Nguồn carbon và cách xử lý

Nguyeân lieäu Nguoàn carbon vaø caùch xöû lyù Baõ mía Röûa saïch, phôi khoâ 2-3 ngaøy. Sau ñoù caét nhoû, xay, cho qua raây 0,1 vaø 0,05 laáy phaàn treân raây 0,05mm. Rôm Xöû lyù gioáng nhö baõ mía. Muøn cöa Do kích thöôùc muøn cöa nhoû neân ta chæ caàn phôi khoâ vaø raây ñeå löïa choïn kích thöôùc hôïp lyù. Nguyeân lieäu sau khi raây ñöôïc ngaâm trong dung dòch NaOH 1% vôùi tæ leä 1:10 trong 2 giôø. Sau ñoù haáp tieät truøng ôû 1210C, 1at trong 15 phuùt. Loïc röûa nguyeân lieäu baèng nöôùc caát ñeán khi dung dòch röûa trung tính (pH=7). Keá ñeán ta vaét kieät vaø saáy khoâ ôû 60-700C. Hoùa chaát söû duïng NaOH 1% duøng ñeå xöû lyù nguyeân lieäu. NaOH 1N chænh pH HCl 1N chænh pH DNS NaCl 1% NaNO3 KCl FeSO4.7H2O MgSO4.7H2O K2HPO4.3H2O Pepton Agar Saccharose Conggo ñoû Dung dòch ñeäm photphat 0.5 M Duïng cuï thí nghieäm Maùy ño pH Maùy so maøu Maùy laéc Caân Tuû saáy, tuû aám vaø tuû laïnh. Beå ñieàu nhieät Caùc loaïi moâi tröôøng söû duïng Moâi tröôøng carrot-potato: Thaønh phaàn moâi tröôøng: Khoai taây: 2% Caø roát: 2% Agar: 2% CMC: 1% Nöôùc caát Ñaàu tieân khoai taây vaø caø roát laùt moûng sau ñoù naáu 1 giôø trong ½ löôïng nöôùc caát, loïc laáy dòch loïc. Caùc thaønh phaàn khaùc ñöôïc naáu trong löôïng nöôùc caát coøn laïi ñeán khi tan hoaøn toaøn. Troän 2 thaønh phaàn laïi vaø tieät truøng ôû 1210C trong 15 phuùt. Moâi tröôøng carrot-potato ñöôïc duøng ñeå giöõ gioáng naám moác. Moâi tröôøng Czapek (Dox) (CZ) - Czapek stock solution A 50ml - Czapek stock solution B 50ml - Nöôùc caát: 900ml Thaønh phaàn A: NaNO3 40g KCl 10g MgSO4.7H2O 10g FeSO4.7H2O 0.2g Nöôùc caát: 1000ml Thaønh phaàn B: K2HPO4 20g Nöôùc caát: 1000ml Moâi tröôøng A vaø B ñöôïc tröõ laïnh. Moâi tröôøng CZ duøng ñeå nuoâi caáy naám moác trong moâi tröôøng loûng. Moâi tröôøng malt Moâi tröôøng naøy ñöôïc söû duïng laøm moâi tröôøng ñeå naám moác sinh tröôûng vaø phaùt trieån taïo baøo töû. Töø ñoù ta coù theå laáy baøo töû ñeå nuoâi caáy trong moâi tröôøng loûng thu nhaän enzym. Phöông phaùp caáy chuyeàn vaø giöõ gioáng Moâi tröôøng ñöôïc chuaån bò ñoå vaøo oáng nghieäm (khoaûng ¼ oáng nghieäm), tieät truøng ôû 1210C trong 15 phuùt. Sau ñoù ñeå nghieâng 450 cho ñeán khi thaïch ñoâng. Duøng que caáy nhoïn caáy naám moác töø oáng gioáng sang moâi tröôøng thaïch nghieâng. Ñeå ôû 30-400C trong tuû aám töø 5 ngaøy. Sau ñoù baûo quaûn laïnh <40C. Phöông phaùp nuoâi caáy naám moác taïo enzym Moâi tröôøng söû duïng ôû ñaây laø moâi tröôøng CZ. Cho 100ml moâi tröôøng vaøo erlen 250 ml, sau ñoù ñem tieät truøng. Duøng 10ml nöôùc caát voâ khuaån cho vaøo oáng gioáng tröôûng thaønh. Sau ñoù laéc ñeå rôi baøo töû naám moác. Huùt 1ml cho vaøo moâi tröôøng nuoâi caáy. Sau ñoù moâi tröôøng nuoâi caáy ñöôïc ñeå treân maùy laéc 200 voøng/phuùt, nhieät ñoä moâi tröôøng. Ôû ñaây ta nuoâi caáy theo phöông phaùp nuoâi caáy chìm neân vieäc laéc ñöôïc tieán haønh lieân tuïc nhaèm muïc ñích hoøa tan oxy vaøo moâi tröôøng taïo ñieàu kieän cho naám moác phaùt trieån. Phöông phaùp nghieân cöùu Trình töï tieán haønh thí nghieäm Böôùc 1: Choïn loaøi naám moác sinh toång hôïp enzym cellulase vôùi hoaït tính cao nhaát. Ta khaûo saùt 9 loaøi: A.Niger, A.awamori, A.aculactum, A oryzae, T.konigii, T.hazianum, T.viride, P.citrinum, Rhizopus sp. Böôùc 2: Khaûo saùt söï aûnh höôûng cuûa nguoàn carbon ñeán khaû naêng sinh toång hôïp enzym cellulase cuûa naám moác. Böôùc 3: Khaûo saùt söï aûnh höôûng cuûa nguoàn nitô ñeán khaû naêng sinh toång hôïp enzym cellulase cuûa naám moác. Böôùc 4: Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa pH moâi tröôøng nuoâi caáy ñeán khaû naêng sinh toång hôïp enzym cuûa naám moác. Böôùc 5: Khaûo saùt söï aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä ñeán hoaït tính enzym cellulase. Böôùc 6: Khaûo saùt söï aûnh höôûng cuûa pH ñeán hoaït tính enzym cellulase. Böôùc 7: Thöû öùng duïng enzym cellulase thuûy phaân cô chaát rôm. Thuyeát minh quaù trình thí nghieäm Böôùc 1: Choïn loaøi naám moác sinh toång hôïp enzym cellulase vôùi hoaït tính cao nhaát Trong böôùc naøy ta tieán haønh 2 thí nghieäm. Thí nghieäm 1: 9 loaøi naám moác A.Niger, A.awamori, A.aculactum, A oryzae, T.konigii, T.hazianum, T.viride, P.citrinum, Rhizopus sp. ñöôïc nuoâi trong moâi tröôøng sinh toång hôïp enzym nhö trong phaàn 3.3 vôùi nguoàn carbon laø CMC 1% coù boå sung pepton 0,5%. Sau thôøi gian 48 giôø, ta laáy moät ít dòch töø moâi tröôøng loûng ñem loïc voâ truøng vaø tieán haønh xaùc ñònh hoaït tính nhö trong phaàn 3.5.1. Ñaây laø phöông phaùp thöû nhanh ñeå choïn loaøi naám moác coù hoaït tính enzym, sau ñoù ta caàn duøng phöông phaùp khaùc ñeå choïn ra loaøi coù hoaït tính enzym cellulase cao nhaát. Thí nghieäm 2: töø nhöõng loaøi ñaõ choïn trong thí nghieäm 1 ta tieáp tuïc nuoâi trong moâi tröôøng sinh toång hôïp enzym nhö trong thí nghieäm 1. Sau moãi ngaøy ta laáy moät ít dòch trong moâi tröôøng ñem loïc voâ truøng, sau ñoù tieán haønh xaùc ñònh hoaït tính enzym CMCase theo phöông phaùp ño löôïng ñöôøng khöû taïo thaønh. Choïn ra loaøi naám moác coù hoaït tính enzym cao nhaát. Thí nghieäm ñöôïc tieán haønh trong 5 ngaøy. Böôùc 2: Khaûo saùt söï aûnh höôûng cuûa nguoàn carbon ñeán khaû naêng sinh toång hôïp enzym cellulase cuûa naám moác. Thí nghieäm 3: Vôùi loaøi naám moác ñaõ choïn ôû thí nghieäm 2, ta tieáp tuïc nuoâi caáy trong moâi tröôøng 3.3. Ta khaûo saùt ôû 3 nguoàn carbon laø baõ mía, muøn cöa vaø rôm vôùi haøm löôïng 1%. Nguoàn nitô boå sung laø pepton 0,5%. Sau 4 ngaøy ño hoaït tính CMCase. Sau ñoù ta choïn nguoàn carbon coù hoaït tính CMCase cao nhaát. Thí nghieäm 4: vôùi nguoàn carbon ñaõ choïn ôû thí nghieäm 3, tieán haønh nuoâi caáy gioáng nhö treân ôû caùc haøm löôïng nguoàn carbon laø 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5. Löôïng pepton boå sung laø 0,5%. Thôøi gian ño hoaït tính CMCase laø 4 ngaøy. Choïn ra haøm löôïng nguoàn carbon toát nhaát. Böôùc 3: Khaûo saùt söï aûnh höôûng cuûa nguoàn nitô ñeán khaû naêng sinh toång hôïp enzym cellulase cuûa naám moác. Thí nghieäm 5: Nuoâi caáy naám moác trong moâi tröôøng ôû phaàn 2.6 vôùi nguoàn carbon vaø haøm löôïng ñaõ choïn ôû thí nghieäm treân. Ta thay ñoåi nguoàn nitô boå sung vaøo moâi tröôøng. ÔÛ ñaây ta tieán haønh 3 maãu: 1 maãu boå sung pepton, 1 maãu boå sung yeast extract vaø 1 maãu khoâng boå sung caû 2 thaønh phaàn treân. Haøm löôïng boå sung laø 0,5%. Keát quaû ño hoaït tính CMCase sau thôøi gian laø 4 ngaøy. Choïn ra nguoàn boå sung cho hoaït tính enzym cao nhaát. Thí nghieäm 6: muïc ñích laø xaùc ñònh haøm löôïng nguoàn nitô boå sung cho hoaït tính enzym cao nhaát. Ta söû duïng nguoàn nitô naøy boå sung vaøo moâi tröôøng nuoâi caáy vôùi haøm löôïng 0,1; 0,3; 0,5; 0,7; 0,9%. Sau 4 ngaøy ño hoaït tính CMCase choïn ra haøm löôïng toát nhaát. Böôùc 4: Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa pH moâi tröôøng nuoâi caáy ñeán khaû naêng sinh toång hôïp enzym cuûa naám moác. Thí nghieäm 7: Söû duïng caùc ñieàu kieän toái öu nhö trong caùc thí nghieäm treân, nhöng moâi tröôøng nuoâi caáy ñöôïc ñieàu chænh ôû caùc pH= 3, 4, 5, 7, 8. ÔÛ ñaây ta duøng NaOH vaø HCl ñeå chænh pH. Thí nghieäm ñöôïc khaûo saùt trong khoaûng thôøi gian 7 ngaøy. Sau moãi ngaøy ta ñeàu laáy dòch loïc ñeå ño hoaït tính CMCase. Choïn pH toái öu vaø thôøi gian toái öu töông öùng vôùi pH ñoù. Böôùc 5: Khaûo saùt söï aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä ñeán hoaït tính enzym cellulase Thí nghieäm 8: Nhieät ñoä ôû ñaây khoâng phaûi laø nhieät ñoä nuoâi caáy maø laø nhieät ñoä trong phöông phaùp xaùc ñònh hoaït tính enzym CMCase. Moâi tröôøng nuoâi caáy söû duïng taát caû caùc ñieàu kieän toái öu treân. Khi xaùc ñònh hoaït tính CMCase ta ñeå enzym taùc duïng ôû caùc nhieät ñoä 40, 45, 50, 55, 60. Choïn ra nhieät ñoä toái öu cho enzym cellulase. Böôùc 6: Khaûo saùt söï aûnh höôûng cuûa pH ñeán hoaït tính enzym cellulase. Thí nghieäm 9: söû duïng taát caû caùc ñieàu kieän toái öu treân. Ño hoaït tính CMCase vôùi caùc giaù trò pH 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0 ( duøng dung dòch ñeäm photphat). Choïn giaù trò pH toái öu. Böôùc 7: Thöû öùng duïng enzym cellulase thuûy phaân cô chaát rôm. Thí nghieäm 10: cô chaát ôû ñaây ñaõ ñöôïc tieàn xöû lyù tröôùc. Vôùi caùc ñieàu kieän toái öu ñaõ khaûo saùt ôû treân, ta nuoâi caáy naám moác sau ñoù loïc laáy dòch loïc ñem thuûy phaân cô chaát rôm. Caùch tieán haønh gioáng nhö trong phöông phaùp xaùc ñònh hoaït tính CMCase nhöng thay nguoàn cô chaát CMC 1% baèng rôm vôùi 3 haøm löôïng khaûo saùt laø 5%, 10% vaø 20% (w/v). Heä soá thuûy phaân A ñöôïc tính baèng tæ soá löôïng ñöôøng taïo thaønh khi duøng 1ml dòch moâi tröôøng nuoâi caáy ñeå thuûy phaân cô chaát trong thôøi gian 1h treân löôïng cô chaát söû duïng ñeå thuûy phaân. Heä soá naøy ñöôïc tính ra %. Trình töï tieán haønh xaùc ñònh hoaït tính enzym cellulase[18] Phöông phaùp thöû nhanh baèng caùch ño ñöôøng kính voøng thuûy phaân Nguyeân lyù: khi enzym taùc duïng leân cellulose trong moâi tröôøng thaïch, cô chaát bò phaân giaûi laøm ñoä ñuïc moâi tröôøng giaûm ñi, moâi tröôøng trôû neân trong suoát. Ñoä trong suoát tæ leä vôi ñoä hoaït ñoäng cuûa enzym. Caùch tieán haønh: Chuaån bò moâi tröôøng coù chöùa 2% agar, 1% CMC trong dung dòch ñeäm photphat 0,1 M, pH=5 roài phaân phoái vaøo ñóa petri. Sau khi thaïch ñoâng ta khoeùt loã nhoû treân thaïch coù ñöôøng kính 10mm. Laáy moät ít dòch töø moâi tröôøng loûng ñem loïc voâ truøng vaø laáy 50ml dòch loïc cho vaøo loã treân hoäp petri. Ñeå 400C sau thôøi gian 48giôø. Sau ñoù cho 5ml dòch Congo ñoû 1% vaøo hoäp petri trong thôøi gian 15 phuùt. Gaïn boû dòch Congo, cho theâm 5ml dung dòch NaCl 1M vaøo vaø traùng ñeàu. Ñôïi 15 phuùt. Vuøng maøu vaøng treân neàn ñoû tía laø choã enzym taùc duïng. Phöông phaùp xaùc ñònh hoaït tính CMCase baèng caùch ño löôïng ñöôøng khöû taïo thaønh - Nguyeân lyù: khi enzym taùc duïng treân cô chaát cellulose, döôùi taùc duïng cuûa phöùc heä enzym cellulase cô chaát bò phaân giaûi taïo thaønh ñöôøng khöû. Duøng phöông phaùp so maøu DNS ta xaùc ñònh ñöôïc löôïng ñöôøng khöû taïo thaønh töø ñoù tính ñöôïc hoaït ñoä cuûa enzym. Hoaït ñoä enzym ñöôïc tính baèng ñôn vò UI/ml. Moät UI ñöôïc ñònh nghóa laø löôïng enzym thuûy phaân cô chaát taïo thaønh 1mm glucose trong 1phuùt ôû nhieät ñoä thích hôïp. - Caùch tieán haønh: Caùch pha thuoác thöû DNS: Cho 1,6 g NaOH vaøo 20ml nöôùc caát, khuaáy ñeàu. Cho tieáp 1g DNS vaøo. 30g Natri-Kali tactrat cho vaøo 50ml nöôùc caát. Khuaáy ñeàu cho ñeán khi tan hoaøn toaøn. Troän 2 thaønh phaàn laïi sau ñoù ñaùnh sieâu aâm ñeán khi DNS tan heát. Ñònh möùc 100ml. Ñeå xaùc ñònh hoaït tính enzym EG ta duøng cô chaát laø CMC, coøn ñeå xaùc ñònh hoaït tính enzym CBH ta duøng cô chaát laø boâng. Do EG taùc duïng toát treân cô chaát cellulose bieán tính, coøn CBH thì taùc duïng toát treân cô chaát cellulose keát tinh. Trình töï tieán haønh: Ño hoaït tính enzym EG (coøn ñöôïc goïi laø hoaït tính CMCase do duøng cô chaát CMC) Naáu CMC trong dung dòch ñeäm photphat 0,1M, pH=5 vôùi noàng ñoä CMC 1% ñeán khi CMC tan hoaøn toaøn. Sau ñoù ta duøng dung dòch naøy laøm cô chaát cho enzym taùc duïng. Baûng 3.1- Löôïng caùc chaát cho vaøo trong quaù trình thí nghieäm xaùc ñònh hoaït tính CMCase Maãu traéng Maãu 1 Maãu 2 Chuaån glucose 1% (ml) 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Maãu (ml) 1 1 Cô chaát(ml) 3 2,8 2,6 2,4 2,2 2 2 2 DNS(ml) 1 1 1 1 1 1 1 1 Ñaàu tieân cho cô chaát phaûn öùng vaøo oáng nghieäm, cho chuaån glucose hoaëc maãu vaøo. Ñeå ôû 500C cho enzym taùc duïng trong thôøi gian 20 phuùt. Sau ñoù cho DNS vaøo vaø ñun caùch thuûy ôû nhieät ñoä soâi trong 5 phuùt. Laøm nguoäi nhanh ñeán nhieät ñoä phoøng. Ño ôû böôùc soùng 540nm. Do trong moâi tröôøng nuoâi caáy coù ñöôøng khöû, vì vaäy ñeå xaùc ñònh hoaït tính ta caàn theâm maãu ñoái chöùng cho moãi maãu ño. Maãu naøy coù thaønh phaàn theâm vaøo gioáng nhö maãu ño nhöng chæ khaùc trình töï cho vaøo (Trong baûng laø maãu 1). Ñoái vôùi maãu 1 ñaàu tieân ta cho dung dòch cô chaát vaøo, tieáp ñoù ñeå ôû 600C trong 20 phuùt, sau ñoù cho DNS vaøo, cho dòch maãu vaøo. Ñun caùch thuûy 5 phuùt gioáng nhö maãu khaùc. Nhö vaäy maãu naøy theå hieän löôïng ñöôøng khöû coøn laïi trong moâi tröôøng nuoâi caáy.