Nghiên cứu tính tương hợp sinh học của keo ha/pvpa trên mô hình chuột

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ bản của Số 1 * 2016 Nghiên cứu Y học Khoa học Cơ bản 53 NGHIÊN CỨU TÍNH TƯƠNG HỢP SINH HỌC CỦA KEO HA/PVPA TRÊN MÔ HÌNH CHUỘT Hồ Văn Hai*, Nguyễn Thị Hiệp*, Lê Quốc Tuấn**, Nguyễn Thị Lệ**, Bùi Chí Bảo**, Võ Văn Tới* TÓM TẮT Mục tiêu: Kiểm tra tính tương hợp sinh học của keo sinh học được tổng hợp từ Hyaluronan (HA) và polyvinyl phosphonic acid (PVPA). Phương pháp: Bằng phương pháp este hóa keo HA/PVPA được tạo ra theo nhiều nồng độ khác nhau, sau đó keo được làm khô phương pháp đông khô lạnh. Keo được gia công thành hình tròn đường kính 1cm và độ dày 1mm. Mẫu keo sau khi tạo hình được cấy lên trên lưng chuột sau đó khả năng làm lành vết thương được quan sát bằng dữ liệu bằng hình ảnh vết thương qua từng ngày (cho đến ngày thứ 14 sau khi cấy mẫu). Khu vực da được cấy vật liệu sẽ được tách ra khỏi vật chủ sau 14 ngày và sử dụng phương pháp cắt lát và nhuộm H&E để xác định mức độ phát triển của mô bên trong khu vực đã được xử lý bằng keo. Kết quả: Kết quả cho thấy keo có khả năng kết dính và hỗ trợ hồi phục vết thương cao ngay tuần đầu tiên. Ngoài ra, kết quả nhuộm H&E cho thấy có mạch máu phát triển và mô mới hình thành. Tuy nhiên, tế bào phát triển tập trung dày ở khu vực được cấy mẫu và cấu trúc mô chưa ổn định. Có thể kết luận rằng, keo tính tương hợp sinh học cao. Kết luận: Kết quả từ những thí nghiệm trên đã chỉ ra rằng vật liệu nền tạo ra từ keo HA/PVPA có khả năng hỗ trợ hồi phục vết thương và có độ tương hợp sinh học cao, thích hợp cho tế bào phát triển khi sử dụng cho vết thương trên da. Từ khóa: Hyaluronan (HA), Polyvinyl Phosphonic acid (PVPA). ABSTRACT IN-VIVO STUDIES OF HA/PVPA GEL USING MICE MODEL Ho Van Hai, Nguyen Thi Hiep, Le Quoc Tuan, Nguyen Thi Le, Bui Chi Bao, Vo Van Toi * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 20 - Supplement of No 1 - 2016: 53 - 58 Objective: To investigate the biocompatibility of hyaluronan (HA) and polyvinyl phosphonic acid (PVPA) hydrogel. Method: HA/PVPA was fabricated by cross-linking between HA with PVPA in various PVPA concentration, then the gel was hydrated by using freeze-drying method in order to make scaffolds. Scaffolds were shaping by surgery blade with 1cm diameter and 1mm thickness. Scaffolds were implanted on mouse dorsal and monitored for 14 day. The implanted zoneswere extracted after implanting 14 days and stained by H&E staining method to observe tissue formation. Result: The results showed that scaffolds were adhesive with skin wound and accelerate the wound healing process. H&E staining results showed that scaffolds were excellent biocompatible materials and provided a matrix for cell regeneration. Conclusion: HA/PVPA hydrogel can be used as bioglue because it’s adhesive properties and excellent biocompatibility. Key words: Hyaluronan (HA), Polyvinyl Phosphonic acid (PVPA). * Đại Học Quốc Tế - Đại Học Quốc Gia Tp. Hồ Chí Minh ** Đại Học Y Dược TP.HCM Địa chỉ liên hệ : TS. Nguyễn Thị Hiệp ĐT: 0983888700 Email: nthiep@hcmiu.edu.vn Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ bản của Số 1 * 2016 Chuyên Đề Khoa học Cơ bản – Y tế Công cộng 54 ĐẶT VẤN ĐỀ Cho đến thời điểm hiện tại, nhu cầu y tế đối với các loại vật liệu và thuốc để chữa trị các bệnh mãn tính gây tổn thương sâu hoặc khiếm khuyết da, các tai nạn gây tổn thương sâu cho da như bỏng nhiệt, bỏng hóa chất, mất da do tai nạn hoặc do lấy da để cấy ghép cho các phần khác, đang rất cao(1,2). Hiện đã có nhiều biện pháp để chữa trị cho những tổn thương đã kể ra ở trên ví dụ như: cấy ghép da từ những bộ phận khác, tế bào gốc, thuốc mỡ trị bỏng Tuy nhiên những biện pháp trên vẫn còn tồn tại nhiều điểm hạn chế như sự hạn hẹp của da ở nguồn bộ phận lấy da để cấy ghép và dễ bị đào thải hoặc hoại tử, tế bào gốc thường không ổn định và chi phí cao do khó bảo quản và qui trình chiết tách phức tạp.Do đó, nhu cầu đối với 1 loại vật liệu sinh học có đầy đủ những ưu điểm cần thiết và dễ sử dụng, tính tương hợp sinh học cao là rất cao(3). Polymer sinh học nguồn tự nhiên hoặc tổng hợp là 1 lĩnh vực nghiên cứu nhiều hứa hẹn để có thể thỏa mãn tất cả những yêu cầu y tế ở trên đối với chữa trị tổn thương da, thậm chí còn có thể tốt hơn mong đợi. Do đó 1 loại keo sinh học đã được tạo ra từ Hyaluronan (HA) và polyvinyl phosphonic axit (PVPA) với tính cơ lí, tương hợp sinh học, hỗ trợ cho sự phát triển tế bào đã được tạo ra nhằm ứng dụng để chữa trị những tổn thương trên da, kết dính tốt với khu vực tổn thương và tạo thành 1 lớp bảo vệ ngăn cách bụi bẩn/vi khuẩn tiếp xúc với vết thương và 1 mặt hỗ trợ cho tế bào mới phát triển và làm lành vết thương nhan(4). Hyaluronan có chứa glycosaminoglycan (GAG) và glucuronic axit là các thành phần chính của tổ hợp ma trận ngoại bào có trong liên kết của hầu hết biểu mô, các mô thần kinh. HA là nonsulfated glycosaminoglycans duy nhất được hình thành ở màng tế bào thay vì Golgi, với khối lượng phân tử rất lớn. Là một trong những thành phần chính của ma trận ngoại bào, hyaluronan góp phần đáng kể vào sự chuyển dời tế bào và tăng sinh tế bào(5). Trong da, hyaluronan chiếm thành phần cao. Do đó, HA là 1 polyme nhiều tiềm năng với những tính chất thích hợp để tái tạo mô mềm, đặc biệt là tái tạo da(6). Polyvinyl phosphonic axit (PVPA) là 1 phosphonate tổng hợp thường được dùng trong tái tạo xương. Trong nghiên cứu này, PVPA đã được kết hợp với HA nhằm tạo ra keo HA- PVPA có tương hợp sinh học cao và có lỗ xốp rộng cho phép tế bào di chuyển vào và phát triển trên chúng(7). Quá trình tạo keo cũng như các tính chất tương hợp tế bào đã được nghiên cứu trong một nghiên cứu trước đây của chúng tôi. Trong bài này, chúng tôi sẽ khảo sát khả năng tương thích keo HA-PVPA trên mô hình chuột. ĐỐI TƯỢNG -PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Nghiên cứu tính tương hợp sinh học của keo sinh học HA/PVPA trên mô hình da chuột. Vì muốn xem tính chất tương hợp của hỗn hợp keo cho nên keo dùng trong thí nghiệm này là keo đã được lấy nước hoàn toàn bằng phương pháp đông khô. Thiết kế nghiên cứu Keo sinh học được tạo ra bằng cách trộn đều dung dịch HA 0,1% với PVPA 30% sau đó trung hòa tính acid của hỗn hợp keo sinh học bằng NaOH, chuẩn độ sao cho pH của keo vào khoảng 7,0-7,04 nhằm tạo môi trường trung tính, không gây độc cho tế bào. Trong thí nghiệm này, có 5 mẫu đợc tạo ra bằng cách thay đổi nồng độ PVPA. Cụ thể hơn như thể tích của PVPA 30% được tăng dần từ 10, 20, 30, 40, 50µL vào từng ống nghiệm có chứa 0,1 mL HA 0,1%. Các ống nghiệm có chứa keo sinh học sau đó được chuẩn độ để điều chỉnh pH về mức 7-7,04 bằng NaOH 0,1 M. Các ống nghiệm chứa mẫu sau đó được đánh số từ 1-5 tương ứng với từng tỉ lệ nồng độ PVPA (Xem bảng 1). Những ống nghiệm chứa mẫu keo sinh học sau đó được cho vào máy đông khô nhằm loại bỏ tất cả các phân tử nước có trong keo trước khi tiến hành cấy trên da chuột. Hình 1 là hình ảnh Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ bản của Số 1 * 2016 Nghiên cứu Y học Khoa học Cơ bản 55 keo sau 48 giờ xử lí bằng phương pháp đông khô. Keo dạng khô có dạng trụ tròn xốp có đường kính 1cm. Các hình trụ này sẽ được cắt thành khoanh tròn có độ dày 2 mm cho quá trình cấy mẫu lên động vật. 15 con chuột bạch (20-26 g) dùng trong thí nghiệm được mua về từ viện Pasteur sẽ được nuôi 1 tuần trước khi phân thành 5 nhóm dùng trong thí nghiệm. Lông chuột ở khu vực lưng được làm sạch, sau đó 1 vết thương hình tròn đường kính 1cm tương đương được tạo ra bằng dao mổ. Vùng khuyết do bị cắt da sẽ được thay thế bằng mẫu keo. Quá trình vết thương lành được theo dõi từng ngày cho tới ngày thứ 14. Bảng 1: Tỉ lệ nồng độ của từng mẫu keo sinh học và độ pH tương ứng của các mẫu. Mẫu HA 1%(mL) PVPA 30% (mL) NaOH 2M (uL) pH 1 0,1 0,01 15 6,5 2 0,1 0,02 35 6,5-7 3 0,1 0,03 50 7 4 0,1 0,04 60 7 5 0,1 0,05 70 7 Hình 1: A) Hình dạng mẫu keo khô, B) vết thương nhân tạo trên lưng chuột, C) vết thương được cấy mẫu. Mẫu da quanh khu vực được cấy mẫu sẽ được cắt ra khỏi cơ thể chuột và xử lí phọc-môn trước khi nhuộm H&E để quan sát sự phát triển của tế bào bên trong mẫu. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Độ kết dính của mẫu và vết thương ngay sau khi cấy Nhằm khảo sát khả năng bám dính mô, keo khô được phủ lên vết thương. Theo như kết quả thu được sau thí nghiệm cấy mẫu lên vết thương, chỉ có mẫu số 2 và số 5 dính tốt với toàn bộ khu vực vết thương, mẫu số 0 và mẫu số 1 bị vỡ và rã thành những mảnh nhỏ nên không bám dính lên trên khu vực vết thương. Mẫu số 3 và số 4 có độ chắc và cứng nhưng không đủ độ dẻo để kết dính hoàn toàn với vết thương nên đã bị rơi ra ngay sau khi cấy. Việc bám dính tốt của mẫu 2 và mẫu 5 có thể giải thích rằng: mẫu 2 là mẫu tốt nhất, có phản ứng vừa đủ giúp cho mẫu bám dính tốt vào mô, trong khi mẫu 5 dính vào vết thương là nhờ vào lỗ xốp rộng, đủ để hút thấm máu và dính vào vết thương. Độ hồi phục của vết thương cho đến ngày thứ 7 sau khi cấy mẫu Qua kết quả quan sát các vết thương cho thấy ngay ngày thứ nhất và thứ hai sau khi cấy mẫu không có hiện tượng loại thải xảy ra, không gây kích ứng và không quan sát thấy ửng đỏ xung quanh vết thương. Qua quan sát nhóm vết thương không qua xử lí bằng keo cho thấy, cho đến ngày thứ 7 sau khi cấy, vết thương vẫn chưa ổn định dễ bị rách. Với nhóm chuột có vết thương được xử lí với keo sinh học mẫu số 2 và số 5 cho thấy vết thương khô nhanh và không còn chảy nước hay máu sau ngày thứ 2 sau khi cấy, vết thương thu hẹp nhanh hơn khi so sánh với vết thương chưa qua xử lí bằng keo. Từ ngày thứ 3 trở đi vết A B C 1cm 1cm Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ bản của Số 1 * 2016 Chuyên Đề Khoa học Cơ bản – Y tế Công cộng 56 thương khô và không có hiện tượng viêm hay mưng mủ, mẫu keo được cấy đã liên kết chắc chắn và tạo thành lớp vỏ bọc ngăn cách tốt vết thương với bụi bẩn và môi trường bên ngoài. Cho đến ngày thứ 7, vết thương được xử lí với mẫu keo số 2 và số 5 đã lành, khu vực xung quanh vết thương được cấy mẫu mọc nhiều lông và gần như có hình thái bình thường so với trước khi cạo để tạo vết thương. Hình 2: Hình ảnh của vết thương ngay sau khi cấy, và được quan sát sau các ngày thứ 2,3,4 và ngày thứ 7 với các mẫu không xử lý bằng keo và các mẫu có xử lý bằng keo. Quan sát tiêu bản Qua quan sát tiêu bảng mẫu da được xử lí với mẫu keo số 2 cho thấy, tế bào đã di chuyển và hình thành một lớp mô mới bù vào lớp da đã bị cắt đi, hình ảnh cho thấy: mô xung quanh vết thương liên kết tốt với mô mới hình thành trong vết thương, quan sát kỹ cho thấy có mạch máu nhỏ xung quanh khu vực cấy mẫu, các mô đã tái tạo có hình thái tương đối hoàn chỉnh. Tuy nhiên, khu vực cấy mẫu cho thấy mô chưa tái tạohoàn chỉnh, tế bào tập trung dày đặc và phân bố đồng đều. Vùng da xung quang vết thương đã hình thành lại lỗ chân lông và phân lớp các mô hoàn chỉnh. Tiêu bản mang mẫu keo số 5 cho kết quả quan sát bằng kính hiển vi gần như tương đồng với mẫu số 2 nhưng mạch máu bên trong khu vực xử lí bằng keo phát triển mạnh hơn và mật độ tế bào tập trung nhiều hơn. Tuy nhiên, nhìn chung thì mô mới hình thành trong mẫu số 5 chưa hoàn thiện bằng mẫu số 2. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ bản của Số 1 * 2016 Nghiên cứu Y học Khoa học Cơ bản 57 Hình 3: Sự phát triển của tế bào bên trong vết thương đã được xử lí bằng keo số 2(A), và keo số 5(B). KẾT LUẬN Nhằm tìm ra tỷ lệ thích hợp nhất của các chất tham gia trong keo HA/PVPA căn cứ vào kết quả khảo sát tính tương hợp sinh học trên mô hình chuột, chúng tôi đã cấy các mẫu này trên cùng một loại chuột với cùng kích thước. Kết quả cho thấy keo số 2 là keo tốt nhất, có thể ứng dụng điều trị vết thương da vì keo có tính bám dính mô rất tốt, tính bám dính này giúp bảo vệ da khỏi sự tấn công của vi khuẩn bên ngoài, ngoài ra keo số 2 còn có tính tương hợp sinh học caogiúp cho tế bào kết dính và phát triển. Với các tính chất trên, keo số 2 thích hợp để ứng dụng cho chữa trị vết thương trên da và kích thích vết thương da phục hồi nhanh. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Burdick JA and Prestwich GD (2011). Hyaluronic acid hydrogels for biomedical applications. Advanced Materials, 23, H41-H56. 2. Nguyen DT, Orgill DP, Murphy GF (2009). Chapter 4: The Pathophysiologic Basis for Wound Healing and Cutaneous Regeneration. Biomaterials For Treating Skin Loss, p. 32. 3. Nguyen MK and Lee DS (2010). Injectable biodegradable hydrogels. Macromolecular Bioscience, 10, 563-579. 4. Shah DN, Recktenwall-Work SM and Anseth KS (2008). The effect of bioactive hydrogels on the secretion of extracellular matrix molecules by valvular interstitial cells. Biomaterials, 29, 2060-2072. A B 500µm 500µm Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ bản của Số 1 * 2016 Chuyên Đề Khoa học Cơ bản – Y tế Công cộng 58 5. Nguyen Thi Hiep, Kim YH, Song HY, Lee BT (2011). Nano Ag loaded PVA nano-fibrous mats for skin applications. Applied Biomaterials, 968(2): p. 8. 6. Trần Văn Tiến (2011). Đánh giá hiệu quả của thuốc bôi DAIVONEX trong điều trị bệnh vảy nến thể thông thường. Tạp chí khoa học công nghệ. 89(01/2): 3 - 7 7. Zheng SX, et al (2004) In situ crosslinkable hyaluronan hydrogels for tissue engineering. Biomaterials, 25, 1339-1348. Ngày nhận bài báo: 24/11/2015 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 30/11/2015 Ngày bài báo được đăng: 15/02/2016