Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng chống oxy hóa của hạ khô thảo nam (Blumea lacera (Burn.F.) DC)

t¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2018 5 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA HẠ KHÔ THẢO NAM (Blumea lacera (Burn.F.) DC) Trịnh Khánh Linh1; Trần Văn Cường1; Nguyễn Văn Thư2 TÓM TẮT Mục tiêu: định tính thành phần hóa học, định lượng flavonoid toàn phần và đánh giá tác dụng chống oxy hóa của các phân đoạn dịch chiết cây Hạ khô thảo nam (Blumea lacera). Đối tượng và phương pháp: định tính phân đoạn dịch chiết từ phần trên mặt đất của Hạ khô thảo nam qua một số nhóm hợp chất hóa học bằng các phản ứng hóa học đặc trưng, định lượng flavonoid toàn phần bằng phương pháp tạo màu với AlCl3 trong môi trường kiềm-trắc quang, đánh giá tác dụng chống oxy hóa thông qua khả năng dọn gốc tự do DPPH (2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl). Kết quả và kết luận: Hạ khô thảo nam có chứa một số nhóm hợp chất như alcaloid, flavonoid, tanin, saponin, sterol, terpenoid, polysaccharid, carotenoid. Hàm lượng flavonoid toàn phần đạt 13,08 mg/g. Các phân đoạn dịch chiết Hạ khô thảo nam đều thể hiện hoạt tính chống oxy hóa, trong đó phân đoạn BLE có tác dụng tốt nhất. * Từ khóa: Hạ khô thảo nam; Dọn gốc tự do; Hóa thực vật; Chống oxy hóa. Phytochemical Investigation and Antioxidant Activity of Blumea lacera (Burn.F.) DC Summary Objectives: To evaluate the phytochemical constituents and to investigate the antioxidant activity of extracts from aerial part of Blumea lacera. Materials and methods: Crude ethanol extract from aerial part of B. lacera and its derived fractions were assessed for phytochemical classes. Total flavonoid content was determined by aluminium chloride colorimetric method. Antioxidant activity was determined using 2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) free radical scavenger methods. Results and conclusion: B. lacera is a source of various phytoconstituents such as alkaloids, flavonoids, tannins, saponin, sterol, carotenoid, polysaccharide and terpenoids. Total flavonoids in the methanol extract were 13.08 ± 1.23 mg/g quercetin equivalents. With regards to DPPH experiments, all of the fractions from ethanol extract showed DPPH free radical scavenging capacity. The highest activity was obtained from the fraction ethyl acetate with the SC50 value of 18.56 mg/mL. * Keywords: Blumea lacera; Free radical scavenging; Phytochemical; Antioxidant. 1. Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội 2. Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Văn Thư (thu_vmmu@hotmail.com) Ngày nhận bài: 10/08/2018; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 15/09/2018 Ngày bài báo được đăng: 26/09/2018 T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2018 6 ĐẶT VẤN ĐỀ Hạ khô thảo nam có tên khoa học là Blumea lacera (Burn.f.) DC., thuộc họ Cúc (Asteraceae). Theo Đông y, Hạ khô thảo nam được dùng làm thuốc trị tràng nhạc, nhọt lở, cầm máu vết thương, băng huyết, chảy máu cam, tức ngực, ho có đờm, táo bón, mất ngủ, đái vàng và nóng [1]. Hạ khô thảo nam có nhiều tác dụng sinh học như gây độc đối với một số dòng tế bào ung thư (dạ dày, ruột kết, ung thư vú), kháng bệnh bạch cầu in vitro, ức chế Herpes virut týp 1 và 2 (HSV1 và HSV2), kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxy hóa, tiểu đường [3, 4, 5, 6, 7]. Nhiều nghiên cứu trước đây cho thấy Hạ khô thảo nam có chứa các nhóm hoạt chất flavonoid, terpen glycosid, polyphenol, tinh dầu, terpenoid keton, sterol [8]. Ở Việt Nam, nguồn nguyên liệu Hạ khô thảo nam rất dồi dào nhưng nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của dược liệu này vẫn còn hạn chế. Bài báo này trình bày kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng chống oxy hóa của một số phân đoạn dịch chiết cây Hạ khô thảo nam. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Đối tượng, vật liệu nghiên cứu. * Đối tượng nghiên cứu: Phần trên mặt đất của cây Hạ khô thảo nam được thu hái năm 2018 tại Sa Pa (Lào Cai). Mẫu được Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam thẩm định tên khoa học. * Hóa chất và dung môi: Chất chuẩn axít gallic (hàm lượng ≥ 98%) và thuốc thử folin - ciocalteu (Hãng Sigma Aldrich). Chất chuẩn quercetin hàm lượng 90,87% (Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ương). Các dung môi, hóa chất trong phòng thí nghiệm: ethanol (EtOH), methanol (MeOH), ethyl acetat (EtOAc), dicloromethan (DCM), n-hexan, natri carbonat, nhôm clorid, axít acetic, natri acetat (Hãng Merck); axít ascorbic, DPPH (Hãng Sigma) đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích. * Thiết bị: Máy đo hàm ẩm tự động Shimadzu- Moc 63U (Nhật Bản); máy đo quang UV-Vis Biochrom Libra S70 PC (Anh); cân phân tích Mettler Toledo độ chính xác 0,1 mg (Trung Quốc); máy chiết siêu âm gia nhiệt Sineo Uwave - 1000 (Trung Quốc); pipet chính xác, bình định mức (loại A); cốc có mỏ, bình nón, ống nghiệm các loại và những dụng cụ, thiết bị khác đạt tiêu chuẩn phòng thí nghiệm. 2. Phương pháp nghiên cứu. * Chiết xuất các phân đoạn dịch chiết: Cân 1,1 kg bột thô phần trên mặt đất của cây Hạ khô thảo nam, chiết hồi lưu 3 lần với EtOH 96%, để nguội, lọc, tập trung dịch lọc, bốc hơi dung môi dưới áp suất giảm thu được cắn EtOH. Sau đó, phân tán cắn EtOH trong nước nóng (70oC), lần lượt lắc với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, dicloromethan, ethyl acetat thu được các phân đoạn dịch chiết. Các phân đoạn được cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm, thu được cắn n-hexan (BLH; 5,2 g), cắn dicloromethan (BLD; 10,7 g), cắn ethyl acetat (BLE; 8,6 g). t¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2018 7 Phần dịch nước còn lại cô dưới áp suất giảm, sấy khô đến cắn (BLW; 17,9 g). * Định tính các nhóm hợp chất hữu cơ bằng phản ứng hóa học đặc trưng: Tiến hành phản ứng hóa học đặc trưng theo quy trình về phương pháp nghiên cứu cây thuốc [2]. * Định lượng flavonoid toàn phần: Định lượng flavonoid toàn phần theo phương pháp có biến đổi của Meda và CS [9]. Dung dịch quercetin chuẩn: pha quercetin chuẩn trong MeOH:H2O (1:1) có nồng độ 1 mg/ml. Từ chuẩn gốc pha ra thành các dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ 175, 150, 125, 100 và 75 µg/ml. Dung dịch thử: cân chính xác 10,0 g bột dược liệu cho vào bình nón 250 ml, thêm 150 ml dung dịch MeOH:H2O (1:1), chiết siêu âm ở 50oC trong 60 phút (150 ml/lần × 3 lần), lọc thu được dịch chiết. Dịch chiết được cô thu hồi dung môi còn 1/5 thể tích, sau đó thủy phân bằng dung dịch HCl 20% ở 85oC trong 3 giờ. Dịch đã thủy phân để nguội, lắc với 15 ml ethylacetat (15 ml/lần × 3 lần), gộp các dịch chiết cho vào bình định mức 50 ml và bổ sung dung môi đến vạch. Phản ứng tạo màu: hút chính xác 1 ml dung dịch phân tích (dung dịch chuẩn hoặc dung dịch thử) cho vào bình định mức 25 ml, thêm 0,5 ml dung dịch natri citrat 1%. Thêm tiếp 2,0 ml dung dịch AlCl3 0,5%. Sau đó, bổ sung dung dịch axít acetic 5% pha trong methanol đến vạch. Lắc đều, để yên 45 phút, tiến hành đo quang ở bước sóng 425 nm. Hàm lượng flavonoid toàn phần được tính theo công thức sau: At - b X (mg/g) = m.a.(100 - h) × 125 Trong đó: X (mg/g): hàm lượng flavonoid toàn phần ở phần trên mặt đất của Hạ khô thảo nam. At: độ hấp thu ở bước sóng 425 nm của mẫu thử. m: khối lượng dược liệu (g). a, b: các hệ số trong phương trình tuyến tính của chất chuẩn y = ax + b. h: độ ẩm của dược liệu. * Đánh giá tác dụng chống oxy hóa của một số phân đoạn dịch chiết Hạ khô thảo nam thông qua khả năng loại gốc tự do (GTD) DPPH: Tiến hành thực nghiệm theo phương pháp của Yuvaraj và CS (2013) [10] có cải tiến cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm. Mẫu thử là cắn của phân đoạn dịch chiết được pha trong DMSO thành dải nồng độ: 90, 45, 9, 1 mg/ml. DPPH pha trong methanol (100%) ở nồng độ 0,25 µM. Hút 1 ml mẫu nghiên cứu đã pha ở các nồng độ vào ống thủy tinh. Mỗi nồng độ thử chất lặp lại 2 lần. Thêm 1 ml dung dịch DPPH đã chuẩn bị ở trên vào các ống đã có sẵn mẫu nghiên cứu. Ống không có mẫu thử, chỉ có 1 ml nước và 1 ml DPPH làm đối chứng âm. Ủ ở 37oC trong 30 phút. Xác định độ hấp thụ của dung dịch sau phản ứng tại bước sóng 517 nm trên máy đọc ELISA. Khả năng trung hòa GTD (Scavenging Activities - SA) sinh ra từ DPPH của mẫu thử được tính theo công thức sau: T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2018 8 (ODđối chứng - ODmẫu thử) % SA = ODđối chứng × 100 Trong đó: ODđối chứng: độ hấp thụ tại giếng không chứa chất thử. ODmẫu thử: độ hấp thụ tại giếng chứa chất thử. Lập phương trình biểu thị mối tương quan giữa khả năng chống oxy hóa và nồng độ chất thử, xác định nồng độ có khả năng chống oxy hóa bằng 50%. Điểm nồng độ đó là SC50, giá trị SC50 được xác định dựa vào phương trình y = ax + b, trong đó y là khả năng loại bỏ GTD, a và b là các hệ số trong phương trình y = ax + b. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 1. Định tính các nhóm hợp chất hữu cơ bằng phản ứng hóa học. Bảng 1: Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ từ phần trên mặt đất cây Hạ khô thảo nam. Thứ tự Nhóm chất Phản ứng định tính Kết quả Kết luận Phản ứng với thuốc thử Mayer + Phản ứng với thuốc thử Bouchardat + 1 Alcaloid Phản ứng với thuốc thử Dragendorff + Có Phản ứng Liebermann - Burchard - Phản ứng Legal - Phản ứng Baljet - 2 Glycosid tim Phản ứng Keller - Kiliani - Không 3 Anthranoid Phản ứng Borntrager - Không Phản ứng Cyanidin ++ Phản ứng với kiềm ++ 4 Flavonoid Phản ứng với FeCl3 5% +++ Có Phản ứng đóng mở vòng lacton - 5 Coumarin Phản ứng diazo hóa - Không 6 Saponin Phản ứng tạo bọt ++ Có Phản ứng với FeCl3 5% +++ Phản ứng với gelatin 1% ++ 7 Tanin Phản ứng với chì acetat 10% ++ Có 8 Axit hữu cơ Phản ứng với Na2CO3 ++ Có 9 Đường khử Phản ứng với thuốc thử Fehling ++ Có 10 Polysaccharid Phản ứng với thuốc thử Lugol ++ Có 11 Chất béo Tọa vết mờ trên giấy - Không 12 Sterol Phản ứng Liebermann - Burchard + Có 13 Carotenoid Phản ứng với H2SO4 đặc + Có t¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2018 9 Phần trên mặt đất cây Hạ khô thảo nam có chứa các hợp chất thuộc nhóm alcaloid, flavonoid, tanin, saponin, sterol, axít hữu cơ, carotenoid, polysaccharid và đường khử. Kết quả nghiên cứu phù hợp với các tác giả khác về định tính nhóm hợp chất hữu cơ trong cây Hạ khô thảo nam. Ahmed và CS (2014) nghiên cứu định tính các nhóm hoạt chất cho thấy Hạ khô thảo nam có chứa nhóm hợp chất carbohydrat, flavonoid, alcaloid, terpenoid và steroids ở phân đoạn dịch chiết phân cực [11]. Nghiên cứu của Pattewar và CS (2012) cũng chứng minh sự có mặt của tanin, alcaloid, saponin, anthraquinone glycosid, steroid, flavonoid, phenolic và terpenoid từ dịch chiết nước của Hạ khô thảo nam [12]. Ngoài ra, Tiwari và CS (2012) cũng báo cáo sự có mặt của các hợp chất steroid, terpenoid, alcaloid, saponin, nhưng không có mặt của nhóm hợp chất tanin và phenolic [13]. 2. Định lượng flavonoid toàn phần. * Kết quả xây dựng đường chuẩn: Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn quercetin (75 - 150 µg/ml). Thực hiện phản ứng tạo màu với các thuốc thử. Sau khi ổn định màu, đo quang phổ UV-VIS ở bước sóng 425 nm, đánh giá sự phụ thuộc của độ hấp thụ quang với nồng độ dung dịch. Bảng 2: Sự phụ thuộc của độ hấp thụ vào nồng độ dung dịch quercetin chuẩn. Thứ tự Nồng độ (µg/ml) Độ hấp thụ 1 75 0,223 2 100 0,328 3 125 0,393 4 150 0,464 5 175 0,563 Đường chuẩn Y = 0,0033X - 0,0138 R2 0,9929 Hình 1: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ vào nồng độ dung dịch quercetin chuẩn. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2018 10 Có mối tương quan tuyến tính giữa mật độ quang và nồng độ quercetin tại bước sóng 425 nm theo phương trình y = 0,0033x - 0,0138 với hệ số tương quan r2 = 0,9929. Như vậy, có thể sử dụng phương trình đường chuẩn để tính hàm lượng flavonoid toàn phần trong dịch chiết Hạ khô thảo nam. * Kết quả định lượng flavonoid toàn phần: Tiến hành định lượng flavonoid toàn phần trong các mẫu Hạ khô thảo nam thu hái tại Sa Pa. Bảng 3: Kết quả định lượng flavonoid toàn phần từ phần trên mặt đất của cây Hạ khô thảo nam. Mẫu Khối lượng (g) Hàm lượng flavonoid toàn phần tính theo quercetin (mg/g) 1 10,00 12,54 2 10,10 14,76 3 10,05 13,87 4 10,02 12,57 5 10,00 11,64 X ± SD 10,03 ± 0,04 13,08 ± 1,23 Hàm lượng flavonoid toàn phần của phần trên mặt đất cây Hạ khô thảo nam là 13,08 ± 1,23 mg/g tính theo quercetin. Chứng tỏ Hạ khô thảo nam có chứa hàm lượng khá lớn flavonoid. Đây là nhóm hợp chất thể hiện nhiều hoạt tính sinh học tốt. Do đó, kết quả nghiên cứu này có thể định hướng trong nghiên cứu tác dụng sinh học tiếp theo như chống oxy hóa, bảo vệ tế bào gan, giải độc 3. Đánh giá tác dụng chống oxy hóa của một số phân đoạn dịch chiết Hạ khô thảo nam thông qua khả năng loại GTD DPPH. Bảng 4: Hoạt tính loại GTD của phân đoạn dịch chiết Hạ khô thảo nam. Nồng độ mẫu thử (mg/ml) BLH BLD BLE BLW 1 2,25 3,56 11,45 13,61 9 9,72 12,31 59,61 18,68 45 21,17 36,5 90,5 48,38 90 33,15 57,99 89,63 83,37 SC50 138,22 73,54 18,56 47,62 t¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2018 11 Hình 2: Hoạt tính dọn GTD của các phân đoạn dịch chiết Hạ khô thảo nam. Hoạt tính loại bỏ GTD có sự khác biệt giữa các phân đoạn dịch chiết ở nồng độ 1,0; 9; 45 và 90 mg/ml. So sánh giá trị SC50 của các phân đoạn dịch chiết cho thấy ở Hạ khô thảo nam, phân đoạn dịch chiết có tác dụng dọn GTD theo thứ tự BLH < BLD < BLW < BLE. Điều này được giải thích là do trong phân đoạn dịch chiết ethyl acetat có thành phần hóa học chủ yếu là flavonoid và phenolic, là những hợp chất có khả năng chống oxy hóa tốt, do trong công thức cấu tạo của những hợp chất này có nhiều nhóm hydroxyl (-OH) phenol. Số lượng và vị trí của các nhóm hydroxyl (hydroxyl thế ở vị trí ortho) là những đặc điểm cấu trúc quan trọng ảnh hưởng đến khả năng chống oxy hóa của hợp chất phenolic. Do vậy, các hợp chất thuộc những nhóm trên có khả năng nhường một nguyên tử hydrogen từ gốc hydroxyl của chúng cho GTD để hình thành gốc phenoxyl bền vững. Thử nghiệm DPPH là phương pháp thường được sử dụng để đánh giá tác dụng chống oxy hóa do có nhiều ưu điểm như tiến hành nhanh, dễ thực hiện, có độ tin cậy cao và không đòi hỏi thiết bị cũng như hóa chất đặc biệt. Ngoài ra, DPPH có độ ổn định cao, tổng hợp ra GTD không bị phân hủy trong nước, methanol hoặc ethanol. Khả năng dọn GTD của phân đoạn dịch chiết phụ thuộc vào khả năng chống oxy hóa các chất có trong thành phần dịch chiết làm mất hydrogen và hình dạng cấu trúc của những thành phần đó. KẾT LUẬN Đã đánh giá được hoạt tính chống oxy hóa của các phân đoạn dịch chiết từ phần trên mặt đất của cây Hạ khô thảo nam thông qua khả năng dọn GTD DPPH. Kết quả cho thấy, phân đoạn dịch chiết ethyl acetat có thành phần chủ yếu là các hợp chất flavonoid và phenolic có hoạt tính chống oxy hóa mạnh hơn so với những phân đoạn còn lại. Nghiên cứu cũng xác định Hạ khô thảo nam là nguồn hợp chất chống oxy hóa tự nhiên tiềm năng với nhiều hợp chất tự nhiên như alcaloid, T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2018 12 flavonoid, tanin, saponin, sterol, terpenoid, polysaccharid, carotenoid. Đặc biệt, bộ phận trên mặt đất Hạ khô thảo nam có hàm lượng flavonoid đạt 13,08 mg/g. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Võ Văn Chi. Từ điển Cây thuốc Việt Nam. Nhà xuất bản Y học. 1997, tr.170. 2. Ngô Vân Thu, Trần Hùng. Dược liệu học, tập 1. Nhà xuất bản Y học. Hà Nội. 2013, tr.223-227. 3. Uddin S.J, Grice I.D, Tiralongo. Cytotoxic effects of Bangladeshi Medicinal Plant Extracts. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2011, pp.578-1092. 4. Chiang L.C, Cheng H.Y, Chen C.C, Lin C.C. In vitro anti-leukemic and antiviral activities of traditionally used medicinal plants in Taiwan. American Journal of Chinese Medicine. 2004, 32 (5), pp.695-704. 5. Shahwar D, Ullah S, Ahmad N, Ullah S, Khan M.A. Antibacterial and antioxidant activities of two Asteracious species growing in Pakistan. Asian Journal of Chemistry. 2010, 22 (4), pp.3246-3254. 6. Shahwar D, Ullah S, Ahmad N, Ullah S, Ahmad N. Anti-diabetic activity of the methanolic extract of Blumea lacera DC (Asteraceae) in alloxan-induced diabetic rats. Asian Journal of Chemistry. 2011, 23 (12), pp.5403-5406. 7. Ragasa C.Y, Wong J, Rideout J.A. Monoterpene glycoside and flavonoids from Blumea lacera. Journal of Natural Medicines. 2007, 61 (4), pp.474-475. 8. Akter R, Uddin S.J, Tiralongo J, Grice I.D, Tiralongo E. A new cytotoxic steroidal glycoalkaloid from the methanol extract of Blumea lacera leaves. Journal of Pharmacy & Pharmaceutical Sciences. 2015, 18 (4), pp.616-633. 9. Meda A, Lamien C.E, Romito M, Millogo J, Nacoulma O.G. Determination of the total phenolic, flavonoid and proline contents in Burkina Fasan honey, as well as their radical scavenging activity. Food Chemistry. 2005, 91 (3), pp.571-577. 10. Yuvaraj P, Subramoniam A, Louis T, Madhavachandran V, Narasu M.L. Attenuation of expression of cytokines, oxidative stress and inflammation by hepatoprotective phenolic acids from Thespesia populnea Soland ex Correa stem bark. Annals of Phytomedicine. 2013, 2, pp.47-56. 11. Ahmed F.A, Rahman A, Mubassara S. Phytochemical composition, antioxidant activity and cytotoxicity of Blumea lacera Linn. from two different habitats. Jahangirnagar University Journal of Biological Sciences. 2014, 3 (1), pp.37-45. 12. Pattewar A.M, Dawalbajea A.B, Gundalea D.M, Pawarb P.B, Kavtikwara P.G, Yerawara P.P, Pandharkara T.M, Patawara V.A. Phytochemistryical & anthelmintic studies on Blumea lacera. Indo Global Journal of Pharmaceutical Sciences. 2012, 2 (4), pp.390-396. 13. Tiwari P, Saluja G, Pandey A.S, Sharma N. Isolation and biological evaluation of some novel phytoconstituents from Blumea lacera (Burn F.) D.C. International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 2012, 4 (4), pp.148-150.