Nghiên cứu thu nhận, nuôi cấy và đánh giá một số đặc điểm hình thái quần thể tế bào gốc phôi bò Việt Nam - Lê Thành Long

TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 277-284 277 NGHIÊN CỨU THU NHẬN, NUÔI CẤY VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI QUẦN THỂ TẾ BÀO GỐC PHÔI BÒ VIỆT NAM Lê Thành Long*, Đoàn Thị Hồng Hạnh, Nguyễn Thị Hồng Vân, Hoàng Nghĩa Sơn Viện Sinh học nhiệt đới, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, (*)lelong2510@gmail.com TÓM TẮT: Tế bào gốc phôi bò hiện nay được phân lập và nuôi cấy ở giai đoạn phôi nang từ 7-9 ngày hoặc giai đoạn phôi từ 12-14 ngày. Bài báo này trình bày kết quả nghiên cứu phân lập và nuôi cấy tế bào gốc phôi bò ở giai đoạn phôi dâu và phôi nang. Kết quả 9 phôi dâu và 3 phôi nang giai đoạn sớm đã được thử nghiệm nuôi cấy phôi nguyên cho thiết lập tế bào gốc phôi. Tuy nhiên, các blastomere trong 9 phôi dâu không thể bám vào lớp tế bào nuôi dưỡng và phát triển, chỉ có 1 trong 3 phôi nang giai đoạn sớm bám được vào lớp tế bào nuôi dưỡng và phát triển thành quần thể tế bào gốc phôi bò. Quần thể tế bào gốc phôi bò sơ cấp được cấy chuyền 2 lần. Ở lần cấy chuyền thứ nhất, 6 quần thể tế bào gốc phôi được quan sát thấy và kích thước các quần thể này dao động từ 50-100 µm. Chỉ có 2 trong 6 quần thể tế bào ở lần cấy chuyển thứ nhất duy trì được hình thái của quần thể tế bào gốc phôi. Ở lần cấy chuyền thứ hai, 5 quần thể tế bào gốc phôi được quan sát và kích thước các quần thể này dao động từ 70-140 µm. Các quần thể tế bào gốc phôi bò trên đều có đường bao quanh rõ tuy nhiên bề mặt của các quần thể này không trơn bóng như quần thể tế bào gốc phôi chuột. Cả 5 quần thể tế bào gốc phôi bò ở lần cấy chuyền thứ 2 bị thoái hoá chỉ sau một tuần nuôi cấy. Tế bào gốc phôi bò được thử nghiệm biệt hoá in vitro và chúng có khả năng biệt hoá thành thể phôi. Đây là một đặc điểm quan trọng cho thấy tế bào gốc phôi bò thu được có tính đa tiềm năng. Từ khóa: Phôi bò, đa tiềm năng, nuôi cấy phôi nguyên, tế bào gốc phôi.. MỞ ĐẦU Tế bào gốc phôi (embryonic stem cells - ESCs) là những tế bào đa tiềm năng thường được thu nhận từ phôi nang (blastocyst) giai đoạn tiền làm tổ (pre-implantation). Chúng có khả năng tự làm mới (re-newal) để tạo thành một số lượng lớn tế bào mà không thay đổi đặc tính đa tiềm năng và có khả năng biệt hóa thành các loại tế bào khác nhau trong cơ thể [5]. Chúng biểu hiện các makers hay các đặc tính chuyên biệt bao gồm các kháng nguyên đặc hiệu cho giai đoạn phôi, sự hoạt động của các enzyme như alkaline phosphatase và telomerase cũng như gene đặc trưng cho tính đa tiềm năng như Oct4 và Nanog [1]. Hơn nữa, chúng có khả năng biệt hoá in vivo thành khối u quái (teratomas), các khối u này chứa các tế bào có đặc điểm giống như các tế bào trong ba lớp mầm phôi: nội bì, trung bì, ngoại bì và chúng có khả năng biệt hóa in vitro trực tiếp thành 200 loại tế bào khác nhau trong cơ thể trưởng thành [12]. Các dòng tế bào gốc phôi đã được phân lập thành công từ phôi nang của chuột, khỉ và người, hơn nữa việc thu nhận còn có thể được thực hiện từ phôi ở giai đoạn trước khi compact [4, 3, 18]. Hầu hết những cố gắng phân lập và nuôi cấy tế bào gốc phôi bò được thực hiện ở phôi nang giai đoạn ngày 7-9 [172,11, 9] hoặc có thể phân lập từ phôi giai đoạn ngày thứ 12- 14 [6]. Tuy nhiên, thời gian tối ưu cho viêc phát triển phôi giai đoạn tiền làm tổ để thu nhận tế bào gốc phôi vẫn còn chưa biết rõ. Những cố gắng thu nhận tế bào gốc phôi bò từ hợp tử và phôi phân chia giai đoạn sớm hầu hết đều thất bại [18, 8], trong đó chỉ có một dòng tế bào tế bào gốc phôi bò duy nhất được tăng sinh từ phôi giai đoạn hai tế bào, được nuôi cấy hơn 3 năm [8]. Trong khi đó, phôi bò giai đoạn phôi dâu được sử dụng cho việc phân lập tế bào gốc phôi có hiệu quả hình thành các quần thể từ 60-70% [17,18]. Cho đến nay, các dòng tế bào gốc phôi bò vẫn chưa được thiết lập một cách bền vững và một số đặc điểm hình thái của quần thể tế bào gốc phôi bò chưa được đánh giá một cách đầy đủ. Do đó, trong công trình này, chúng tôi bước đầu nghiên cứu phân lập và nuôi cấy tế bào gốc phôi bò Việt Nam ở một số giai đoạn khác nhau, đồng thời đánh giá khả năng tăng sinh cũng như đặc điểm hình thái của một số quần thể tế bào gốc phôi bò. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Le Thanh Long, Doan Thi Hong Hanh, Nguyen Thi Hong Van, Hoang Nghia Son 278 Nuôi chín trứng bò Trứng bò được thu nhận từ lò mổ sau đó được chuyển về phòng thí nghiệm. Phức hợp trứng-cumulus (Cumulus - Oocyte complex) được thu nhận bằng phương pháp chọc hút. Phức hợp trứng-cumulus được nuôi trong môi trường TCM199 (Sigma) bổ sung 20% FBS (Gibco), 1% Pen/Strep (Gibco), 2 µg/ml β- estradiol (Sigma), 10IU FSH (Sigma) và 10IU LH (Sigma) ở 38,5oC, 5% CO2 trong vòng 22- 24 giờ. Thụ tinh in vitro trứng bò Trứng sau khi được nuôi chín sẽ được sử dụng cho thụ tinh in vitro. Tinh trùng được swim-up trong môi trường TALP-HEPES (chứa 2 mM sodium pyruvate, 1% pen/strep và 3mg/ml BSA) trong 1 giờ ở 38,5oC. Trứng được thụ tinh với tinh trùng trong vi giọt thụ tinh với mật độ 1 × 106 tinh trùng/ml. Quá trình thụ tinh được diễn ra ở 38,5oC, 5% CO2 trong 8 giờ. Sau đó trứng thụ tinh sẽ được loại bỏ tinh trùng và được nuôi cấy trong môi trường nuôi phôi sofa ở 38,5oC, 5% CO2. Chuẩn bị lớp tế bào nuôi dưỡng Tế bào nuôi dưỡng (nuôi dưỡng cells) được sử dụng trong nghiên cứu này là nguyên bào sợi phôi chuột được phân lập và nuôi cấy từ thai chuột nhắt trắng 12,5-13,5E. Nguyên bào sợi phôi chuột ở lần cấy chuyển thứ 2 sẽ được sử dụng làm tế bào nuôi dưỡng. Nguyên bào sợi phôi chuột được bất hoạt bằng mitomycin C 10 µg/ml trong vòng 2,5 giờ. Sau đó nguyên bào sợi phôi chuột được rửa lại bằng môi trường nuôi cấy tế bào gốc phôi 2 lần mỗi lần 10 phút. Loại bỏ màng zona Trong nghiên cứu này, chúng tôi thử nghiệm loại bỏ màng zona của phôi bò bằng hai yếu tố là enzyme pronase (Sigma) và acid tyrode pH 2,5 (Gibco). Phôi bò giai đoạn 8-16 tế bào sẽ được dùng cho khảo sát nồng độ enzyme pronase cũng như acid tyrode trong việc loại bỏ màng zona. Nuôi cấy phôi nguyên Phôi bò giai đoạn morula và giai đoạn blastocyst sớm được xử lý loại bỏ màng zona. Phôi đã loại bỏ màng zona được chuyển lên đĩa chứa tế bào nuôi dưỡng bị bất hoạt bởi mitomycin C. Phôi nguyên sẽ được nuôi cấy trong môi trường tế bào gốc phôi Knock-out DMEM (Gibco) chứa 20% Knock-out Serum Replacement (Gibco), 1% pen/strep (Gibco), 200 µM mercaptoethanol (Sigma), 1% L-glutamine (Gibco), 1000 IU/ml LIF, 1% Non-essencial amino acid (Gibco), 1% nucleoside (0,73 g/L cytidine, 0,85 g/L guanosine, 0,73 g/L Uridine, 0,8 g/L adenosine, 0,24 g/L thymidine). Cấy chuyền tế bào gốc phôi bò Quần thể tế bào gốc phôi được thu nhận bằng ống mao quản, sau đó được chuyển vào đĩa 96 giếng chứa Trypsin-EDTA 0,25% (Gibco). Khi tách rời hoàn toàn, các tế bào sẽ được chuyển vào đĩa nuôi mới chửa lớp tế bào nuôi dưỡng bị bất hoạt bởi mitomycin C. Tế bào được nuôi trong môi trường nuôi tế bào gốc phôi ở 38,5oC, 5% CO2. Thử nghiệm biệt hoá in vitro Quần thể tế bào gốc phôi được tách bằng Trypsin-EDTA 0,25% thành tế bào đơn, sau đó các tế bào này được nuôi cấy trong đĩa petri với môi trường nuôi cấy tế bào gốc phôi không chứa LIF. Thể phôi có cấu trúc hình cầu sẽ xuất hiện sau 1-2 tuần nuôi cấy. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Đánh giá hiệu quả loại bò màng zona bằng pronase và acid tyrode Trong việc tạo phôi bằng phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm, chỉ những phôi không có sự phân mảnh được chọn lọc cho quá trình nuôi phôi. Những phôi bị phân mảnh bị loại bỏ. Quá trình phân mảnh của phôi là một đặc điểm hình thái của quá trình apoptosis và quá trình này ảnh hưởng lớn tới sự phát triển của phôi cũng như việc thiết lập các dòng tế bào gốc phôi. Để nuôi cấy tế bào gốc phôi, việc loại bỏ màng zona rất quan trọng cho việc thu nhận phôi ở các giai đoạn khác nhau [15]. Các cách phổ biết nhất hiện nay để loại bỏ màng zona của phôi là sử dụng acid tyrode, sử dụng enzyme hoặc sử dụng hệ thống hỗ trợ laser. Tuy nhiên, ở đối tượng gia súc đặc biệt là ở bò, phương pháp phổ biến nhất để loại bỏ màng zona là sử dụng enzyme pronase. TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 277-284 279 Trong bài báo này, enzyme pronase được sử dụng ở các nồng độ khác nhau để kiểm tra khả năng loại bỏ màng zona của phôi bò. Chúng tôi sử phôi phôi bò ở giai đoạn 8 tế bào đến 16 tế bào để kiểm tra khả năng này của enzyme pronase. Kết quả xử lý loại bỏ màng được trình bày trong bảng 1. Kết quả xử lý cho thấy, ở nồng độ 10 mg/ml, màng zona của phôi bò bị loại bỏ nhanh chỉ sau 1 phút. Tuy nhiên, màng zona chỉ bị loại bỏ một nửa đủ để phôi thoát ra ngoài. Quá trình loại bỏ màng zona ở nồng độ 10 mg/ml diễn ra nhanh nhưng nó lại ảnh hưởng lớn tới các tế bào phôi bên trong. Cấu trúc phôi bị thay đổi mạnh, liên kết giữa các tế bào phôi bị cắt và các tế bào phôi này rất dễ rời nhau (hình 1A, 1A1). Ở nồng độ 0,5 mg/ml, màng zona của phôi bị loại bỏ hoàn toàn sau 7 phút. Quá trình loại bỏ này diễn ra lâu, phôi có hiện tượng bị biến dạng (hình 1C, 1C1). Điều đó cho thấy, ở nồng độ này, enzyme pronase cũng tác động lớn tới các tế bào phôi bên trong vì thời gian xử lý lâu, pronase cắt đứt các liên kết giữa các tế bào phôi, làm tách rời các tế bào phôi và phôi bị biến dạng. Ở nồng độ 5 mg/ml, màng zona của phôi bò bị loại bỏ sau 3 phút, phôi gần như vẫn giữ nguyên được cấu trúc và hình dạng giống như trước khi xử lý (hình 1B, 1B1). Các tế bào phôi gần như không tách rời nhau. Điều đó cho thấy, nồng độ pronase 5 mg/ml là thích hợp nhất cho việc loại bỏ màng zona, thời gian xử lý ở nồng độ này ngắn mà phôi gần như không bị thay đổi cấu trúc, hình dạng, tế bào phôi không bị tách rời, đây là những điều kiện rất quan trong cho việc phân lập và nuôi cấy tế bào gốc phôi bò. Acid tyrode pH 2,5 (Gibco) được sử dụng rất phổ biến trong việc loại bỏ màng zona của trứng, phôi chuột hay heo và trong việc thu nhận và nuôi cấy tế bào gốc phôi từ hai đối tượng này, acid tyrode là hóa chất được sử dụng phổ biến nhất [13]. Trong nghiên cứu này, acid tyrode cũng được sử dụng để thử nghiệm loại bỏ màng zona của phôi bò. Tuy nhiên, sau khi xử lý với acid tyrode 30 phút, cấu trúc và hình thái màng zona gần như không biến đổi (hình 1D, 1D1). Điều đó cho thấy, acid tyrode không hiệu quả trong việc loại bỏ màng zona của phôi bò. Hơn nữa, thời gian sử lý với acid tyrode rất lâu nên nó có thể ảnh hưởng tới chất lượng và sự phát triển của phôi bò. Hình 1. Quá trình xử lý loại bỏ màng zona của phôi [A, A1]. phôi bò trước và sau khi xử lý với pronase 10 mg/ml; [B, B1]. phôi bò trước và sau khi xử lý với pronase 5 mg/ml; [C, C1]. phôi bò trước và sau khi xử lý với pronase 0,5 mg/ml; [D, D1]. phôi bò trước và sau khi xử lý với acid tyrode pH 2,5. Bảng 1. Kết quả loại màng zona bằng pronase and acid tyrode Tác nhân loại màng Số phôi dùng cho loại màng zona Số phôi được loại màng zona Pronase 10 mg/ml 13 13 Pronase 5 mg/ml 12 12 Pronase 0,5 mg/ml 13 13 Acid tyrode pH 2,5 11 0 Le Thanh Long, Doan Thi Hong Hanh, Nguyen Thi Hong Van, Hoang Nghia Son 280 Nuôi cấy sơ cấp tế bào gốc phôi bò Quá trình phân lập và nuôi cấy được thực hiện với phôi dâu và phôi nang giai đoạn sớm. Phôi được xử lý với pronase 5 mg/ml để loại bỏ màng zona. Sau đó, phôi được rửa nhiều lần bằng môi trường nuôi cấy tế bào gốc phôi và được chuyển lên đĩa nuôi cấy có chứa tế bào nuôi dưỡng đã bất hoạt bằng mitomycin C để nuôi cấy sơ cấp. Trong nuôi cấy sơ cấp, nhân tố ức chế bệnh bạch cầu (LIF-leukemia inhibitory factor) được sử dụng ở nồng độ 1.000 IU/ml môi trường nuôi cấy. Nồng độ LIF này được sử dụng để bước đầu đánh giá khả năng phát triển của quần thể tế bào gốc phôi bò trong quá trình nuôi cấy sơ cấp cũng như sự tăng sinh của tế bào gốc phôi bò sau các lần cấy chuyền khác nhau. Kết quả nuôi cấy phôi nguyên cho thấy, các blastomere của phôi dâu không thể bám và tăng sinh trên lớp tế bào nuôi dưỡng (bảng 2). Ba phôi nang giai đoạn sớm được nuôi cấy trên lớp tế bào nuôi dưỡng. Tuy nhiên, các tế bào trong 2 phôi đầu tiên không thể bám vào lớp nuôi dưỡng và bị thoái hóa sau 1 tuần nuôi cấy. Chỉ có 1 quần thể tế bào từ phôi thứ ba bám được vào lớp tế bào nuôi dưỡng và phát triển thành quần thể tế bào gốc phôi bò sau 3 tuần nuôi cấy. Quần thể tế bào gốc phôi bò này có đường bao quanh rõ nhưng hình thái quần thể hơi gồ ghề, không trơn nhẵn như quần thể tế bào gốc phôi chuột. Sau 3 tuần nuôi cấy, quần thể tế bào gốc phôi bò này được thu nhận và các tế bào được tách rời thành tế bào đơn cho cấy chuyền. Các tế bào này được chuyển lên lớp tế bào nuôi dưỡng mới để nuôi cấy. Quá trình này được thực hiện để đánh giá khả năng tăng sinh của quần thể tế bào gốc phôi bò. Đánh giá khả năng tăng sinh của tế bào gốc phôi bò bằng cấy chuyền Các tế bào gốc phôi bò được nuôi cấy trên lớp tế bào nuôi dưỡng và phát triển trong môi trường chứa LIF 1.000 IU/ml. Sau 48 giờ nuôi cấy, sáu quần thể tế bào gốc phôi bò hình thành và phát triển trên lớp tế bào nuôi dưỡng. Quần thể tế bào gốc phôi bò trên phát triển mạnh, số lượng tế bào tăng nhanh. Tuy nhiên, một số tế bào vùng ngoài của quần thể tế bào gốc phôi bò biệt hoá và mọc lan trên bề mặt đĩa nuôi cấy cũng như mọc chồng lên lớp tế bào nuôi dưỡng. Hình thái các quần thể tế bào gốc phôi bò ở lần cấy chuyền thứ nhất cũng không trơn nhẵn như hình thái của quần thể tế bào gốc chuột, tuy nhiên, các quần thể trên đều có đường bao quanh rất rõ. Đó là một đặc điểm phân biệt quần thể tế bào gốc phôi với các cụm tế bào do nhiều tế bào kết cụm lại với nhau [7]. Kích thước của các quần thể tế bào gốc phôi bò này dao động từ 30 µm cho tới 60 µm (hình 2). Kích thước các quần thể tế bào gốc phôi ở lần cấy chuyền thứ nhất này không đồng đều. Điều đó chứng tỏ số lượng tế bào gốc phôi trong mỗi quần thể khác nhau, do đó, khả năng tăng sinh của các tế bào gốc phôi bò trong quần thể tế bào nuôi cấy sơ cấp khác nhau. Các quần thể này tiếp túc tăng sinh và phát triển sau 96 giờ nuôi cấy. Kích thước của các quần thể tế bào gốc phôi bò tiếp tục tăng. Kích thước các quần thể dao động từ 50 µm cho tới 100 µm. Kết quả này cho thấy, các tế bào gốc phôi trong các quần thể tế bào gốc phôi ở lần cấy chuyền thứ nhất vẫn còn khả năng tăng sinh mạnh. Hình 2. Sự phát triển của các quẩn thể tế bào gốc phôi bò trên lớp tế bào nuôi dưỡng ở lần cấy chuyển thứ nhất sau 48 giờ nuôi cấy. Thang chia độ 100 µm. TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 277-284 281 Sau 1 tuần nuôi cấy, các quần thể 1, 2, 3, 5 của lần cấy chuyền thứ nhất bị thoái hoá. Hình thái của các quần thể này chuyển từ dạng ụ (hill) sang dạng phẳng (flat), điều đó chứng tỏ các tế bào trong các quần thể này đã biệt hóa. Chỉ còn lại quần thể số 4 và quần thể số 6 duy trì được hình thái giống quần thể tế bào gốc phôi. Quần thể số 4 được sử dụng cho cấy chuyền và quần thể số 6 được sử dụng cho thử nghiệm khả năng biệt hoá của tế bào gốc phôi bò. Bảng 2. Khả năng tăng sinh của tế bào gốc phôi bò Giai đoạn phôi Số phôi sử dụng nuôi cấy tế bào gốc Số phôi bám Số quần thể cấy chuyền lần 1 Số quần thể cấy chuyền lần 2 Phôi dâu 9 0 0 0 Phôi nang 3 1 6 5 Tế bào gốc phôi bò của quần thể thứ 4 được thu nhận và cấy chuyền qua đĩa mới chứa lớp tế bào nuôi dưỡng bị bất hoạt mitomycin C. Tế bào gốc phôi ở lần cấy chuyền thứ hai này cũng được nuôi cấy và tăng sinh trên lớp tế bào nuôi dưỡng được bất hoạt bởi mitomycin C và môi trường chứa 1.000 IU/ml LIF. Sau 96 giờ nuôi cấy, năm quần thể tế bào gốc phôi bò ở lần cấy chuyền thứ hai này hình thành và phát triển. Kích thước của các quần thể này dao động từ 70 µm cho tới 140 µm (hình 3). Nếu so với các quần thể tế bào gốc phôi bò ở lần cấy chuyền thứ nhất, các quần thể tế bào gốc phôi bò ở lần cấy chuyền thứ hai này có kích thước lớn hơn. Tuy nhiên, về mặt hình thái, các quần thể tế bào gốc ở lần cấy chuyền thứ hai này không đồng đều như các quần thể ở lần cấy chuyền thứ nhất. Tuy vẫn có đường bao quanh rõ, nhưng hình thái của các quần thể tế bào gốc ở lần cấy chuyền thứ hai này gồ ghề hơn nhiều và nhiều quần thể có hình thái biến dạng không còn tròn đều. Quần thể tế bào gốc số 2 và số 5 ở lần cấy chuyền thứ 2 này có bề mặt gồ ghề nhất, điều đó cho thấy các tế bào gốc trên bề mặt cũng như tế bào xung quanh của quần thể này đã bắt đầu biệt hóa và không còn giữ được đặc tính tăng sinh mạnh của tế bào gốc phôi nữa. Hình 3. Sự phát triển của các quần thể tế bào gốc phôi bò trên lớp tế bào nuôi dưỡng ở lần cấy chuyền thứ hai sau 96 giờ nuôi cấy. Thang chia độ 100 µm. Cả năm quần thể tế bào gốc phôi bò ở lần cấy chuyền thứ 2 đều bị thoái hóa sau 1 tuần nuôi cấy. Môi trường được sử dụng cho nuôi cấy các quần thể tế bào gốc nói trên là môi trường nuôi cấy tế bào gốc phôi chuột chứa 1.000 IU/ml LIF. Ở bò, LIF được dòng hóa và sử dụng trong nuôi cấy, tuy nhiên, nó chưa được thương mại hóa. Do đó, hầu hết các nhà nghiên cứu sử dụng LIF người (hLIF) để bổ sung vào môi trường nuôi cấy cho phôi bò và các quần thể tế bào gốc phôi bò vì chúng có trình tự tương đồng cao với trình tự LIF người. Mặc dù vậy, việc sử dụng LIF người có thể ảnh hưởng lớn tới quá trình nuôi cấy tế bào gốc phôi bò đặc Le Thanh Long, Doan Thi Hong Hanh, Nguyen Thi Hong Van, Hoang Nghia Son 282 biệt là việc duy trì khả năng tự làm mới cũng như tính đa tiềm năng của các quần thể tế bào gốc phôi bò. Những nghiên cứu trước đây cho thấy rằng, việc thiết lập tế bào gốc phôi bò có thể được thực hiện bằng môi trường nuôi cấy không chứa LIF [8]. Hơn nữa, trong quá trình nuôi cấy phôi bò, hLIF không làm gia tăng [16] hay giảm cũng như không có tác động lên ICM trong phôi nang của bò [10]. Việc tăng sinh các quần thể tế bào từ phôi bào không phụ thuộc vào việc bổ sung LIF [20]. Dựa vào các kết quả trên, LIF dường như không đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì tính đa tiềm năng của tế bào gốc phôi bò. Tuy nhiều nghiên cứu khác lại cho rằng LIF cần thiết cho quá trình tăng sinh và duy trì tính đa tiềm năng của tế bào gốc phôi bò [11], không những vậy, LIF còn cần cho quá trình nuôi cấy tế bào gốc phôi bò được phân lập từ phôi thụ tinh trong ống nghiệm, phôi nhân bản vô tính hay phôi trinh sản [7]. LIF không chỉ cần thiết cho việc duy trì khả năng tự làm mới, nó còn cần thiết cho sự biểu hiện của các marker đa tiềm năng ở tế bào gốc phôi bò (Oct4, Nanog, SSEA1) cũng như duy trì đặc điểm hình thái đặc trưng của quần thể tế bào gốc phôi [15]. Các nghiên cứu về ảnh hưởng của LIF lên quá trình nuôi cấy tế bào gốc phôi bò cho thấy, cần phải có những sự khảo sát kĩ hơn về tác động của LIF lên sự tăng sinh của các tế bào gốc phôi bò. Đặc biệt là nồng độ LIF cần cho nuôi cấy tế bào gốc phôi bò vì LIF ảnh hưởng trực tiếp đến sự tăng sinh và khả năng tự làm mới của tế bào gốc phôi bò, mà hình thái của các quần thể tế bào gốc phôi bò là đặc điểm đầu tiên để đánh giá. Thử nghiệm khả năng biệt hóa in vitro Tế bào gốc phôi có khả năng biệt hoá thành nhiều loại tế bào khác nhau trong ba lớp mầm phôi, bao gồm nội phôi bì, trung phôi bì và ngoại phôi bì. Khả năng biệt hóa này đều diễn ra trong điều kiện in vitro và in vivo [19, 5, 14]. Hình 4. Sự hình thành thể phôi. Các tế bào gốc phôi được tách rời và nuôi cấy trên đĩa petri chứa môi trường không chứa LIF. Hai thể phôi xuất hiện sau 2 tuần nuôi cấy. Các thể phôi có cấu trúc hình cầu (mũi tên trắng). Quần thể tế bào gốc thứ 6 ở lần cấy chuyền thứ nhất được thu nhận và tách thành tế bào đơn trong đĩa 96 giếng chứa Trypsin-EDTA 0,25%. Sau đó, tế bào được chuyển qua các đĩa petri chứa môi trường nuôi tế bào gốc phôi bò nhưng không chứa nhân tố ức bạch cầu (LIF). Sau hai tuần nuôi cấy, các thể phôi hình thành. Các thể phôi này có cấu trúc hình cầu, và được hình thành do sự tăng sinh và biệt hoá từ các tế bào gốc phôi bò. Tuy nhiên, các thể phôi này có kích thước khác nhau điều đó chứng tỏ sự tăng sinh cũng như khả năng biệt hoá của tế bào gốc phôi bò từ quần thể thu nhận là không đồng nhất. Điều đó chứng tỏ, các tế bào trong quần thể được thu nhận có tính đa tiềm năng thông qua việc biệt hóa thành các thể phôi trong điều kiện nuôi cấy in vitro. KẾT LUẬN Bước đầu chúng tôi đã phân lập và nuôi cấy TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 277-284 283 thành công quần thể tế bào gốc phôi bò. Các quần thể này biểu hiện một số đặc điểm của quần thể tế bào gốc phôi và khả năng tăng sinh qua các lần cấy chuyền. Lời cảm ơn: Chúng tôi chân thành cảm ơn Sở Khoa học Công nghệ thành phố Hồ Chí Minh đã hỗ trợ kinh phí cho chúng tôi thực hiện đề tài này. TÀI LIỆU THAM KHÀO 1. Byrne J. A., S. M. Mitalipov and D. P. Wofl, 2006. Current progress with primate Embryonic stem cell. Curr. Stem. Cell. Res. Ther., 1: 127-138. 2. Cibelli J. B., S.L. Stice, P.J. Golueke, J. J. Kane and J. Jerry, 1998. Transgenic bovine chimeric offspring produced from somatic cell-derived stemlike cells. Nat. Biotechnol., 16: 642-646. 3. Delhaise F., V. Bralion, N. Schuurbiers and F. Dessy, 1996. Establishment of an embryonic stem cell line from 8-cell stage mouse embryos. Eur. J. Morphol., 34: 237- 243. 4. Eistetter H. R., 1988. A mouse pluripotent embryonal stem cell line stage-specifically regulates expression of homeo-box containing DNA sequences during differentiation in vitro. Eur. J. Cell. Biol., 45: 315-321. 5. Evans M., Kaufman M. H., 1981. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature, 292: 154-156. 6. Gjorret J. O. and P. Maddox-Hyttel, 2005. Attemps towards derivation and establishment of bovine embryonic stem cell-like cultures. Reprod. Fertil. Dev., 17: 113-124. 7. Wang Li, Duan Enkui, Sung Li-ying, Jeong Byeong-Seon, Yang Xiangzhong, X. Cindy Tian, 2005. Generation and Characterization of Pluripotent Stem Cells from Cloned Bovine Embryos. Biology of Reproduction, 73: 149-155. 8. Mitalipova M., Beyhan Z., First N. L., 2001. Pluripotency of Bovine Embryonic Cell Line Derived from Precompacting Embryos. Cloning, 3: 59-67. 9. Munoz M., A. Rodriguez, C. De Frutos, J. N. Caamano, C. Diez, N. Facal, E. Gomez, 2008. Convetional pluripotence markers are unspecific for bovine embryonic derived cell-lines. Theriogenology, 69: 1159-1164. 10. Rodrigues J. L., Oliveira A. T., Lopes R. F., 2006. Gene expression and developmental competence of bovine embryos produced in vitro with different serum concentrations. Reprod. Domest. Anim., 41(2): 129-136. 11. Saito S., Sawai K., Ugai H, Moriyasu S., Minamihashi A., Yamamoto Y., Hirayama H., Kageyama S., Pan J., Murata T., Kobayashi Y., Obata Y., Yokoyama K. K., 2003. Generation of cloned calves and transgenic chimeric embryos from bovine embryonic stem-like cells. Biochemical and Biophysical Research Communications, 309: 104-113. 12. Savatier P., S. Huang, L. Szekely, K. G. Wiman, J. Samarut, 1994. Constracting patterns of retinoblastoma protein expression in mouse embryonic stem cells and embryonic fibroblasts. Oncogene, 9: 809-818. 13. Sayaka W., Takafusa H., Rinako S., Yuko S., Hong-Thuy Bui, Eiji M. and Teruhiko W., 2007. Efficient Establishment of Mouse Embryonic Stem Cell Lines from Single Blastomeres and Polar Bodies. Stem Cells, 25: 986-993. 14. Shamblott M. J., Axelman J., Wang S., Bugg E. M., Littlefield J. W., Donovan P. J., Blumenthal P. D., Huggins G. R., Gearhart J. D., 1998. Derivation of pluripotent stem cells from cultured human primordial germ cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:13726- 13731. 15. Shanbo Cao, Fang Wang, Zhisheng Chen, Zhong Liu, Cheng Mei, Haojia Wu, Junjiu Huang, Chao Li, Lingjun Zhou, Lin Liu, 2009. Isolation and Culture of Primary Bovine Embryonic Stem Cell Colonies by a Novel Method. Journal of Experimental Zoology, 311A: 368-376. Le Thanh Long, Doan Thi Hong Hanh, Nguyen Thi Hong Van, Hoang Nghia Son 284 16. Sirisathien S., Brackett B. G., 2003. Influence of postmortem delay in aspiration of oocytes on production of bovine blastocysts in vitro. Vet. Rec., 153(11): 334- 335. 17. Stice S. L., N. Strelchenko, C. L. Keefer, L. Matthews, 1996. Pluripotent bovine embryonic stem cell lines direct embryonic developmet following nuclear transfer. Biol. Reprod., 54: 100-110. 18. Strelchenko N., 1996. Bovine pluripotent stem cells. Theriogenology, 45: 131-140. 19. Thomson J. A., Itskovitz-Eldor J., Shapiro S. S., Waknitz M. A., Swiergiel J. J., Marshall V. S., Jones J. M., 1998. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science, 282: 1145- 1147. 20. Vejlsted M., Du Y., Vajta G., Maddox- Hyttel P., 2006. Post-hatching development of the porcine and bovine embryo defining criteria for expected development in vivo and in vitro. Theriogenology, 65(1): 153-165. ISOLATION AND CULTURE OF BOVINE EMBRYONIC STEM-LIKE CELLS USING WHOLE ZONA-FREE EMBRYO CULTRUE Le Thanh Long, Doan Thi Hong Hanh, Nguyen Thi Hong Van, Hoang Nghia Son Institute of Tropical Biology, VAST SUMMARY Zona membranes of bovine embryos were dissolved using 5 mg/ml pronase to collect zona-free embryos. Whole embryo culture was applied for bovine embryonic stem cell establishment. Bovine embryonic stem cells were isolated and cultured from bovine morula stage embryos and blastocyst stage embryos. Nine morula stage embryos were cultured on mouse embryonic fibroblast inactivated by 10 µg/ml mitomycin C. However, there was no attachment or proliferation of morula blastomere on the feeder cell layer. Whole blastocyst stage embryo culture were also used to establish embryonic stem cells. One blastocyst stage embryo attached to feeder cell layer and proliferated to embryonic stem-like cell colony in three weeks. The primary bovine embryonic-like colony were collected and passaged to passage one. Six embryonic-like colonies were formed on feeder layer in passage one. The colonies’ diameter of passage one is from 50µm to 100 µm. Four colonies were degenerated. Colony 4 and 6 proliferated continuously in one week. Colony 4 was picked up and passaged to passage 2. Five embryonic-like colonies were formed on the feeder layer in passage two. The colonies’ diameter of passage two was from 70 µm to 140 µm. However, all embryonic-like colonies of passage two degenerated in one week. These colonies of passage one and two had embryonic-like morphology, and were surrounded by clear boundaries. This characteristic is very important to distinguish embryonic-like colonies from feeder cell cluster. Colony 6 of passage one was treated to Trysin-EDTA and culture in petri dish with embryonic stem cell medium without leukemia inhibitory factor. Some embryoid bodies were formed in two weeks. This result supported the pluripotent property of these embryonic stem-like cells. Keywords: bovine embryo, embryonic-like colony, embryonic stem cells, pluripotency, whole emrbyo culture. Ngày nhận bài: 21-6-2012.