Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học phân tử để tách dòng gen mã hóa enzyme luciferase - Trần Thị Thanh Quỳnh

Hóa học & Kỹ thuật môi trường T.T.T. Quỳnh, T.V. Thiệp, , “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ enzyme luciferase.” 140 NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN TỬ ĐỂ TÁCH DÒNG GEN MÃ HÓA ENZYME LUCIFERASE Trần Thị Thanh Quỳnh1, Tô Văn Thiệp1, Nguyễn Văn Hoàng1, Trần Thị Thu Hường1, Lê Duy Khánh1, Nguyễn Đình Hưng1, Phạm Kiên Cường1* Tóm tắt: Đoạn gen mã hóa cho enzyme luciferase từ đom đóm ở Việt Nam đã được nhân dòng thành công vào vector pGEMT bằng phương pháp RT-PCR (Reverse transcription-Polymerase chain reaction) và ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử khác. Sau đó, plasmid mang đoạn gen này (pGEM-luciferase) đã được biến nạp vào tế bào E.coli và giải trình tự. Kết quả cho thấy: đoạn gen có kích thước khoảng 1,6 kb, có trình tự tương đồng 100% so với trình tự đã công bố trên ngân hàng gen thế giới (X66919.1). Trên trình tự gen này không có vị trí cắt của các enzyme giới hạn là HindIII, BamHI, NdeI, XhoI...., do đó chúng tôi đã thiết kế thêm trình tự nhận biết của hai enzyme NdeI vào đầu 5' và HindIII vào đầu 3' của gen mã hóa luciferase để phục vụ cho mục đích biểu hiện và sản xuất enzyme này bằng phương pháp tái tổ hợp. Từ khóa: Enzyme luciferase, Đom đóm, Nhân dòng luciferase. 1. MỞ ĐẦU Luciferase là nhóm enzyme có khả năng xúc tác cho phản ứng phát quang sinh học, thuộc họ protein dạng aldelynate, có một nhóm oxy-4-oxidoreductase để thực hiện hoạt động khử carboxyl hóa và thủy phân ATP. Hiện nay đã có trên 20 loại luciferase khác nhau đã được xác định dựa vào nguồn gốc và cơ chế tác dụng của chúng. Trong đó, luciferase của đom đóm được tập trung nghiên cứu nhiều nhất [1,2,3]. Một trong những ứng dụng quan trọng của luciferase là để phát hiện tổng số vi sinh vật và kiểm tra mức độ an toàn của lương thực, thực phẩm và phát hiện sớm mức độ nhiễm khuẩn của bề mặt vật thể trong chế biến cũng như bảo quản lương thực, thực phẩm và y dược, với hệ thống enzym-cơ chất cực nhạy của đom đóm. So với phương pháp truyền thống đòi hỏi tốn nhiều thời gian để xử lý mẫu và nuôi cấy đếm khuẩn lạc, thì phương pháp phát quang sinh học vượt trội hơn hẳn về mặt thời gian và độ chính xác. Nhiều hãng sản xuất kít trên thế giới đã phát triển thành công kít phát hiện tổng số vi sinh vật bằng phương pháp quang sinh học (Clean-Trace, Kikoman, Bio Thema...)[3,7]. Trên thế giới, đã có nhiều công trình nghiên cứu nhân dòng và biểu hiện thành công đoạn gen mã hóa cho enzyme luciferase của đom đóm [4,8,9] và hệ thống enzym luciferase đã trở thành một công cụ đa năng với các ứng dụng khác nhau [5,6,7] bao gồm: thử nghiệm gen chỉ thị trong cả vi khuẩn và các dòng tế bào có nhân điển hình; phát hiện sự có mặt của các vi sinh vật và các hợp chất độc hại, tương tác của vi khuẩn/virut với tế bào chủ thông qua hình ảnh bên trong cơ thể, phân tích biểu hiện gen ở các cơ thể động vật sống và hình ảnh khối u...Ở Việt Nam, đã có một số công trình nghiên cứu về enzyme luciferase [1,2,3], tuy nhiên các công bố về ứng dụng của phương pháp phát quang sinh học nói chung và luciferase nói riêng còn hạn chế và chưa có nhiều nghiên cứu chuyên sâu về enzyme này. Đặc biệt là việc ứng dụng enzyme luciferase trong các lĩnh vực phục vụ cho quân đội như trong trinh sát phát hiện chất độc hóa học, quan trắc, kiểm soát các chất độc trong lương thực, thực phẩm và môi trường đối với lực lượng tác chiến trong điều kiện đặc biệt... còn chưa được quan tâm nghiên cứu. Mặt khác enzyme luciferase thông thường được thu nhận từ các sinh vật có khả năng phát sáng trong tự nhiên như đom đóm, sứa... Tuy nhiên, việc tách chiết và thu nhận enzyme từ các nguồn có sẵn trong tự nhiên là rất khó khăn do không chủ động nguồn Nghiên cứu khoa học công nghệ Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số 41, 02 - 2016 141 nguyên liệu và đạt hiệu quả thu hồi thấp. Vì vậy, tổng hợp được gen mã hóa cho enzyme luciferase, từ đó hướng tới việc ứng dụng và phát triển sản xuất enzyme luciferase bằng công nghệ tái tổ hợp là rất cần thiết, có ý nghĩa khoa học và thực tiễn. Chính vì thế, trong nghiên cứu này chúng tôi đã tiến hành nhân dòng và giải trình tự đoạn gen mã hóa cho enzyme luciferase để tạo tiền đề, phục vụ cho việc nghiên cứu sản xuất enyme luciferase theo con đường tái tổ hợp 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu và hóa chất - Đom đóm thu được ở Việt Nam (Nghệ An, 19/2/2015) - Hóa chất: Các hóa chất thường dùng trong nghiên cứu sinh học phân tử của hãng Sigma, Mecrk, Thermo Scientific... 2.2. Thiết bị Máy PCR và thiết bị điện di ngang của hãng Bio-rad (Mỹ), hệ thống chụp ảnh điện di Mega bio print của hãng Fisher biotech (Úc), máy ly tâm lạnh của hãng Orto alresa (Tây Ban Nha). 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp tách chiết RNA tổng số RNA tổng số được tách chiết từ đom đóm theo bộ kit của hãng ANABIO. Nghiền 30 mg phần đuôi của đom đóm trong nitơ lỏng. Sau đó, bổ sung 400 µl Lysis buffer và 4 µl β- mecaptoethanol bằng máy vortex trong 10 giây và ủ ở nhiệt độ phòng 2 phút. Tiếp đến, bổ sung 200 µl isopropanol và đảo ngược 5-6 lần. Dịch nổi có chứa RNA tổng số sẽ được thu nhận bằng cách ly tâm ở tốc độ 12.000 vòng/phút trong 10 phút, ở nhiệt độ phòng và được chuyển sang cột lọc SCO1 (Anapure filter spin column). Qua 2 bước rửa cột bằng đệm Washing buffer, ARN tổng số được rửa chiết bằng 50 µl Elution buffer. 2.3.2. Phương pháp tổng hợp cDNA RNA tổng số tiếp tục được sử dụng để tổng hợp cDNA bằng enzyme phiên mã ngược M-MLV Reverse Transcriptase của hãng Enzynomic và mồi hexamer. 2.3.3. Phương pháp PCR nhân bản gen luciferase Sau khi đã tách chiết thành công RNA tổng số từ đom đóm và tổng hợp được cDNA, đoạn gen luciferase được chúng tôi nhân bản dựa trên cDNA tổng hợp được bằng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu được thiết kế dựa trên trình tự gen luciferase của đom đóm đã được công bố trên ngân hàng gen thế giới (X66919.1). Cặp mồi có trình tự như sau: Mồi Luciferase Fw: 5’ AACATATGGAAAACATGGAGAACGA 3’ Mồi Luciferase Rv: 5’ CCAAGCTTTACATCTTAGCAACTG 3’ Chúng tôi đã thiết kế thêm trình tự nhận biết của hai enzyme NdeI vào đầu 5' và HindIII vào đầu 3' của gen mã hóa luciferase để phục vụ cho mục đích biểu hiện và sản xuất enzyme này bằng phương pháp tái tổ hợp. Chế độ nhiệt của phản ứng PCR sử dụng mồi luciferase như sau: 94oC : 30 giây 54oC : 45 giây x 35 chu kỳ 72oC : 2 phút 30 giây 2.3.4. Phương pháp nhân dòng gen: Sản phẩm PCR được nhân dòng trực tiếp vào vector pGEM-T dạng mạch thẳng có đầu dính T (theo kit pGEM T easy của Promega). Sản phẩm Hóa học & Kỹ thuật môi trường T.T.T. Quỳnh, T.V. Thiệp, , “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ enzyme luciferase.” 142 nhân dòng được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5, được chọn lọc xanh trắng trên môi trường nuôi cấy chứa X-gal, IPTG và ampicillin. Plasmid tái tổ hợp được tách ra từ các khuẩn lạc trắng và kiểm tra sự có mặt của gen luciferase bằng PCR với các cặp mồi của vector và mồi đặc hiệu của gen mã hóa. 2.3.5. Phương pháp tách chiết plasmid: Plasmid tái tổ hợp pGEM-luciferase được tách chiết từ các tế bào E. coli bằng bộ kit của hãng Qiagen. 2.3.6. Phương pháp giải trình tự và phân tích kết quả: Các sản phẩm PCR mong muốn được đọc trình tự trực tiếp theo phương pháp Sanger trên máy giải trình tự tự động CEQ 8000 (Beckman Counter). Gen luciferase sau khi đọc trình tự sẽ được so sánh với trình tự gen tương ứng trên ngân hàng Gen quốc tế bằng phần mềm BLAST của NCBI. 2.3.7. Phương pháp phân tích vị trí cắt của enzyme giới hạn: Trình tự gen luciferase được phân tích bằng phần mềm ApE để xác định các vị trí cắt của enzyme giới hạn. 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tách chiết RNA tổng số từ đom đóm và tổng hợp cDNA RNA tổng số được tách chiết từ đom đóm bằng bộ kit của hãng ANABIO. Nồng độ RNA thu được được tính toán dựa trên kết quả đo quang phổ ở bước sóng 230 nm là 11,7 ng/µl. Tiếp đến, RNA tổng số được sử dụng để tổng hợp cDNA bằng enzyme phiên mã ngược M-MLV Reverse Transcriptase của hãng Enzynomic và mồi hexamer. 3.2. Nhân bản gen mã hóa luciferase từ đom đóm Đoạn gen luciferase được chúng tôi nhân bản dựa trên cDNA tổng hợp được bằng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu được thiết kế dựa trên trình tự gen luciferase của đom đóm đã được công bố trên ngân hàng gen thế giới (X66919.1). Sau khi PCR và kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% , thu được 1 băng DNA có kích thước khoảng 1,6 kb. Trong khi đó, mẫu đối chứng âm (không có khuôn DNA) thì không xuất hiện băng nào (Hình 1). Kích thước đoạn gen thu được tương đương với kích thước của đoạn gen luciferase (X66919.1) đã được công bố trên ngân hàng gen thế giới. Kết quả này cho phép bước đầu khẳng định đã nhân bản thành công đoạn gen mã hóa cho luciferase từ đom đóm. 3.3. Nhân dòng gen mã hóa luciferase từ đom đóm vào vector pGEM T Sản phẩm PCR đoạn gen luciferase (1,6 kp) từ đom đóm được gắn trực tiếp vào vector nhân dòng pGEM-T, biến nạp vào tế bào E. coli chủng DH5α và các tế bào biến nạp được nuôi cấy trên môi trường LB chứa ampicilin 50 g/ml với sự cảm ứng của IPTG (1 mM) và cơ chất X-gal. Tiếp theo, chọn ngẫu nhiên 3 khuẩn lạc trắng để kiểm tra sự có mặt của đoạn gen nhân dòng bằng phương pháp PCR sử dụng cặp mồi pGEM.Fw và pGEM.Rv được thiết kế đặc hiệu cho vector pGEMT. Theo tính toán lý thuyết, nếu nếu vector có mang đoạn gen luciferase thì sản phẩm PCR thu được sẽ có kích thước khoảng 1,9 kb, bao gồm kích thước của đoạn gen luciferase khoảng 1,6 kb cộng với kích thước đoạn DNA nằm giữa 2 mồi trên vector pGEMT là 0,3 kb. Kết quả điện di trên gel agarose 1% sản phẩm PCR sử dụng DNA từ 3 khuẩn lạc trắng làm khuôn cho thấy các sản phẩm PCR từ khuẩn lạc trắng đều cho băng DNA có kích thước khoảng 1,9 kb (các đường chạy 1-3). Khi sử dụng PCR với cặp mồi đặc hiệu Luciferase Fw/Rv (Hình 2) cho thấy, sản phẩm PCR từ khuẩn lạc trắng cho băng ADN kích thước khoảng 1,6 kb tương đương với kích thước luciferase (đường chạy 7-9). Như vậy, đã thu được các khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp vector pGEM có chứa đoạn gen nhân bản có kích thước khoảng 1,6 kb đặc hiệu cho Nghiên cứu khoa học công nghệ Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số 41, 02 - 2016 143 luciferase. Vì vậy, có thể kết luận đã nhân dòng thành công đoạn gen mã hóa luciferase vào vector pGEMT. Hình 1. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản đoạn gen luciferase từ đom đóm. 1: Thang chuẩn DNA 1 kb 2: Mẫu đối chứng (-), không có DNA 3: Sản phẩm PCR của mẫu cDNA tổng hợp từ RNA tổng số tách từ đom đóm Hình 2. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc kiểm tra vector pGEM-luciferase. 1-3: Khuẩn lạc PCR với mồi pGEM Fw/Rv 4: Đối chứng âm với mồi pGEM Fw/Rv 5: Thang chuẩn DNA 1kb 6: Đối chứng âm với mồi Luciferase Fw/Rv 7-9: Khuẩn lạc PCR với mồi Luciferase Fw/Rv 3.4. Tách chiết plasmid pGEM- luciferase (a) (b) Hình 3. Kết quả điện di sản phẩm tách plasmid (a) và PCR kiểm tra plasmid pGEM- AChE (b) 1’: Thang chuẩn DNA 1kb 2’: Plasmid pGEM- luciferase 1: Plasmid pGEM- luciferase với mồi pGEM Fw/Rv 2: Đối chứng âm với mồi pGEM Fw/Rv 3: Thang chuẩn DNA 1kb 4: Đối chứng âm với mồi Luciferase Fw/Rv 5: Plasmid pGEM- luciferase với mồi Luciferase Fw/Rv Một khuẩn lạc trắng mang plasmid pGEM-luiciferase được nuôi lắc trong 5-10 ml LB lỏng, bổ sung kháng sinh ampicillin với nồng độ 50 µg/ml, ở 37oC từ 8-12 tiếng. Sau đó, Hóa học & Kỹ thuật môi trường T.T.T. Quỳnh, T.V. Thiệp, , “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ enzyme luciferase.” 144 sinh khối tế bào sẽ được thu nhận và được dùng để tách plasmid bằng bộ kit của hãng Qiagen (Đức). Plasmid pGEM-luciferase tinh sạch (Hình 3.a) sẽ được sử dụng làm khuôn để tiến hành PCR bằng cặp 2 mồi đặc hiệu của vector pGEM T và của đoạn gen luciferase. Kết quả được thể hiện ở hình 3b. Như vậy, có thể khẳng định đã tách chiết thành công plasmid pGEM-luciferase. Plasmid ở dạng tinh sạch sạch này sẽ được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. 3.5. Giải trình tự gen mã hóa luciferase từ đom đóm Plasmid tách từ khuẩn lạc trắng được tiến hành xác định trình tự đoạn gen mã hóa luciferase. Kết quả phân tích trình tự nucleotide của gen luciferase trong nghiên cứu được so sánh với trình tự gen này đã được công bố trên ngân hàng gen thế giới (X66919.1) được thể hiện trên Hình 4. Từ hình 4 cho thấy, trình tự luciferase thu được trong nghiên cứu có khung đọc mở (ORF) là 1647 bp, có sự tương đồng 100% so với trình tự luciferase của loài đom đóm Luciola lateralis đã được công bố trên thế giới. Dựa vào kết quả phân tích bằng phần mềm ApE, cho thấy trên trình tự gen luciferase của đom đóm ở Việt Nam không có vị trí cắt của các enzyme giới hạn là HindIII, BamHI, NdeI, XhoI... Nghiên cứu khoa học công nghệ Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số 41, 02 - 2016 145 Hình 4. So sánh trình tự gen luciferase trong nghiên cứu và trình tự gen luciferase của đom đóm đã được công bố trên thế giới (X66919.1). Luciola lateralis là một loài đom đóm phổ biến ở Nhật Bản, kết quả so sánh chỉ ra rằng trình tự acid amin suy diễn của enzyme luciferase của loài L. lateralis tương đồng 94% so với trình tự của loài Luciola cruciata (một loài đom đóm phổ biến khác ở Nhật Bản) và chỉ tương đồng 67% so với loài Photinus pyralis (loài đom đóm phổ biến ở Bắc Mỹ). Đoạn gen mã hóa enzyme luciferase của loài L. lateralis đã được nhân dòng và biểu hiện thành công ở E. coli, với trình tự của protein suy diễn gồm 548 acid amin và có khối lượng phân tử khoảng 60,312 kDa (Tatsumi, 1992). Chính vì vậy, trình tự gen thu được trong nghiên cứu này hoàn toàn phù hợp cho việc nghiên cứu sản xuất enzyme luciferase bẳng phương pháp tái tổ hợp. 4. KẾT LUẬN Đã nhân bản thành công đoạn gen mã hóa cho enzyme luciferase, đoạn gen có kích thước khoảng 1,6 kb từ đom đóm ở Việt Nam bằng phương pháp RT-PCR. Đồng thời nhân dòng thành công đoạn gen này vào vector pGEM T. Trình tự đoạn gen mã hóa cho luciferase từ đom đóm ở Việt Nam tương đồng 100% so với trình tự gen luciferase đã được công bố trên ngân hàng gen thế giới (X66919.1), trình tự này không có vị trí cắt của các enzyme giới hạn là HindIII, BamHI, NdeI, XhoI.... và đã được thiết kế thêm trình tự nhận biết của hai enzyme giới hạn NdeI vào đầu 5’ và XhoI vào đầu 3’. Nhân bản thành công đoạn gen mã hóa enzyme luciferase là cơ sở phục vụ cho mục đích biểu hiện và sản xuất enzyme này bằng phương pháp tái tổ hợp. Hóa học & Kỹ thuật môi trường T.T.T. Quỳnh, T.V. Thiệp, , “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ enzyme luciferase.” 146 Lời cảm ơn: Công trình này được hoàn thành với sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài: "Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học phân tử để tách dòng gen mã hóa enzyme luciferase". TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Trần Linh Phước và cộng sự, “Tạo dòng sản xuất luciferase tái tổ hợp dùng cho phản ứng phát sáng sinh học invitro”, Tạp chí Phát triển khoa học và công nghệ, Đại học Quốc Gia Tp Hồ Chí Minh (2002), tập 5, số 7. [2]. Phạm Hồ Trương và cộng sự, “Nghiên cứu sản xuất bộ Kit vi sinh xác định Arsen bằng máy đo huỳnh quang ABOATOX 1253”, đề tài cấp Trung tâm KHKT&CNQS (2006). [3]. Ngô Ngọc Trung, “Nghiên cứu khả năng chế tạo thuốc thử phát hiện nhanh sự đột biến số lượng vi sinh vật độc hại trong mẫu thực phẩm”, để tài Viện Hóa học-Vật liệu (2012). [4]. Emamzadeh AR, Hosseinkhani S, Sadeghizadeh M, Nikkhah M, Chaichi MJ, Mortazavi M., “cDNA cloning, expression and homology modeling of a luciferase from the firefly Lampyroidea maculata”, J Biochem Mol Biol. (2006 Sep) 30;39(5):578-85. [5]. Frundzhyan V. & Ugarova N., “Bioluminescent assay of total bacterial contamination of drinking water”, Luminescence (2007), 22(3); 241-244. [6]. Lyons S.K., Meuwissen R., Krimpenfort P., Berns A., “The generation of a conditional reporter that enables bioluminescence imaging of Cre/loxP-dependent tumorigenesis in mice”, Cancer Res. (2003 Nov) 63 (21): 7042–6. [7]. Miller J. N., Nawawi, M. B. & Burgess C. , “Detection of bacterial ATP by reversed flow-injection analysis with luminescence detection”, Anal.Che. Acta (1992), 266, 339. [8]. Tasumi H., Kajiyama M., Nakano E., “Molecular cloning and expression in Escherichia coli of a cDNA clone encoding luciferase of a firefly, Luiciola lateralis”, Biochim Biophys Acta. (1992 Jun) 15;1131(2):161-5. [9]. Tatsumi H1, Masuda T, Kajiyama N, Nakano E, “Luciferase cDNA from Japanese firefly Luciola cruciata: cloning, structure and expession in E.coli”, J Biolumin Chemilumin. (1989 Apr-Jun);3(2):75-8. ABSTRACT Research application of molecular biotechnology to clone the luciferase coding gene In this research, by RT-PCR method and molecular biology techniques, the luciferase complete coding sequence from firefly in Viet Nam was cloned and characterized. The cDNA was transformed into the E. coli and sequenced. The result showed: the gene fragment size about 1.6 kb and has a sequence shares 100% identity with the sequence that was published on GenBank (X66919.1). There is no recognition site of restriction enzymes as HinIII, Bam HI, NdeI, XhoI,... on this gene. So we designed additional recognition sites for NdeI at the 5' end and for HindIII at the 3' end of the luciferase coding sequence, that is important basic to express and produce recombinant luciferase protein. Keywords: Luciferase, Firefly, Cloned luciferase. Nhận bài ngày 22 tháng 10 năm 2015 Hoàn thiện ngày 17 tháng 12 năm 2015 Chấp nhận đăng ngày 22 tháng 02 năm 2016 Địa chỉ: Viện Công nghệ mới/Viện KH-CNQS; *Email: phamkiencuong83@gmail.com.