Nghiên cứu xây dựng và phát triển quy trình sản xuất giống mía sạch bệnh theo quy mô công nghiệp bằng công nghệ tế bào

Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất 839 NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG VÀ PHÁT TRIỂN QUY TRÌNH SẢN XUẤT GIỐNG MÍA SẠCH BỆNH THEO QUY MÔ CÔNG NGHIỆP BẰNG CÔNG NGHỆ TẾ BÀO TS. Hà Thị Thuý, ThS. Trần Thị Hạnh, Vũ Anh Tuấn, GS.TS. Đỗ Năng Vịnh Viện Di truyền Nông nghiệp SUMMARY Study on building and development of disease-free sugarcane propagation processes by industrial methods using plant cell technology Standardization of protocol for micropropagation of sugarcane was established through in vitro culture using young meristem of sugarcane as an explant. The multiple shoot regenration at various frequencies was observed by using different concentrations and combination of growth regulators. The highest percentage of callus induction was observed in MS medium supplemented with 3mg/l 2,4D. The best response in term of multiple shoot induction was observed on MS medium with BAP 1.5mg/l + Kinetin 0.2mg/l + 15% coconut milk. MS medium containing 0.5mg/l NAA showed nearly 100% rooting response of in vitro regenrated shoots within two week of inoculated. Best hardening response was obtained in Sand + Soil humus + husk burn + ¼ biofertilizer. Keywords: callus in vitro culture, new sugarcane cultivars, micropropagation sugarcane I. ĐẶT VẤN ĐỀ* Tổng sản lượng mía cây trên toàn thế giới năm 2008 là 1.743.092.995 tấn. Mười nước sản xuất mía lớn nhất thế giới theo thứ tự là Brasil, Ấn Độ, Trung Quốc, Thái Lan, Mexico, Colombia, Australia, Argentina và Mỹ, trong đó, Brasil sản xuất 648.921.280 tấn, Ấn Độ sản xuất 348.187.900 tấn; TQ sản xuất 124.917.502 tấn, Thái Lan 73.501.610 tấn (Source: Food And Agricultural Organization of United Nations: Economic And Social Department: The Statistical Division, 2009). Năng suất mía trung bình toàn cầu là 68 tấn/ha, năng suất trung bình vùng Châu Á - Thái Bình Dương là 56.7 tấn/ha, trong khi năng suất trung bình ở Úc là khoảng 92 tấn/ha, ở nước ta chỉ đạt khoảng 52 tấn/ha. Nhân giống truyền thống thường kèm theo vấn đề sâu bệnh, thoái hoá giống đặc biệt là các bệnh về virus.... Công nghệ vi nhân giống được xem là phương pháp hiệu quả nhất để làm sạch bệnh, làm trẻ hóa, phục tráng và tăng năng suất giống, để nhân nhanh trên quy mô lớn đối với các giống mới tạo được, rút ngắn quá trình chọn giống và đưa giống mới vào sản xuất (Feldmenn et al.,1994 ; Lal et al,1996; Lorenzo et al., 2001; Người phản biện: GS.TSKH. Trần Duy Quý. Kaiser and Makhdoom, 2004; Jalaja et al., 2008;). Giống mía sạch bệnh nhân bằng cấy mô làm tăng năng suất từ 30 % đến 68,7% so với giống nhân bằng ngọn thông thường (Li Yang - Rui and Yuan- An Wei, 2006). Nhân nhanh giống mía có thể thực hiện bằng 2 phương thức cấy mô: Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng và tái sinh phôi vô tính từ tế bào mô sẹo phiến lá non. Cây con tạo được đồng nhất về di truyền và rất ít khi bị biến dị trừ trường hợp nuôi cấy quá dài hoặc xử lý đột biến in vitro (Taylor,1993; Kale et al., 2004). Ngày nay, kỹ thuật nuôi cấy chồi đỉnh để tạo giống mía sạch bệnh đã được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp mía đường để nhân nhanh giống sạch bệnh với khả năng làm tăng năng suất mía lên 20 - 30 % sau 3-4 vụ thu hoạch so với giống mía nhân bằng phương pháp truyền thống (Gosal et al., 1998; Chattha et al., 2001; Cheema and Hussain, 2004). Tóm lại, công nghệ tế bào đã được khẳng định là rất hiệu quả đối với công nghiệp mía đường trên toàn cầu. Mục tiêu ứng dụng của công nghệ tế bào mía bao gồm: - Loại trừ bệnh và nhân nhanh các giống mía sạch bệnh - Làm trẻ hóa và tăng năng suất giống, chống thoái hóa do lão hóa sinh lý trong quá trình nhân vô tính VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM 840 - Rút ngắn quá trình tạo giống và đẩy mạnh thương mại hóa giống mới, nhanh chóng thay giống cũ và thiết lập các điền trang trồng mía mới. - Bảo quản và trao đổi quỹ gen. Phục vụ tạo giống mới thông qua biến dị tế bào sôma và chuyển gen. Các nghiên cứu chọn tạo giống mía ở nước ta còn rất hạn chế. Theo Viện Nghiên cứu và Phát triển Mía Đường, ở nước ta hiện nay có khoảng 21 giống mía chủ yếu đang được trồng sản xuất như My5514; F156; Comus; Hòa Lan tím; Hòa Lan; F134; H39-3633; R570; QĐ11; QĐ15; VĐ81-3254; VĐ86-368; ROC10; ROC16; ROC22; VN84-422; VN84-4137; VN85-1427; VN85-1859;K84-200; DLM24) với năng suất từ 70 - 130 tấn/ha, trong số đó nhiều giống đã có biểu hiện thoái hóa và nhiễm bệnh. Việc nhập nội giống ồ ạt cũng là một nguyên nhân kéo theo nguồn sâu bệnh hại từ nước ngoài. Phương án nhập nội số lượng ít và sau đó sử dụng công nghệ tế bào nhân nhanh đã được đề xuất (Hà Thị Thúy và cs.2000). Ở nước ta, một số Viện nghiên cứu như Viện Di truyền nông nghiệp, Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm, Đại học Nông nghiệp Hà Nội, Viện Nghiên cứu và Phát triển Mía Đường đã có một số thành công trong nhân nhanh các giống mía mới bằng cấy mô. Tuy vậy, quy mô nhân giống còn rất hạn hẹp, phạm vi phục vụ mới chỉ khu trú ở một số địa phương. Viện Di truyền nông nghiệp đã triển khai nghiên cứu ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô phục vụ Chương trình mía đường từ rất sớm. Viện đã công bố nhiều công trình nghiên cứu có liên quan đến các khía cạnh khác nhau của công nghệ nhân giống mía (Hà Thị Thúy và Cs,1998; 1999; 2000a). II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu - Các giống sản xuất đại trà ở khu vực miền Bắc: QĐ11, QĐ15, QĐ17, QĐ 93-159, My55-14, VĐ55, VĐ79-177, ROC16, ROC10, ROC22.... - Các giống mới nhập nội. 2.2. Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp chọn giống ưu tú phục vụ nhân nhanh thông qua các giống về năng suất, trữ đường, khả năng thích ứng, mùa vụ thu hoạch, vùng thích nghi, phản ứng sâu bệnh. - Phương pháp chọn cá thể trội để nhân nhanh: cao cây, dài lóng, đường kính thân, khối lượng cây, số cây hữu hiệu/khóm, mức độ sâu bệnh... - Phương pháp làm sạch bệnh và phục tráng giống thông qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng chồi ngọn và chồi nách. - Phương pháp chẩn đoán bệnh bằng ELISA, RT-PCR, PCR đối với bệnh chồi cỏ mía, bệnh khảm và sọc lá mía. - Phương pháp xây dựng các hệ thống tái sinh in vitro hiệu quả cao đối với nhân giống in vitro: phương pháp nuôi cấy chồi đỉnh có 2 - 3 lá mầm; phương pháp tái sinh mô sẹo từ mô non ở chân phiến lá, chồi non. - Phương pháp nhân giống bằng khí canh, thủy canh sau cấy mô. - Phương pháp đánh giá hệ số nhân giống ở các giai đoạn in vitro và sau in vitro. - Các phương pháp công nghệ vườn ươm: Giá thể, phân bón, chế độ tưới tiêu, ánh sáng, nhiệt độ Các phương pháp nhân giống vô tính sau in vitro đối với cây cấy mô. Đánh giá hệ số nhân giống và năng suất của cây thu được ở mỗi phương pháp nhân nhanh. - Các phương pháp thí nghiệm đồng ruộng, khảo kiểm nghiệm giống và thống kê sinh học nông nghiệp - Các phương pháp đánh giá sâu bệnh hại, năng suất, hàm lượng đường III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Đánh giá, chọn lọc, thu thập giống làm vật liệu nhân nhanh Kết quả điều tra đánh giá và chọn lọc các giống tại một số khu vực trồng mía chính ở miền Bắc chúng tôi nhận thấy, tại Nghệ An các giống mía chủ yếu đang trồng là ROC10, My5514, QĐ11, ROC16, VN84-4137, F156, trong đó các giống ROC10, My5514 chiếm tỷ lệ đáng kể (71,17%). Việc nghiên cứu phục tráng các giống này là cần thiết. Tại Hòa Bình, chúng tôi đã xác định được các giống mía HB1 (ROC23), HB2, HB3 có năng suất cao, đạt năng suất trên 100 tấn đến 170 tấn/ha. Tại Thanh Hóa các giống trồng Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất 841 chủ yếu là QĐ 93-159, My55-14, VĐ55, VĐ79- 177, ROC10, QĐ 94, VL6, VĐ 00236, trong đó giống ROC 10 vốn rất được ưa thích vì năng suất cao trên 100 tấn/ha nhưng hiện tại được trồng với diện tích ít do giống bị thoái hóa cây nhỏ, năng suất thấp. Từ các bộ giống đang được trồng đại trà ở các vùng nguyên liệu mía này chúng tôi tiến hành chọn các cá thể tốt, ưu việt trong quần thể để thu thập, lấy mẫu đưa vào ống nghiệm. Danh sách các giống được lấy mẫu đưa vào ống nghiệm gồm: My5514; ROC 10; HB1 (ROC23); HB2; HB3; QĐ 93-159; QĐ 94; VĐ 79; VĐ 55; VĐ 00326. Ngoài thu thập các giống đang sản xuất đại trà đề tài còn tiến hành thu thập thêm các giống mía mới nhập nội, giống có triển vọng để đưa vào nhân nhanh trong điều kiện in vitro. Hiện tại đề tài đã thu thập được 3 giống của Brazil: Brazil 7515 (Br7515); Brazil 2 (Br2); Brazil 3280 (Br3280), 3 giống của Trung Quốc: Quảng Tây 02-208; Quảng Tây 60; Liễu Thành 03-1137. Các giống mới thu thập về được đưa trồng ngoài vườn ươm, sau khi cây con mọc được sử dụng làm nguồn vật liệu cho nuôi cấy mô. Các giống hiện đang được trồng và theo dõi đánh giá ngoài đồng ruộng và đã được đưa mẫu nhân trong phòng thí nghiệm. 3.2. Nghiên cứu tạo vật liệu sạch bệnh 3.2.1. Nghiên cứu tạo vật liệu sạch bệnh ở các giống mía tuyển chọn bằng nuôi cấy chồi đỉnh và chồi nách 3.2.1.1. Chọn mẫu và xử lý mẫu Chọn những khóm mía to khoẻ không bị sâu bệnh, lấy ngọn hoặc chặt những cây non có từ 2- 4 lóng. Cây mía còn non sức nẩy mầm và khả năng tái sinh cao, ít hoạt chất thứ cấp làm đen môi trường hơn so với ngọn già. Ngọn mía được cắt bỏ phiến lá, bóc bỏ tất cả phần bẹ lá già và các lá đã tiếp xúc với không khí và có màu lục, lau sạch bằng cồn etanol 700. Sau đó đưa ngọn vào buồng vô trùng, bóc bỏ lần lượt các lớp bẹ và lá non bên ngoài cho đến khi chỉ còn lại phần ngọn với lá non trắng nõn nằm sát chồi đỉnh. Sau đó tách lấy phần chồi nách, chồi đỉnh hoặc lá non trắng nõn nằm sát đỉnh sinh trưởng làm vật liệu nuôi cấy. Đối với cây mía, mắt mía non (chồi ngủ) và chồi đỉnh thường được bao bọc trong nhiều lớp bẹ lá, do vậy rất sạch. Dựa vào những đặc tính cơ bản đó mà chúng tôi đưa mẫu vào ống nghiệm mà không sử dụng hoá chất khử trùng. Kích thước mẫu nuôi cấy như sau: - Chồi nách: Đường kính 1,0cm  1,0cm. - Chồi đỉnh: Bóc bỏ lá non, lấy chồi non đường kính 1,5cm  1,5cm. 3.2.1.2. Môi trường nuôi cấy Môi trường cơ bản (MS): Muối đa lượng, vi lượng, vitamin, axit amin theo Murashige and Skoog (Murashige and Skoog, 1962). Môi trường MS cải tiến (Modified MS - mMS): Như MS (1962) nhưng tăng nồng độ B1 lên: 1,0 mg/l + 30g/l đường + 6,0 g/l thạch, pH = 5,8. Môi trường tạo chồi cấp I: Môi trường mMS + 0,5mg/l BAP, pH = 5,8. Môi trường nhân chồi: Môi trường giống như môi trường tạo chồi cấp I, riêng nồng độ BAP, Kinetin, nước dừa có sự thay đổi tuỳ theo mục đích thí nghiệm. 3.2.1.3. Phản ứng của các giống mía khác nhau trên môi trường khởi tạo Chúng tôi tiến hành thí nghiệm với13 giống thu thập được (My5514; ROC 10; HB1 (ROC23); HB2 (); ROC26; QĐ 93-159; QĐ 94; VĐ 79; VĐ 55; VĐ 00326; Br7515; Br2; Br3280) trên môi trường khởi tạo để kích thích sự bật chồi mới. Tuy nhiên, do đề tài mới bắt đầu tiến hành từ tháng 7 các giống được đưa vào ở các giai đoạn khác nhau. Trong đó các giống My5514; ROC 10; HB1 (ROC23); HB2 (); ROC26; QĐ 93-159; QĐ 94 được đưa từ cuối tháng 8, Br7515; Br2; Br3280 đưa cuối tháng 10 và VĐ 79; VĐ 55; VĐ 00326 đưa vào giữa tháng 12 nên kết quả nghiên cứu vẫn đang trong giai đoạn theo dõi. Kết quả theo dõi sơ bộ cho thấy các giống khác nhau có khả năng tái sinh chồi phụ rất khác nhau. Sau một tuần các giống ROC10, My5514, HB2, Br3280 tỏ ra có khả năng tái sinh mạnh hơn cả. Trong khi đó sự hình thành chồi mới ở giống QĐ 93-159, QĐ 94, Br2 xảy ra rất chậm. Sau hơn ba tuần nuôi cấy, 100% chồi đỉnh và chồi nách nuôi cấy ở ba giống ROC10; My5514, Br3280 đã bật nhiều chồi mới. Đối với giống QĐ 93-159, QĐ 94, Br2, sau 1 tuần nuôi cấy không thấy bật chồi mới, sang tuần thứ 3 mới có hiện tượng bật chồi. Nhưng tỷ lệ bật chồi rất thấp và chồi bị vàng. Khả năng tái sinh kém của một số giống có thể liên quan đến hiện tượng hoá đen môi trường do các hợp chất phenolic. VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM 842 Hiện tượng này là đặc điểm khá đặc thù ở các giống và biểu hiện rõ nhất ở nhóm giống QĐ 93-159, QĐ 94, chồi tiết ra các hợp chất phenolic và các sản phẩm thứ cấp làm đen môi trường. Phenol tiết ra bao bọc xung quanh chồi, kìm hãm tế bào sinh sản và sinh trưởng. Chúng tôi đã thử nhiều tổ hợp các môi trường khác nhau, bổ sung thêm than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy và các chất chống oxy hoá như axit ascorbic, antioxidant, để khử hiện tượng đen do các hợp chất chứa phenol tiết ra. Kết quả cho thấy phương pháp tốt nhất để loại trừ các hợp chất chứa phenol vẫn là cấy chuyển thường xuyên sang môi trường mới. Chồi đỉnh sau khi cấy 1 tuần, tách bỏ phần mô và tế bào bị đen, rồi chuyển chồi sang môi trường mới để loại trừ tác dụng của các hợp chất phenolic. Heinz và cộng sự (1997) cũng đã khắc phục hiện tượng hoá đen bằng biện pháp tương tự. So sánh khả năng tái sinh của hai loại chồi khác nhau cho thấy ban đầu chồi nách có khả năng tạo chồi phụ sớm hơn so với chồi đỉnh. Nhưng đến tuần thứ 3, ở một số giống, tỷ lệ bật chồi phụ của các chồi đỉnh lại vượt lên so với chồi nách và đạt tỷ lệ 100%. Sau 4 tuần nuôi cấy, khả năng tái sinh khác nhau giữa chồi đỉnh và chồi nách thể hiện rõ rệt, mỗi một chồi nách chỉ tạo 1-2 chồi, còn từ một chồi đỉnh có thể tạo ra 45-58 chồi nhỏ. Vì vậy, chồi đỉnh tỏ là vật liệu nuôi cấy tốt hơn chồi nách về cả 2 phương diện. Ít nguy cơ mang theo bệnh truyền nhiễm hơn và cho tái sinh chồi phụ mạnh hơn. 3.2.2. Nghiên cứu tạo vật liệu sạch bệnh thông qua tái sinh mô sẹo ở một số giống mía Tế bào mô sẹo đã được tạo ra bằng nuôi cấy mẫu lá non sát đỉnh sinh trưởng (Ahloowalia and Maretzki,1983; Guidedoni,1986; Taylor et al., 1993). Môi trường MS (1962) có chứa các hàm lượng 2,4D khác nhau đã được sử dụng để tạo mô sẹo từ mẫu lá non. Nồng độ 2,4D tối ưu sử dụng để tạo và bảo quản mô sẹo thay đổi phụ thuộc vào giống. Thông thường nồng độ auxin ở môi trường tạo mô sẹo cao hơn so với môi trường nhân và bảo quản mô sẹo (Guidedoni,1986). Các chất tương tự auxin như Picloram cũng được sử dụng để tạo mô sẹo. Ho và Vasil (1983) cho biết có 3 loại mô sẹo khác nhau tái sinh từ lá mía non: Mô sẹo phôi hoá (Embryogenic mô sẹo) khác với 2 loại kia ở chỗ có cấu trúc cứng, bề mặt nhẵn, tế bào nhỏ, tròn và giàu tế bào chất. Hai loại còn lại Non - Embryogenic mô sẹo thường xốp, tế bào to và dài. * Môi trường thí nghiệm: - Môi trường tạo mô sẹo: Môi trường MS + 15% nước dừa + (0-5 mg/l) 2,4D thay đổi (0; 0,5mg/l; 1mg/l; 2mg/l; 3mg/l; 4mg/l; 5mg/l), pH = 5,8. - Môi trường nhân mô sẹo: Môi trường MS + 2,4D hàm lượng thấp hơn so với môi trường tạo mô sẹo (0,5 - 1,5mg/l) + đường (20 - 30 g/l) + 15% nước dừa, pH = 5,8. - Môi trường tái sinh (tạo chồi) từ mô sẹo: Môi trường MS + (0 - 2,5mg/lBAP + 0,2 Kinetine + 15% nước dừa , pH = 5,8. * Nghiên cứu ảnh hưởng của 2,4-D ở các nồng độ khác nhau kết hợp với 0,1 mg/l IBA lên quá trình phát sinh mô sẹo Lát cắt lá non sau khi cắt thành từng miếng vuông 0,5cm × 0,5cm cấy vào môi trường: mMS có bổ sung 2,4 -D với nồng độ thay đổi (0 - 5) mg/l. Mẫu lá đặt trên mặt thạch và nuôi trong điều kiện tối để tạo mô sẹo. Kết quả nghiên cứu được theo dõi sau 4 tuần, 8 tuần. Bảng 1. Ảnh hưởng của 2,4 -D lên quá trình phát sinh mô sẹo ở hai giống mía ROC26 và HB1 (tính theo tỷ lệ %) Sau 4 tuần nuôi cấy Sau 8 tuần nuôi cấy MT Nồng độ 2,4D (mg/l) Số mẫu cấy ROC26 HB1 ROC26 HB1 TD1 0 45 1,8 2,1 2,3 2,7 TD2 0,5 45 8,8 2,0 13,5 44,4 TD3 1 45 13,3 35,5 22,2 55,5 TD4 2 45 15,5 35,5 22,2 64,4 TD5 3 45 28,8 73,3 63,1 86,6 TD6 4 45 23,3 55,5 39,4 81,1 TD7 5 45 20,5 27,6 26,1 45,5 Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất 843 Từ kết quả cho thấy nồng độ 2,4-D ảnh hưởng rất lớn đến quá trình hình thành calus. Trên môi trường đối chứng không chứa 2,4 - D thì các mẫu nuôi cấy không có phản ứng tạo mô sẹo và sau một thời gian mẫu sẽ bị đen và chết, nhưng khi bổ sung 2,4 - D với nồng độ thấp 0,5 mg/l thì mô sẹo đã được hình thành và tỷ lệ tạo mô sẹo tăng lên khi tăng nồng độ 2,4D. Tỷ lệ mô sẹo tạo thành cao nhất trên môi trường có 2,4D ở nồng độ 3mg/l đạt tới 86,6% sau 8 tuần nuôi cấy ở giống ROC23 và 63,1% ở giống ROC26. Tuy nhiên khi tiếp tục tăng nồng độ 2,4-D trong môi trường nuôi cấy tỷ lệ tạo mô sẹo lại giảm dần. Ở nồng độ 5mg/l, sau 8 tuần nuôi cấy tỷ lệ tạo mô sẹo ở giống ROC26 giảm còn 26,1% và 45,5% ở giống HB1. Do lúc này nồng độ 2,4D lớn gây phản ứng ngược lại ức chế quá trình tạo mô sẹo, hình thành rễ nhiều, gây đục môi trường và một số mô sẹo bị chết đen trong môi trường. Các mô sẹo hình thành trên các môi trường này hầu hết là mô sẹo dạng cứng sau khi nuôi cấy khoảng 8 tuần đa số các mô sẹo tái sinh thành cây. Chúng tôi tiến hành thử nuôi cấy nuôi cấy mẫu lá trên các môi trường có 2,4D có bổ sung một số chất phụ gia khác như Malt extract hoặc thay đổi agar bằng chất nền khác như phytagel. Kết quả quan sát bước đầu chúng tôi nhận thấy các mô sẹo hình thành có dạng khối hạt tròn trắng dạng mô sẹo phôi hóa. Các kết quả nghiên cứu đang được tiếp tục theo dõi và nghiên cứu. 3.3. Tái sinh chồi, nhân nhanh chồi mía và tạo cây hoàn chỉnh in vitro 3.3.1. Nghiên cứu tái sinh và nhân nhanh chồi mía in vitro BAP đã được xác định là có vai trò rất lớn trong quá trình tái sinh chồi của mía (Hà Thị Thúy và cs., 2000). Tuy nhiên đối với các giống khác nhau, tác động của BAP có sự khác nhau. Davenpoort và cộng sự đã chứng minh được khi thí nghiệm Kinetin trên các loại thực vật khác nhau thì đều cho kết quả tái sinh chồi tốt hơn ở nồng độ 0,2 mg/l MT. Do vậy chúng tôi quyết định nghiên cứu thí nghiệm với nồng độ Kinetin không thay đổi trong suốt quá trình thí nghiệm là 0,2mg/l MT, BAP thay đổi nồng độ từ 0 - 2,5mg/l MT. Bảng 2. Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến quá trình tái sinh chồi của hai giống mía ROC26 và HB1 (sau 3 tuần nuôi cấy) ROC26 HB1 MT Nồng độ BAP (mg/l) Số mẫu cấy Số chồi thu được Hệ số nhân Số chồi thu được Hệ số nhân Chất lượng chồi B1 0 150 518 3,4 620 4,1 - B2 0,5 150 680 4,5* 815 5,4* + B3 1,0 150 735 4,9* 840 5,6* + B4 1,5 150 987 6,5* 1.015 6,7* ++ B5 2,0 150 671 4,4* 936 6,2* ++ B6 2,5 150 650 4,3* 825 5,5* + CV (%) 5,5 5,8 LSD0,5 0,763019 0,898279 * Chú giải: 5chồi × 5 cụm × 6 bình = 150 chồi (-) Chồi kém chất lượng; (+) Chồi bình thường; (++) Chồi tốt (*) Sai khác có ý nghĩa ở mức xác suất α = 0,05 Từ kết quả thí nghiệm trên ta nhận thấy ở môi trường đối chứng với nồng độ BAP là 0mg/l MT thì quá trình phát sinh chồi có xảy ra nhưng với hệ số nhân thấp, chồi ngắn và không rõ chồi. Hệ số nhân giống ROC26 là 3,4, giống HB1 là 4,1. Khi nồng độ BAP tăng từ 0,5 mg/l đến 1 mg/l thi chúng tôi nhận thấy ảnh hưởng của BAP lên hệ số nhân chồi là tương đối rõ rệt. Hệ số nhân tăng lên trung bình là 4,5 ở giống ROC26 và 5,4 ở giống BH1. Nồng độ của BAP lên tới 1,5 mg/l MT cho hệ số nhân chồi cao nhất đạt 6,5 ở giống ROC26 và 6,7 ở giống HB1, chất lượng chồi cũng rất tốt, chồi mập, xanh hơn và có chiều cao 5 - 8cm. Một ưu điểm nữa của vi nhân giống mía in vitro là cho hệ số nhân khá cao, điều này có ý nghĩa rất lớn trong việc tạo ra được hàng loạt các cây có đặc điểm sinh trưởng, phát triển giống nhau. Tuy nhiên khi tăng nồng độ BAP từ 2mg/l MT đến 2,5 mg/l MT hệ số nhân chồi lại không tăng mà giảm xuống chỉ còn trung bình là 4,3 ở giống ROC26 và 5,5 ở giống BH1. Nguyên nhân của hiện tượng này là do nồng độ BAP cao đã làm ức chế tới khả năng nhân chồi của hai giống VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM 844 mía. Nồng độ BAP cao còn làm cho cụm chồi của hai giống mía có các biểu hiện như sùi to và không rõ chồi non. Vì vậy với nồng độ BAP là 1,5 kết hợp với 0,2mg/l MT Kinetin thì cho hệ số nhân chồi cao nhất đạt 6,5 với giống ROC26 và 6,7 với giống BH1. Ngoài sự ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng nhân giống bằng nuôi cấy mô còn bị tác động bởi các chất phụ gia khác như nước dừa, các dịch chiết nấm men, khoai tây, chuối xanh.... Công bố đầu tiên về việc sử dụng nước dừa trong nuôi cấy mô được nhà khoa học Van Overbeek và cộng sự của ông tìm ra. Sau đó thì tác dụng tích cực của nước dừa đã được nhiều nhà khoa học khác chứng nhận. Nước dừa là hợp chất tự nhiên chứa nhiều chất khoáng, vitamin, hợp chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm Cytokinin có tác dụng kích thích hình thành chồi. Đây là thành phần không thể thiếu trong quá trình tạo chồi và cụm chồi từ mô sẹo. Từ kết quả thí nghiệm chúng tôi nhận thấy khi môi trường chưa bổ sung nước dừa thì cây vẫn phát triển nhưng tỷ lệ tạo chồi thấp, cây có lá hơi vàng. Khi nồng độ nước dừa bằng 15% cho tỷ lệ chồi là cao nhất chất lượng cây cũng đẹp hơn cây khỏe, xanh cứng cáp. Tuy nhiên khi lượng nước dừa bổ sung tăng lên 20% thì chúng tôi thấy rằng hệ số nhân chồi không tăng nữa mà dường như chững lại có phần giảm chút ít. Vậy cần bổ sung vào môi trường nuôi cấy 15% nước dừa để hệ số nhân chồi đạt cao nhất. 3.3.2. Nghiên cứu phân hóa và phát triển bộ rễ ở chồi mía thông qua nuôi cấy lỏng ở một số giống mía Để cây có thể đưa ra ngoài đồng ruộng trồng được nhanh thích ứng với môi trường mới thì cây phải đảm bảo bộ rễ hoàn chỉnh. Trong số các chất điều hóa kích thích sinh trưởng NAA được biết đến là chất kích thích sự hình thành rễ. Tuy nhiên các chồi mía sau khi đã nhân nhanh với chất kích thích sinh trưởng BAP rất khó ra rễ do BAP kìm hãm quá trình hình thành rễ của cây. Do đó trước khi ra rễ chúng tôi nuôi cấy mía trên môi trường tiền ra rễ: MS + 15% nước dừa + 3% đường + 0,6g/l Agar. Môi trường này không bổ sung BAP có tác dụng kéo dài chồi đồng thời loại bỏ lượng BAP còn dư tích lũy bên trong và bám trên thân cây (Hà Thị Thúy, Lê Huy Hàm, Đỗ Năng Vịnh và cs, 1988). Sau đó các chồi được tách rời và cấy vào môi trường thí nghiệm: MS + 15% nước dừa + 6% đường + (0 - 1,5)mg/l NAA không bổ sung agar. Việc sử dụng NAA cho việc tạo rễ với nồng độ quá cao hay quá thấp thì bộ rễ không đủ để đảm bảo cho cây phát triển bình thường. Để xác định được nồng độ thích hợp của NAA bổ sung vào môi trường chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến quá trình hình thành rễ của hai giống mía ROC26 và BH1. Bảng 3. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến quá trình hình thành rễ sau 2 tuần nuôi cấy (tính theo tỷ lệ %) ROC26 ROC26 Nồng độ NAA (mg/l) Số mẫu cấy Tỷ lệ (%) Số rễ TB/cây Độ dài rễ TB(cm) Số lá TB /cây Tỷ lệ (%) Số rễ TB /cây Độ dài rễ TB (cm) Số lá TB /cây 0,0 1500 26 1,23 1,31 2,27 32 0,21 1,37 2,25 0,1 1500 72,6 2,34 1,36 2,27 76,2 1,41 1,22 2,32 0,5 1500 94,5 3,22 3,25 4,26 97 3,63 3,27 4,21 1,0 1500 80,7 3,03 2,30 3,32 87 3,16 2,31 3,34 1,5 1500 67,8 2,46 2,25 3,33 82,6 2,46 2,32 3,36 Ghi chú: Số mẫu cấy: 50 chồi  30 bình = 1500 chồi. Từ kết quả thí nghiệm cho thấy NAA là nhân tố quyết định sự hình thành rễ của cả hai giống mía. Trên môi trường chưa bổ sung NAA thì hầu như cây ra rễ rất ít. Tỷ lệ ra rễ đạt 26% ở giống ROC26 và 32,1% ở giống HB1, bên cạnh đó thì số rễ ra trên 1 cây là ít, chiều dài rễ ngắn, rễ gầy... Khi bổ sung NAA với nồng độ bằng 0,5 mg/l thì tỷ lệ % tạo rễ của cả hai giống là cao nhất. 94,5% ở giống ROC26 và 97,3% ở giống BH1. Với nồng độ này thì gần như toàn bộ cây đưa vào đều có bộ rễ hoàn chỉnh, chiều dài rễ đạt trung bình 3cm, số lá/cây trung bình đạt 4 lá/cây. Tiếp tục tăng nồng độ của NAA lên từ 1,0 mg/l đến 1,5 mg/l thì tỷ lệ mọc rễ vẫn tương đối cao nhưng không cao hơn ở nồng độ NAA bằng 0,5mg/l. Do vậy, việc bổ sung thêm NAA vừa tốn hóa chất mà còn gây ức chế lại quá trình ra rễ. Vậy nồng độ NAA thích hợp nhất cho quá trình hình thành rễ là 0,5mg/l khi đó tỷ lệ rễ tạo thành là 94,5% ở giống ROC26 và 97,3% ở giống BH1. Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất 845 3.4. Nghiên cứu hoàn thiện công nghệ vườn ươm đối với các cây cấy mô Cây sau khi đã phát triển hoàn thiện đạt các chỉ tiêu về số lượng lá, rễ, chiều cao... thì được chuyển ra vườn ươm trước khi đưa cây ra trồng đồng loạt ngoài đồng ruộng. Chất nền là yếu tố quyết định sự sống sót của cây khi đưa cây ra vườn ươm. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu tìm hiểu ảnh hưởng của các giá thể khác nhau đối với ra cây trên vườn ươm. Bảng 4. nghiên cứu ảnh hưởng của chất nền đến tỷ lệ sống của cây trên vườn ươm. Chỉ số phát triển của cây sau khi ra ngôi 10 ngày 20 ngày 30 ngày CT Tỷ lệ sống (%) Cây/khóm Cao cây TB (cm) Số lá TB/cây Cây/khóm Cao cây TB (cm) Số lá TB/cây Cây/khóm Cao cây TB (cm) Số lá TB/cây I 65 5 3,23 2,13 6 4,14 2,31 7 4,26 3,11 II 76 5 3,24 3,24 7 4,22 3,35 7 5,27 4,25 III 88 5 3,22 315 7 4,35 4,16 8 5,24 4,18 IV 91 5 3,15 426 7 4,26 4,23 9 5,31 4,12 V 94 5 3,21 4,34 8 5,13 5,12 9 6,25 5,24 Ghi chú: Công thức I: Đất mùn; II: Đất mùn + cát; III: Đất mùn + cát + trấu hun; IV: Đất mùn + trấu hun + ¼ phân vi sinh; V: Đất mùn + trấu hun + cát + ¼ phân vi sinh Các chỉ tiêu được xác định là; tỷ lệ cây sống, chiều cao cây, số cây/khóm và số lá trên một cây. Kết quả thu được cho thấy công thức V là tốt nhất. Thời gian đầu tỷ lệ cây sống sót 96% nhưng số cây trên khóm còn ít (5 cây/khóm), tuy nhiên sau khi ra ngôi 30 ngày cây vươn nhanh đồng thời đẻ nhánh, đạt 9 cây/khóm, chiều cao cây đạt 5cm, có 4 lá/cây. IV. KẾT LUẬN Đề tài mới bắt đầu triển khai nghiên cứu từ cuối năm 2011 do vậy mới chỉ thu được một số kết quả nghiên cứu ban đầu. 1. Đề tài đã tiến hành đánh giá và thu thập được 10 giống đang được trồng đại trà ở các vùng nguyên liệu mía của miền Bắc: My5514; ROC 10; HB1 (ROC23); HB2 (); HB3 (); QĐ 93- 159; QĐ 94; VĐ 79; VĐ 55; VĐ 00326. - Đề tài thu thập được 3 giống của Brazil: Brazil 7515 (Br7515); Brazil 2 (Br2); Brazil 3280 (Br3280), 3 giống của Trung Quốc: Quảng Tây 02-208; Quảng Tây 60; Liễu Thành 03-1137. 2. Kết quả nghiên cứu tạo vật liệu sạch bệnh bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng và mô sẹo phôi hóa ở các giống mía nghiên cứu: đã nuôi cấy đỉnh sinh trưởng thành công ở các giống My5514; ROC 10; HB1 (ROC23); HB2 (Viên Lâm 6); HB3 (); QĐ 93-159; QĐ 94; Brazil 7515 (Br7515); Brazil 2 (Br2); Brazil 3280 (Br3280). - Tỷ lệ mô sẹo tạo thành cao nhất trên môi trường có 2,4D ở nồng độ 3mg/l đạt tới 86,6% sau 8 tuần nuôi cấy ở giống HB1 và 63,1% ở giống ROC26. - Môi trường thích hợp để tái sinh chồi là: MS + 3% sucrose + 0,6 % agar + Kinetin (0,2mg/l MT) + BAP (1,5mg/l MT). - Môi trường tái sinh chồi có bổ sung 15% nước dừa có ảnh hưởng tốt đối với nhân nhanh chồi mía cấy mô, hệ số nhân chồi đạt hơn 4 lần. 3. Môi trường ra rễ trên môi trường lỏng có nồng độ NAA thích hợp nhất cho quá trình hình thành rễ là 0,5mg/l khi đó tỷ lệ rễ tạo thành là 94,5% ở giống ROC26 và 97,3% ở giống BH1. - Công thức giá thể gồm: Đất mùn + trấu hun + cát + ¼ phân vi sinh là tốt nhất. Thời gian đầu tỷ lệ cây sống sót 96%. Sau khi ra ngôi 30 ngày cây vươn nhanh đồng thời đẻ nhánh, đạt 9 cây/khóm, chiều cao cây đạt 5cm, có 4 lá/cây. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Hà Thị Thúy và cs. (2000). Cải thiện quy trình nhân nhanh giống mía và triển khai giống mới K84.200 vào sản xuất. Kết quả nghiên cứu KH 99/2000 của Viện Di truyền NN. 47-59. 2. Hà Thị Thúy, Lê Huy Hàm, Đỗ Năng Vịnh (1998). Nhân nhanh các giống mía cao sản bằng công nghệ vi nhân giống. Tạp chí Nông nghiệp & CNTP.2.72. 3. Hà Thị Thúy, Lê Huy Hàm, Đỗ Năng Vịnh (2000). Nghiên cứu cải thiện quá trình tạo rễ ở cây mía in vitro bằng nuôi cấy trên môi trường lỏng. Tạp chí Nông nghiệp & CNTP, số 9, 418. 4. Hà Thị Thúy, Lê Huy Hàm, Đỗ Năng Vịnh (2000). Nghiên cứu nhân nhanh một số giống mía mới bằng nuôi cấy mô callus lá non, Tạp chí Nông nghiệp & CNTP, số 10. 456. 5. Hà Thị Thúy, Lê Huy Hàm, Đỗ Năng Vịnh (2000). Nghiên cứu phản ứng của các giống mía trong điều kiện nuôi cấy mô và bảo quản tập đoàn quỹ gen in vitro. Tạp chí Nông nghiệp & CNTP. 8. 341-342. 6. Hà Thị Thúy, Lê Huy Hàm, Đỗ Năng Vịnh (1999). Nhân nhanh các giống mía cao sản bằng công nghệ vi nhân giống in vitro. Kỷ yếu Hội nghị CNSH toàn quốc. 1080. 1999. VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM 846 7. Ahloowalia, B. S. and A. Maretzki (1983). Plant regenration via somatic embryogensis in sugarcane. Pl- ant Cell Reports, 2: 21—25. 8. Chattha, M.A., M.I. Imran, A. Abida, I. Muhammad and A. Akhtar (2001). Micropropagation of sugarcane (Saccharum sp.) Pakistan Sugar J. 16: 2-6 9. Cheema KL and Hussain M (2004). Micropropagation of sugarcane through apical bud and axillary bud. Int. J. Agric. Biol. 2: 257-259. 10. FAO: Food And Agricultural Organization of United Nations: Economic And Social Department: The Statistical Division 11. Feldmenn P, Sapotille J, Gredoire P, Rott P (1994). Micropropagation of sugarcane. In: Teisson C, ed. In vitro culture of tropical plants.France: CIRAD: 15-17. 12. Guiderdoni, E., Merot, B., Eksomtramage, T., Paulet, F., Feldmann, P., and Glaszmann, J. C. (1995). Somatic Embryogensis in Surgacane. In: Bajaj, Y., ed, Biotechnology in Agriculture and Forestry, 1995. 31, P 92-113 13. Gosal, S.S., K.S. Thind and H.S. Dhaliwal (1998). Micropropagation of sugarcane-an efficient protocol for commercial plant production. Crop Impro., 25(2): 167-171. 14. Heinz DJ, Krisnamurti M, Nickell LG, Maretzki A (1977). Cell tissue and organ culture in sugarcane improvement. Applied and Fundamental Aspects of Plant Cell and Organ Culture. (Eds. Reinert, JYPS. Bajaj), Springer, Berlin, Heidelburg, New York. 15. Ho, W., and Vasil, I.K (1983). Somatic embryogensis in sugarcane (Saccharum officinarum L.). I. The morphology and physiology of callus formation and the ontogeny of somatic embryos. Protolasma 118, 169-180. 16. Jalaja, N.C., Neelamathi, D. and Sreenivasan, T.V., (2008). Micropropagation for Quality Seed Production in Sugarcane in Asia and the Pacific. Food and Agriculture Organization of the United Nations, Rome; Asia-Pacific Consortium on Agricultural Biotechnology, New Delhi. 17. Kaiser L.T and Makhdoom H. (2004). Micropropagation of Sugarcane Through Apical Bud and Axillary Bud. INTERNATIONAL JOURNAL OF AGRICULTURE & BIOLOGY. 06. 2; 257-259 18. Kale VP, Bruno TV, Bhagade SV (2004). Studies on callus initiation and plantlet regenration in sugarcane (Saccharum spp.) Indian J. Genet, 64(20); 165-166. 19. Lal, J., H.P. Pande, S. Kawasthi (1996). A genral micropropagation protocol for sugarcane varieties. New Botanist, 23: 1-19 20. Li Yang - Rui and Yuan- An Wei (2006). Sugar Industry in China : R & D and Policy Initiatives to Meet Sugar and Biofuel Demand of Future. SugarTech, 8(04), 2 006) : 203-216 21. Lorenzo JC, Ojeda E, Espinosa A, Borroto C (2001). Field performance of temporary immersion bioreactor derived sugarcane plantys. In vitro cell Dev. Biol., Plant, 37: 803-806. 22. Murashige, T. and F. Skoog (1962). A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco cultures. Physiol. Plant. 15: 473-97 23. Taylor PWJ, Dukie S (1993). Development of an in vitro culture technique for conservation of Saccharum Sp. Plant cell Tissue Organ Cult. 34: 217-222. MỘT SỐ HÌNH ẢNH VỀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất 847