Nghiên cứu xác định các gen không độc trên nấm gây bệnh đạo ôn của một số vùng đồng bằng sông Hồng

Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ hai 1 NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH CÁC GEN KHÔNG ĐỘC TRÊN NẤM GÂY BỆNH ĐẠO ÔN CỦA MỘT SỐ VÙNG ĐỒNG BẰNG SÔNG HỒNG Nguyễn Thị Thanh Nga, Nguyễn Văn Bích, Giang Thị Mai, Đỗ Thị Kim Trang, Nguyễn Thị Hồng Minh, Đào Thị Thu Hằng. TÓM TẮT Kết quả lây nhiễm nhân tạo đã xác định giống lúa có mang gen kháng Pik và Pita có khả năng kháng với nấm bệnh đạo ôn của Thái Bình và Hải Phòng. Cùng với sự phân ly tính không độc trong quần thể con lai F1 giữa giống mang gen không độc và mang gen độc đã xác định được quan hệ gen đối gen giữa giống mang gen kháng Pik và Pita với chủng nấm đạo ôn của Thái Bình và Hải Phòng chứng tỏ gen không độc trên nấm đạo ôn của Thái Bình và Hải Phòng là AVR Pik và AVR Pita. Từ khóa: AVR Pik, AVR Pita, Thái Bình, Hải Phòng I. ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh đạo ôn là một trong số những bệnh gây hại nghiêm trọng cho cây lúa, tác nhân gây bệnh đạo ôn là nấm Pyricularia oryzae. Bệnh có thể xuất hiện trên lá, đốt thân, cổ bông hoặc những phần khác trên bông, đôi khi cả trên hạt và có thể gây hại ở tất cả các giai đoạn sinh trưởng của cây lúa. Năm 1971, Hebert phát hiện ra tính dị tản của nấm đạo ôn Pyricularia, các chủng nấm bệnh đạo ôn trên cây lúa có thể giao phối và tạo quả thể (perithecia). Đặc tính này được xem như là giới tính của nấm bệnh đạo ôn và giống như các loại nấm khác chúng được ký hiệu là MAT (mating type), có hai nhóm, một mang MAT1-1 và một mang MAT1-2. Những phát hiện về sự phân tính cũng như khả năng giao phối của các chủng nấm bệnh đạo ôn trên cho phép chúng ta nghiên cứu về đặc tính di truyền và hệ gen của các chủng nấm đạo ôn. Năm 1992 Silue và cộng sự chứng minh được tính kháng bệnh được thể hiện qua tương tác gen-đối-gen, là sự tương tác giữa gen kháng (resistance gene) trên lúa và gen không độc (avirulence gene) của nấm bệnh đạo ôn. Mối tương tác gen-đối-gen giúp giải thích tại sao gen kháng trên cây lúa có biểu hiện kháng với chủng nấm đạo ôn này song lại không kháng với chủng nấm đạo ôn khác. Nếu chúng ta có thể xác định gen kháng nào trên lúa tương tác với gen không độc nào trên nấm thì chúng ta có thể biết được giống lúa nào kháng với chủng nấm bệnh đạo ôn nào. Mặt khác trong tương tác gen – đối – gen thì dựa vào gen kháng chúng ta có thể xác định được gen không độc và ngược lại dựa vào gen không độc chúng ta có thể xác định được gen kháng phù hợp. II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu - Chủng nấm bệnh đạo ôn của một số vùng thuộc Đồng bằng sông Hồng như Thái Bình (TBOS1-1-1), Nam Định (NĐOS1-1-1), Hải Phòng (HPOS1-1-1) được thu thập, phân lập. 2 tập đoàn con lai nấm F1 giữa chủng nấm đạo ôn của Thái Bình và Hải Phòng với Nn1-1 - Giống lúa nhiễm bệnh đạo ôn BC15, và giống kháng Tẻ tép (có mang gen Pik) làm đối chứng. Các dòng lúa mang gen kháng Kanto 51 (Pik), Tsuyuake (Pik), PiNo4 (Pita), Isikari Shiroke (Pii) là các dòng đẳng gen làm thí nghiệm. 2.2. Phương pháp nghiên cứu * Lây nhiễm nhân tạo: Nấm đạo ôn được nuôi cấy trên môi trường Oatmeal, trong 7 ngày. Loại bỏ sợi nấm đạo ôn khí sinh và chiếu dưới đèn UV để tạo bào tử. Hòa bào tử trong nước cất vô trùng và điều chỉnh dung dịch nấm đến nồng độ 1x105 bào tử/1ml. Bổ sung 0.01% Tween 20 vào dịch bào tử. Phun đều dịch bào tử nấm lên lá cây con (có 3-5 lá thật) và ủ trong điều kiện tối, độ ẩm cao 100%, trong 24 giờ, sau đó cây lúa được lấy ra và để trong điều kiện chiếu sáng 12h/ngày. * Đánh giá mẫu bệnh: Kết quả được đọc sau 4-5 ngày lây nhiễm, có 6 cấp độ bệnh được ký hiệu từ 0-5; trong đó 0: Không có vết bệnh, kháng bệnh; 1: Vết bệnh có đường kính 1mm, kháng bệnh; 2: Vết bệnh có đường kính >2mm, kháng bệnh; 3: Vết bệnh có đường kính VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM 2 từ 3-4mm, mẫn cảm nhẹ; 4: Vết bệnh có đường kính 5-6mm, mẫn cảm; 5: Vết bệnh >6mm, cả lá bị nhiễm bệnh nặng, mẫn cảm cao. Đánh giá màu sắc của bệnh: Vết bệnh màu nâu được ký hiệu là B(brown), phản ứng kháng. Vết bệnh màu vàng được ký hiệu là Y (yellow), kháng yếu. Vết bệnh màu xanh được ký hiệu là G (green), mẫn cảm (Tosa và cs. 2004). III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Xác định tính độc và tính không độc của nấm bệnh đạo ôn đối với một số giống lúa Chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo 3 chủng nấm bệnh đạo ôn thu phân lập được từ đại diện khu vực Đồng bằng sông Hồng, gồm các chủng: TBOS1-1-1, HPOS1-1-1, NĐOS1-1-1 với các giống lúa có mang gen kháng Tẻ tép, Ishikari Shiroke, Kanto 51, Tsuyuake, PiNo4 và BC15. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, kết quả thu được chúng tôi tổng kết trong bảng sau: Bảng 1: Biểu hiện kháng nhiễm của các giống lúa khi có sự xâm nhiễm của mỗi chủng nấm bệnh đạo ôn STT Tên giống TBOS1-1-1 NĐOS1-1-1 HPOS1-1-1 1 BC15 4BG 3-4BG 4Gb 2 Tetep 1-2BG 1-2BG 2BG 3 Ishikari Shiroke 2-3BG 3Gb 3Gb 4 Kanto51 1-2BG 2-3BG 2BG 5 Tsuyuake 2-3BG 1-2BG 2-3BG 6 PiNo4 2BG 3BG 2BG Chú thích: 1: Vết bệnh có đường kính 1mm; 2: Vết bệnh có đường kính 2mm; 3: Vết bệnh lớn có đường kính 3-4mm; 4: Vết bệnh có đường kính 5-6mm; 5. Vết bệnh lớn hơn 6mm, có thể gây héo toàn bộ lá; G: Green, vết bệnh có màu xanh, g: xanh nhạt B: Brown, vết bệnh có màu nâu, b: nâu nhạt Kết quả thu được cho thấy, về tính kháng: - Giống Ishikari Shiroke kháng với chủng nấm đạo ôn của Thái Bình nhưng lại bị nhiễm bệnh bởi các chủng nấm đạo ôn của Nam Định, Hải Phòng. - Các giống Tetep, Kanto 51, Tsuyuake, PiNo4 đều có biểu hiện kháng với các chủng nấm đạo ôn chứng tỏ chúng mang gen kháng và kháng được với các chủng nấm này. - Giống lúa BC15 mẫn cảm với tất cả các chủng nấm đạo ôn thí nghiệm Về tính độc và không độc của các chủng nấm bệnh đạo ôn: - Chủng nấm đạo ôn của Thái Bình có biểu hiện không độc với Ishikari Shiroke nhưng các chủng nấm đạo ôn của Nam Định, Hải Phòng lại biểu hiện độc với giống lúa này chứng tỏ nấm đạo ôn của Thái Bình có mang gen không độc tương ứng với gen kháng của giống này. - Các chủng nấm đạo ôn thí nghiệm có biểu hiện không độc đối với các giống lúa Tetep, Kanto 51, Tsuyuake và PiNo4 chứng tỏ chúng có mang gen không độc có thể tương tác với các gen kháng của các giống lúa này. 3.2. Sự phân ly tính kháng trong quần thể F2 giữa giống lúa kháng và giống lúa nhiễm Bằng phương pháp lai truyền thống chúng tôi đã tạo con lai F1 và phát triển quần thể F2 giữa giống lúa kháng và giống lúa nhiễm bệnh đạo ôn để xác định sự phân ly tính kháng trong quần thể F2. Các giống lúa kháng bệnh đạo ôn: Tẻ tép, Kanto51, Tsuyuake. PiNo4, Ishikari Shiroke; giống nhiễm bệnh BC15 Các quần thể F2 của các tổ hợp lai được lây nhiễm nhân tạo bởi nấm đạo ôn phân lập tại Thái Bình, Hải Phòng và Nam Định. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, kết quả tổng hợp được thu thập và tổng kết trong bảng sau: Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ hai 3 Bảng 2: Sự phân ly tính kháng trong quần thể F2 khi được lây nhiễm bởi nấm bệnh đạo ôn của Thái Bình, Hải Phòng và Nam Định Nấm lây nhiễm Tổ hợp lai Biểu hiện kháng nhiễm của cây F2 Tỷ lệ Cây kháng Cây bị bệnh Tổng số TBOS1-1-1 BC15/Kanto51 75 21 96 3:1 BC15/PiNo4 93 34 127 3:1 BC15/Tsuyuake 88 36 124 3:1 BC15/Tẻ Tép 89 32 121 3:1 BC15/Ishikari shiroke 97 32 129 3:1 BC15/K60 89 23 112 3:1 HPOS1-1-1 BC15/Kanto51 72 22 97 3:1 BC15/PiNo4 82 24 116 3:1 BC15/Tsuyuake 77 21 98 3:1 BC15/Tẻ Tép 82 25 107 3:1 BC15/Ishikari Shiroke 9 95 104 - BC15/K60 90 36 126 3:1 NĐOS1-1-1 BC15/Kanto51 71 22 103 3:1 BC15/PiNo4 92 28 116 3:1 BC15/Tsuyuake 84 23 107 3:1 BC15/Tẻ Tép 76 20 96 3:1 BC15/Ishikari Shiroke 12 99 111 - BC15/K60 65 43 108 - Kết quả thu được cho thấy ở quần thể F2 khi lây nhiễm bằng chủng nấm đạo ôn của Thái Bình chúng đều cho phân ly theo tỷ lệ cây kháng : cây nhiễm ≈ 3:1. Đối với nấm đạo ôn của Hải Phòng và Nam Định thì F2 của tổ hợp BC15/Ishikari Shiroke không cho tỷ lệ kháng : nhiễm ≈ 3:1 chứng tỏ gen kháng của Ishikari Shiroke không tương tác được với gen không độc của nấm đạo ôn Hải Phòng và Nam Định. Như vậy, kết quả nghiên cứu cho thấy tính không độc trên nấm đạo ôn của Thái Bình và Hải Phòng đều có khả năng tương tác với gen kháng Pik, Pita trên các giống lúa. Tuy nhiên để có thể xác định được gen không độc trên nấm đạo ôn tương tác với 2 gen kháng này là giống nhau hay khác nhau chúng tôi tiếp tục xác định sự phân ly gen không độc trong quần thể F1 con lai nấm đạo ôn giữa chủng mang gen không độc và chủng mang gen độc. 3.3. So sánh các gen không độc trên mỗi chủng nấm bệnh đạo ôn Các gen không độc được so sánh dựa trên kết quả gây độc của các con lai F1 của nấm đạo ôn trên các giống lúa kháng bệnh. - Nấm đạo ôn: 20 con lai F1 của phép lai giữa hai chủng nấm đạo ôn TBOS1-1-1 x Nn1-1 thu nhận từ 5 Ascospore chứa 8 bào tử có sự phân ly 4 nhóm 2 được ký hiệu K (K1,K2); L (L1, L2), M (M1, M2), N (N1, N2). Đối chứng là chủng nấm TBOS1-1-1, Nn1-1. - Các giống lúa: Các giống lúa mang gen kháng được sử dụng cho thí nghiệm: Tetep, Kanto51, PiNo4 và BC15. Các con lai F1 được lây nhiễm nhân tạo lên các giống lúa. Kết quả thu được chúng tôi tổng kết trong bảng sau: Bảng 4: Biểu hiện kháng nhiễm của một số giống kháng đối với con lai F1 của phép lai giữa hai chủng nấm đạo ôn TBOS1-1-1 x Nn1-1 STT Tên nấm Biểu hiện kháng nhiễm của các giống lúa Tẻ tép Kanto 51 PiNo 4 BC15 1 1K1 2BG 3Gb 2BG 3-4Gb 2 1L1 2-3BG 2BG 1-2BG 3-4Gb VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM 4 STT Tên nấm Biểu hiện kháng nhiễm của các giống lúa Tẻ tép Kanto 51 PiNo 4 BC15 3 1M1 4G 2BG 4Gb 4Gb 4 1N1 3G 3Gb 3-4Gb 3-4G 5 2K1 1-2BG 2BG 2-3BG 3-4G 6 2L1 4Gb 2-3BG 1-2BG 3-4Gb 7 2M1 3-4Gb 3-4G 3-4G 4Gb 8 2N1 2-3BG 3-4Gb 4Gb 3-4G 9 3K1 3-4Gb 3-4Gb 4Gb 3-4Gb 10 3L1 3-4Gb 2BG 2-3BG 3-4Gb 11 3M1 2-3BG 3BG 3-4Gb 4Gb 12 3N1 1-2BG 3-4Gb 2BG 3-4G 13 4K1 3-4Gb 4Gb 1-2BG 3-4G 14 4L1 2BG 3-4G 3-4Gb 3-4Gb 15 4M1 3Gb 2-3BG 3-4G 4Gb 16 4N1 1-2BG 1-2BG 2BG 3-4Gb 17 5K1 1-2BG 3-4Gb 3BG 4GB 18 5L1 2BG 2BG 2-3BG 3-4Gb 19 5M1 3-4Gb 3BG 3-4Gb 4Gb 20 5N1 4G 3G 4G 3-4Gb 21 TBOS1-1-1 2BG 2BG 2-3BG 3Gb 22 Nn1-1 3-4Gb 4Gb 3-4Gb 3Gb Chú thích: 1: Vết bệnh có đường kính 1mm; 2: Vết bệnh có đường kính 2mm; 3: Vết bệnh lớn có đường kính 3-4mm; 4: Vết bệnh có đường kính 5-6mm; 5. Vết bệnh lớn hơn 6mm, có thể gây héo toàn bộ lá; G: Green, vết bệnh có màu xanh, g: xanh nhạt B: Brown, vết bệnh có màu nâu, b: nâu nhạt Kết quả thu được cho thấy biểu hiện kháng nhiễm trên các giống lúa đối với từng bộ 4 nấm F1 đôi khi giống nhau, đôi khi lại khác nhau do vậy đặc tính không độc của các nấm đạo ôn này biểu hiện trên 3 giống lúa Tẻ tép, Kanto 51 và PiNo4 là khác nhau chứng tỏ gen không độc tương tác với gen kháng Pik và Pita của 3 giống lúa là khác nhau. Tỷ lệ tính độc: không độc biểu hiện trên mỗi bộ set 4 (K, L, M, N) là 1:1 chứng tỏ tính không độc này do 1 gen quy định. Giống lúa BC15 mẫn cảm. Tương tự 20 con lai F1 của 5 Ascospore chứa 8 bào tử có sự phân ly 4 nhóm 2 được ký hiệu K (K1,K2); L (L1, L2), M (M1, M2), N (N1, N2). Con lai F1 từ phép lai của hai chủng nấm đạo ôn HPOS1-1-1 x Nn1-1. Đối chứng là chủng nấm bố, mẹ HPOS1-1-1, Nn1-1. Các con lai F1 được lây nhiễm nhân tạo lên các giống lúa. Kết quả thu được chúng tôi tổng kết trong bảng sau: Bảng 6: Biểu hiện kháng nhiễm của một số giống kháng đối với con lai F1 của phép lai giữa hai chủng nấm đạo ôn HPOS1-1-1 x Nn1-1 STT Tên nấm Biểu hiện kháng nhiễm của các giống lúa Tẻ tép Kanto51 PiNo4 BC15 1 1K1 3-4G 3-4Gb 4Gb 4Gb 2 1L1 3-4Gb 2BG 3-4Gb 3-4G 3 1M1 1-2BG 3-4Gb 2BG 4G 4 1N1 2BG 2BG 1-2B 3-4Gb 5 2K1 2-3BG 3BG 2-3BG 3-4Gb Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ hai 5 STT Tên nấm Biểu hiện kháng nhiễm của các giống lúa Tẻ tép Kanto51 PiNo4 BC15 6 2L1 4Gb 3-4Gb 1-2BG 3-4Gb 7 2M1 3-4Gb 1-2BG 3-4Gb 4Gb 8 2N1 2BG 3-4G 4G 3-4G 9 3K1 1-2B 3-4Gb 1-2B 3-4Gb 10 3L1 2BG 2GB 3BG 3-4Gb 11 3M1 3-4Gb 2-3BG 3-4Gb 4Gb 12 3N1 3-4G 3G 3-4G 3-4Gb 13 4K1 3-4Gb 4Gb 2BG 4Gb 14 4L1 1-2BG 3-4Gb 3-4Gb 3- 4Gb 15 4M1 3Gb 1-2BG 2-3BG 4Gb 16 4N1 2BG 1-2BG 3-4Gb 3-4Gb 17 5K1 1-2B 3-4Gb 3BG 4Gb 18 5L1 3BG 2BG 2BG 3-4Gb 19 5M1 3-4Gb 2-3BG 3-4Gb 4G 20 5N1 3-4G 3G 3-4G 3-4Gb 21 HPOS1-1-1 1-2B 1-2BG 2BG 3-4Gb 22 Nn1-1 3-4Gb 3-4Gb 3-4Gb 4Gb Chú thích: 1: Vết bệnh có đường kính 1mm; 2: Vết bệnh có đường kính 2mm; 3: Vết bệnh lớn có đường kính 3-4mm; 4: Vết bệnh có đường kính 5-6mm; 5. Vết bệnh lớn hơn 6mm, có thể gây héo toàn bộ lá; G: Green, vết bệnh có màu xanh, g: xanh nhạt B: Brown, vết bệnh có màu nâu, b: nâu nhạt Kết quả thu được cho thấy giống với chủng nấm đạo ôn của Thái Bình, các gen không độc của các chủng nấm gây bệnh đạo ôn F1 tương tác cho kiểu hình kháng bệnh ở các giống lúa mang gen kháng là khác nhau chứng tỏ các gen không độc này là khác nhau, chứng tỏ gen không độc tương tác với gen kháng Pik và Pita của 3 giống lúa là khác nhau. Tỷ lệ tính độc: không độc biểu hiện trên mỗi bộ set 4 là 1:1 chứng tỏ tính không độc này do 1 gen quy định. Đối chứng BC15 nhiễm bệnh. 3.4. Xác định tương tác gen-đối-gen Từ các kết quả nghiên cứu về các gen kháng, gen không độc cho thấy: Giống lúa BC15 mẫn cảm còn giống Tetep, Kanto 51 và PiNo4 kháng được với các chủng nấm đạo ôn của Thái Bình và Hải Phòng. Kết quả biểu hiện tính độc và không độc của các chủng nấm gây bệnh đạo ôn đối với các giống lúa: Các chủng nấm đạo ôn của khu vực Đồng bằng sông Hồng có biểu hiện không độc đối với các giống lúa Tetep, Kanto 51, PiNo4 chứng tỏ chúng có mang gen không độc có thể tương tác với các gen kháng của các giống thí nghiệm. IV. KẾT LUẬN - Giống lúa có mang gen kháng Pik và Pita có khả năng kháng với nấm bệnh đạo ôn của Thái Bình và Hải Phòng. - Sự phân ly tính không độc của con lai nấm F1 giữa 2 chủng nấm này với chủng mang gen độc phân ly 1:1 và phân ly tính độc và không độc lên các giống lúa là khác nhau chứng tỏ hai gen không độc tương tác với hai gen kháng là khác nhau. - Đã có tương tác gen-đối gen của 2 gen kháng này với chủng nấm bệnh đạo ôn của Thái Bình, Hải Phòng và gen không độc trên nấm bệnh đạo ôn của Thái Bình, Hải Phòng được xác định là AVR Pik và AVR Pita. LỜI CẢM ƠN Tác giả bài báo xin trân trọng cảm ơn Bộ Nông nghiệp và PTNT đã cấp kinh phí để thực hiện công trình này trong khuôn khổ đề tài “Nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bệnh đạo ôn bền vững bằng công nghệ gen - đối - gen và chỉ thị phân tử”. VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM 6 Tác giả cũng chân thành cảm ơn các cán bộ của Bộ môn Công nghệ Vi sinh, Viện Di truyền Nông nghiệp đã tạo điều kiện để thực hiện đề tài này. TÀI LIỆU THAM KHẢO Flor, H. H., 1971. Current status of gene-for-gene concept. Annu. Rev. Phytopathol., 9: 275- 296. Hiroshi Yaegashi, 1977. On the Sexuality of Blast Fungi, Pyricularia spp. Ann. Phytopathology. Soc. Japan, 43: 432-439 Tosa, Y., Hirata, K., Tamba, H., Nakagawa, S., Chuma, I., Isobe, C., Osue, J., Urashima, A. S., Don, L. D., Kusaba, M., Nakayashiki, H., Tanaka, A., Tani, T., Mori, N., and Mayama, S., 2004. Genetic constitution and pathogenicity of Lolium isolates of Magnaporthe grisea in comparison with host species-specific pathotypes of the blast fungus. Phytopathology, 94: 454-462. ABSTRACT Determination of the Avirulence genes in rice blast fungus from Red River Delta region Artificial infection results have identified rice varieties carrying the resistance gene Pik and Pita is resistant to rice blast fungus of Thai Binh and Hai Phong. More ever, the segregation Avirulent/virulent in F1 population between varieties carry avirulence genes and virulence genes to determine gene- for-gene interaction between the rice carrying resistance genes Pik and Pita with rice blast fungus strains from Thai Binh and Hai Phong. Avirulent genes in rice blast fungus of Thai Binh and Haiphong are AVR Pik and AVR Pita. Keywords: AVR Pik, AVR Pita, Thai Binh, Hai Phong Người phản biện: TS. Khuất Hữu Trung