấn chéo. Bảng 1 Tỷ lệ nẩy mầm trung bình của hạt phấn b−ởi Năm Roi, b−ởi Lông và cam Sành trong môi tr−ờng nhân tạo, sau khi gieo Tỷ lệ nẩy mầm (%) Loại hạt phấn Cao nhất Thấp nhất Trung bình ± sai số chuẩn B−ởi Năm Roi 50 15 33 ± 1,45 c (*) B−ởi Da Xanh 50 29 40 ± 0,84 b B−ởi Lông 96 25 56 ± 3,64 a Cam Sành 30 3 13 ± 1,39 d Ghi chú: (*). Các số trung bình theo sau những chữ khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê bằng kiểm định so sánh cặp Student test (P < 0,05). 2. Khảo sát sự v−ơn dài của ống phấn trên bộ phận cái của hoa b−ởi Năm Roi Bằng kỹ thuật nhuộm ống phấn, sự v−ơn dài của ống phấn trên bộ phận cái của hoa b−ởi 53 Năm Roi đ−ợc −ớc l−ợng 3 ngày sau khi thụ phấn d−ới kính hiển vi huỳnh quang. Kết quả cho thấy các tổ hợp lai giữa b−ởi Năm Roi với hạt phấn của b−ởi Lông hoặc hạt phấn của b−ởi Da Xanh có ống phấn kéo dài từ n−ớm đến vòi và cuối cùng là bầu noun (bảng 2). Ng−ợc lại, b−ởi Năm Roi tự thụ thì hạt phấn nẩy mầm trên n−ớm, kéo dài ống phấn đến vòi đoạn trên nh−ng không thấy sự hiện diện của ống phấn tại vị trí vòi đoạn d−ới cũng nh− bầu noun. Những quan sát này cho thấy b−ởi Năm Roi tạo quả không hạt là do sự tự bất dung hợp điều khiển, có thụ phấn nh−ng không thụ tinh. Sự kéo dài của ống phấn của cây Lilium formosarum Wall. và Nicotiana tabacum L. liên quan đến hoạt động của enzim PME (pectin methylesterase). Khi thêm PME ngoại sinh thì ức chế sự kéo dài ống phấn của hai loài cây này [3]. Ng−ợc lại, các giống b−ởi không hạt nh−ng khi thụ phấn chéo xảy ra thì tạo ra quả nhiều hạt [10]. Cây quýt (Citrus reticulata Blanco) khi tự thụ sau 72 giờ, ống phấn chỉ tiến đến vòi, tích lũy ca-lô và dừng tại đó, không đến đ−ợc bầu noun. Các giống b−ởi Chùm tự thụ tốt nh−ng khi thụ phấn chéo với hạt phấn khác thì ống phấn phát triển nhanh hơn ống phấn tự thụ [5]. Ngoài các cây thuộc họ cam quýt (Rutaceae), cây Arabidopsis thaliana (L.) Heynh tạo quả mà không cần thụ tinh [13]. Bảng 2 Ước l−ợng số ống phấn v−ơn dài trên bộ phận cái của hoa b−ởi Năm Roi, 3 ngày sau thụ phấn N−ớm Vòi đoạn trên Vòi đoạn d−ới Bầu noãn Tổ hợp lai Số OP Số QS Số OP Số QS Số OP Số QS Số OP Số QS B−ởi Năm Roi x b−ởi Lông 3.117 ± 612 48 1.142 ± 385 41 136 ± 44(*) 32 117 ± 52 33 B−ởi Năm Roi x b−ởi Da Xanh 3.050 ± 549 42 1.215 ± 460 41 215 ± 124 31 190 ± 56 32 B−ởi Năm Roi tự thụ 2.335 ± 442 28 426 ± 50 27 0 ± 0 24 0 ± 0 24 Ghi chú: (*) ± Độ lệch chuẩn; OP. ống phấn; QS. quan sát. Tr−ờng hợp thụ phấn chéo với b−ởi Lông và b−ởi Da Xanh, ống phấn kéo dài vào bầu noun của b−ởi Năm Roi (hình 2). Ng−ợc lại, khi tự thụ thì ống phấn chỉ kéo dài đến vòi nhụy cái và không thấy có nó trong bầu noun. Từ những quan sát này cho thấy hạt phấn của b−ởi Năm Roi rơi trên n−ớm và nẩy mầm tức là có quá trình thụ phấn nh−ng không có sự thụ tinh. Tr−ờng hợp này th−ờng gặp trên các loại cây cam quýt [8]. Nguyên nhân có thể là do hoạt động của enzim PME [3] hoặc có thể là do sự tích lũy ca-lô của ống phấn làm cho ống phấn không kéo dài đ−ợc. 3. Tỷ lệ đậu quả, rụng quả non và số hạt/quả trên hoa b−ởi Năm Roi tự thụ và thụ phấn chéo Tỷ lệ đậu quả, rụng quả non và số hạt/quả của hoa b−ởi Năm Roi thụ phấn chéo với các hạt phấn khác (b−ởi Lông, b−ởi Da Xanh, cam Sành) và tự thụ, đ−ợc trình bày ở bảng 3. Tỷ lệ đậu quả trên hoa b−ởi Năm Roi ở tr−ờng hợp tự thụ và thụ phấn chéo khác biệt nhau không có ý nghĩa. Tuy nhiên, tỷ lệ rụng quả non ở tr−ờng hợp hoa b−ởi Năm Roi thụ phấn chéo lại thấp hơn có ý nghĩa so với hoa b−ởi Năm Roi tự thụ. Những nghiên cứu tr−ớc đây cho rằng, trên hoa b−ởi thụ phấn chéo sẽ làm giảm tỷ lệ rụng quả non từ đó có thể sẽ gia tăng năng suất quả vì quá trình thụ phấn sẽ làm tăng nồng độ GA3 và giảm đi sự rụng bầu noun [2, 8]. Quả b−ởi Năm Roi có hạt là do thụ phấn chéo với hạt phấn của các cây cam quýt khác. Kết quả phần trên cho thấy ống phấn kéo dài vào bầu noun và xảy ra sự thụ tinh tạo ra quả có hạt. Ví dụ tr−ờng hợp lai với hạt phấn của hoa b−ởi Lông nhận đ−ợc trung bình 114 hạt/quả; t−ơng tự nh− vậy, khi lai với hạt phấn của các cây cam quýt khác (bảng 3). Trong khi đó, b−ởi Năm Roi tự thụ phấn thì hoàn toàn không hạt. Trong nghiên cứu khác, b−ởi Năm Roi tự thụ, thụ phấn chéo với hạt phấn của b−ởi Da Xanh và cam Sành tuần tự thu đ−ợc 0 hạt/quả, 113 hạt/quả và 50 hạt/quả [12]. Tổ hợp lai giữa hai giống quýt ‘Clementines’ và ‘Afourer’ cho quả có 23-32 hạt/quả [6]. 54 A B C D Hình 1. Cấu tạo của hoa b−ởi Năm Roi A. Hoa hoàn chỉnh lúc nở, có bộ phận đực và cái; B. bao phấn to chứa nhiều hạt phấn; C. hạt phấn nẩy mầm sau 24 giờ (40X); D. bầu noun có nhiều tiểu noun. Hình 2. Quan sát ống phấn v−ơn dài trong bộ phận cái của hoa b−ởi Năm Roi A. hoa cái cắt dọc; B, C và D. n−ớm, vòi, bầu noun tự thụ, ống phấn kéo dài đến vòi; E, F và G. n−ớm, vòi, bầu noun lai với phấn của b−ởi Lông; H, I và J. ống phấn hiện diện ở 3 vị trí lai với phấn của b−ởi Da Xanh. Mũi tên chỉ vị trí của ống phấn. A B C Hình 3. B−ởi Năm Roi có hạt và không hạt sau 8 tuần thụ phấn A. B−ởi Năm Roi thụ phấn chéo với b−ởi Da Xanh; B. b−ởi Năm Roi thụ phấn chéo với b−ởi Lông; C. B−ởi Năm Roi tự thụ. C 1 #m A 1 mm B 20 àm D 10 àm G 10 àm F 10 àm E 10 àm H 10 àm I 10 àm J 10 àm C 10 àm 55 Bảng 3 Tỷ lệ đậu quả, rụng quả non và số hạt/quả trên hoa b−ởi Năm Roi tự thụ và thụ phấn chéo Nghiệm thức Tỷ lệ đậu quả (%)(1) Tỷ lệ rụng quả non (%)(2) Số hạt/quả B−ởi Năm Roi tự thụ phấn 68 80 a (*) 0 c B−ởi Năm Roi khử đực 70 80 a 0 c B−ởi Năm Roi x b−ởi Lông 80 50 b 114 a B−ởi Năm Roi x cam Sành 70 68 ab 94 a B−ởi Năm Roi tự nhiên 88 70 ab 57 b B−ởi Năm Roi x b−ởi Da Xanh 90 13 c 115 a CV (%) 35 39 32 F ns * * Ghi chú: (*). Các số trung bình theo sau những chữ khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê bằng kiểm định Duncan (P < 0,05); (1). 7 ngày sau khi thụ phấn; (2). 2 tháng sau khi đậu quả. III. KếT LUậN Nguyên nhân gây ra quả b−ởi Năm Roi có hạt là do sự thụ phấn chéo. Khi hạt phấn của các cây cam quýt khác (b−ởi Lông, b−ởi Da Xanh, cam Sành) rơi trên n−ớm nhụy cái, ống phấn kéo dài đến bầu noun, xảy ra thụ tinh tạo quả có nhiều hạt. Ng−ợc lại, hạt phấn của chính nó nẩy mầm trên n−ớm nh−ng không kéo dài đến bầu noun, không xảy ra sự thụ tinh tạo quả không hạt. TàI LIệU THAM KHảO 1. Báo Cần Thơ, 2008: Số ra ngày 08/01/2008 2. Ben-Cheikh W. et al., 1997: Plant Physiology, 114:557-564. 3. Bosch M. et al., 2005: Plant Physiology., 138: 1334-1346. 4. Brewbaker J. L. and Kwack B. H., 1963: Am. J. Bot., 50: 859-865. 5. Chacoff N. P. and Aizen M. A., 2007: Crop Science., 47: 1143-1150. 6. Chao C. C. T., 2005: HortScience., 40(2): 362-365. 7. Ferguson C. et al., 1998: Planta., 206: 452- 460. 8. Karaya R. K., 1988: In: NI Vavilova, 178: 10-13. 9. Martin F. W., 1959: Stain Technol., 34: 125-128. 10. Ollitrault P. et al., 2007: Seedlessness and ploidy manipulations. In: Khan I. A., 2007. Citrus Genetics, Breeding and Biotechnology: 197-218, CABI. 11. Phan Thị Bé, 2004: Khảo sát sự đa dạng đặc tính của hạt b−ởi ‘Năm Roi’ theo hình thái và điện di. Luận văn thạc sĩ khoa học Nông Học, Đại học Cần Thơ. 12. Tran Van Hau, S. L. Binh, 2008: Effect of hand-pollination by itself and other citrus pollens on seed production and fruit quality of ‘Nam Roi’ pomelo (Citrus maxima L.). In: Abstract of Third Mini-symposium: Valuable fruit trees in the Mekong Delta: improving field performance, yield, quality and processing. Can Tho university, Vietnam. 13. Vivian-Smith A. et al., 2001: Development., 128: 2321-2331. 14. Võ Văn Theo, 2004: Hiện trạng sản xuất và tính đa dạng di truyền b−ởi ‘Năm Roi’ tại huyện Bình Minh, Vĩnh Long. Luận văn thạc sĩ khoa học Nông Học, tr−ờng đại học Cần Thơ. 56 CAUSE OF SEEDED FRUIT OF NAM ROI POMMELO (CITRUS GRANDIS (L.) Obs. cv. ‘NAM ROI’) LE VAN BE, NGUYEN VAN KHA SUMMARY ‘Nam Roi’ pommelo is the seedless cultivar, high quality at the Mekong Delta. Nevertheless, fruits of the cultivar have many seeds in the practical production. Causing seeds of the fruit is vestigated in the study. Flower of the cultivar is a hermaphrodite, which has a wet stigma on opening time, average 30 anthers/flower, 150 ovules/ovary. Moreover, their pollens germinated average 33% in vitro condition, comparing 40% of ‘Da Xanh’ pommelo (Citrus grandis cv. ‘Da Xanh’) and 56% of ‘Long’ pommelo (Citrus grandis cv. ‘Long’), and 13% of ‘cam Sanh’ [Citrus nobilis (Lour.)]. Pollen tubes growth of self-pollination hand of the cultivar were stained by aniline blue and observed them UV fluorescence microscopy, in which there were 2,335 pollen tube growth in stigma, 426 in upper style but their absence in lower style as well as in ovule. On the contrary to, when using pollen of ‘Long’ pommelo took cross pollination with ‘Nam Roi’, pollen tube growth reached to 3,177 in stigma, 1,142 in upper style, 136 in lower style and 117 in ovary. Number of seeds of cross pollination of ‘Nam Roi’ received 114 seeds/fruit while their self pollination was absolutely absent. Basing on the results, it can be considered that seedless ‘Nam Roi’ is self-incompactible fertilization. The seeded fruit of ‘Nam Roi’ is caused by cross pollination. Key word: seed, seedlessness, pollen tube, ‘Nam Roi’ pommelo. Ngày nhận bài: 16-6-2008