Nghiên cứu thành phần hóa học từ lá trứng cá

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 99 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC TỪ LÁ TRỨNG CÁ Lê Thị Thu Hồng*, Võ Văn Lẹo** TÓM TẮT Đặt vấn đề: Ở Việt Nam lá Trứng cá được sắc uống để điều kinh, trị các bệnh về gan, được trồng rộng rãi và chưa nhiều nghiên cứu. Đó là lý do tiến hành đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học của lá cây Trứng cá (Muntingia calabura L.)”. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Lá Trứng cá thu hái tại thành phố Biên Hòa, tỉnh Đồng Nai vào tháng 06/2017. Sử dụng phương pháp chiết ngấm kiệt với cồn 80%, phân bố lỏng – lỏng, sắc ký cột pha thuận, và các phương pháp tinh chế để phân lập các hợp chất tinh khiết. Xác định cấu trúc các chất đã phân lập bằng phương pháp phổ học (UV, MS, NMR). Kết quả: Từ 10 kg bột dược liệu chiết ngấm kiệt, loại chlorophyll, lắc phân bố lỏng-lỏng, loại dung môi thu được cao n-hexan (8,02 g), chloroform (49,06 g), ethyl acetat (261,26 g). Từ 60 g cao ethyl acetat phận lập được 2 flavonoid và 2 hợp chất phenol lần lượt là: quercetin (232 mg) (1), isoquercitrin (25 mg) (4), acid gallic (870 mg) (2) và davidiin (90 mg) (3). Kết luận: Davidiin và isoquercitrin lần đầu tiên được phân lập từ lá Trứng cá. Từ khóa: lá Trứng cá ABSTRACT STUDIES ON CHEMICAL CONSTITUENTS FROM LEAVES OF MUNTINGIA CALABURA L. MUNTINGIACEAE Le Thi Thu Hong, Vo Van Leo * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 – No. 4 - 2019: 99 – 103 Objectives: To isolate and identify chemical constituents of leaves of Muntingia calabura L. Materials and Methods: Leaves of Muntingia calabura were collected in Bien Hoa in June, 2017. Percolation, liquid-liquid distribution, column chromatography and other purification methods were used for extraction and isolation. The structures of compounds were identified, using spectrometric methods: UV, MS and NMR, in comparison with literature data. Results: 10 kg dried leaves of M. calabura was extracted with ethanol 80%. Afterwards, the solvent was evaporated to get a condense Ethanol 80% extract. Ethanol 80% extract was partitioned with the solvents of increasing polarities to obtain four fractions after evaporation: n-hexan extract (8.02 g), chloroform extract (49.06 g) and ethyl acetate extract (261.26 g), respectively. Two flavonoids together with two other phenoilc compounds: quercetin, isoquercitrin, gallic acid, and davidiin, were isolated from 60 g ethyl acetate extract. Conclutions: Davidiin and isoquercetin were isolated from M. calabura for the first time. Keywords: Muntingia calabura L. ĐẶT VẤN ĐỀ Cây Trứng cá (Mungtingia calabura L.) có nguồn gốc nhiệt đới châu Mỹ. Ở Việt Nam cây Trứng cá được trồng rộng rãi. Flavonoid là thành phần hóa học chính được phân lập từ lá Trứng cá. Từ lâu ở Việt Nam lá Trứng cá được sắc uống để lợi kinh và trị các bệnh về gan(9). Trên thế giới có nhiều nghiên cứu về tác dụng *Khoa Dược, Đại học Lạc Hồng **Khoa Dược, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: ThS. Lê Thị Thu Hồng ĐT: 0388306182 Email: hongle5792@gmail.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 100 của lá Trứng cá như kháng khuẩn, kháng viêm, độc tế bào và hoạt tính chống oxy hóa(5). Ở Việt Nam chưa có nhiều công bố về các chất phân lập đươc từ cây Trứng cá. Mục tiêu nghiên cứu Chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc hóa học các chất từ lá Trứng cá (Muntingia calabura L.). NGUYÊN LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu thí nghiệm. Nguyên liệu Nguyên liệu là lá của cây Trứng cá (10 kg) thu hái tại thành phố Biên Hòa, tỉnh Đồng Nai vào tháng 6/2017. Mẫu dược liệu đã được TS. Võ Văn Chi, nguyên giảng viên Bộ môn Dược liệu, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh định danh, xác định tên khoa học là Muntingia calabura L., thuộc họ Trứng cá (Muntingiaceae). Mẫu nghiên cứu hiện đang được lưu giữ tại Bộ môn Dược liệu, Khoa Dược, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh với mã MC-01. Dung môi hóa chất, trang thiết bị Dung môi sử dụng trong nghiên cứu là các dung môi đạt tiêu chuẩn tinh khiết dùng trong phân tích hợp chất tự nhiên, bao gồm ethanol, methanol, n-hexan, chloroform và ethyl acetat, nguồn gốc Trung quốc. Sắc ký lớp mỏng thực hiện trên bản mỏng silica gel F254 (Merck). Phát hiện bằng đèn UV ở 2 bước sóng UV 254 nm, UV 365 nm, thuốc thử VS (vanillin sulphuric) và thuốc thử FeCl3 5% trong cồn. Sắc ký cột tiến hành với silica gel pha thuận, Trung Quốc, cỡ hạt 0,040-0,063 mm. Phổ khối (ESI-MS) được đo trên máy ALIGENT 1100 MC-LSD Trap của Viện công nghệ hóa học. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HSQC, HMBC được đo trong dung môi DMSO-d6 trên máy Bruker AM 500 FT-NMR spectrometer của Viện hóa học, Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam. Chiết xuất, phân lập Bột khô (10 kg) được chiết ngấm kiệt bằng ethanol 80%. Cô thu hồi dung môi, thu được 1,5 lít cao toàn phần, để lạnh loại chlorophyll. Cao toàn phần sau khi loại chlorophyll được thêm nước, lắc phân bố với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, chloroform, ethyl acetat. Cô thu hồi dung môi thu được các cao: hexan (8,02 g), chloroform (40,06 g), ethyl acetat (216,26 g). Tiến hành sắc ký cột nhanh với 60 g cao phân đoạn ethyl acetat thu được 15 phân đoạn (PĐ 1-15). Tủa từ phân đoạn PĐ- 5, 7, 14 được lọc rửa, kết tinh lại trong methanol thu được hợp chất 1 (232 mg), 2 (870 mg), 3 (90 mg). Phân đoạn 15 được triển khai qua sắc ký cột cổ điển với hệ dung môi chloroform-methanol với tỉ lệ methanol tăng dần thu được 8 phân đoạn 15A-15H. Từ phân đoạn 15E thu được hợp chất 4 (25 mg). KẾT QUẢ Hợp chất 1 Bột vô định hình màu vàng, cho màu vàng với thuốc thử vanillin-sulfuric. Phổ ESI-MS m/z [M-H]- = 301,20, ứng với khối lượng phân tử 302, công thức phân tử C15H10O7. Phổ 13C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz): 146,8 (C-2); 135,6 (C-3); 175,8 (C-4); 160,6 (C-5); 98,1 (C-6); 163,8 (C-7); 93,3 (C-8); 156,1 (C-9); 103,0 (C-10); 121,9 (C-1’); 115,0 (C-2’); 145,0 (C-3’); 147,6 (C-4’); 115,5 (C-5’); 119,9 (C-6’). Phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz): 6,18 d (2) (H-6); 6,40 d (2) (H-8); 7,67 d (2) (H-2’); 6,88 d (8) (H-5’); 7,53 dd (8;2) (H-6’). Phổ 13C- NMR có tín hiệu ứng với 15 carbon, không có tín hiệu đối xứng, δCmax 175,9 <180. Dự đoán hợp chất 1 có khung flavonol với vòng B có nhóm thế không đối xứng. Phổ 1H-NMR có 1 tín hiệu δH 12,47 s đặc trưng cho proton OH-5. Hai tín hiệu proton doublet ghép cặp meta 6,40 (1H, d, J=2 Hz) và 6,18 (1H, d, J=2 Hz) điển hình cho proton ở vị trí C-6, C-8 của vòng A. Bộ ba tín hiệu proton δH 7,53 (H, dd, J=8; 2 Hz), 7,67 (H, d, J= 2 Hz) và 6,88 (H, d, J= 8 Hz) ghép cặp meta, ortho Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 101 đặc trưng cho tín hệu proton vòng B với 2 nhóm thế OH ở vị trí 3’,4’. Kết hợp các dữ liệu và so sánh với tài liệu tham khảo(2) hợp chất 1 được xác định là quercetin. Hợp chất 2 Chất kết tinh không màu, không màu với thuốc thử vanillin-sulfuric. Phổ ESI-MS m/z [M- H]- =168,85, ứng với khối lượng phân tử 170. Ngoài ra còn có 1 phân mảnh m/z 125 = [M-H- 44]- dự đoán hợp chất 2 có 1 nhóm –COOH. Phổ 13C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz): 120,5 (C-1); 108,7 (C-2/6); 145,5 (C-3/5); 138,0 (C-4); 167,4 (>C=O). Phổ 11H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz): 6,92 s (H-2/6); 9,13 s (OH-3/5); 12,16 s (>COOH). Phổ 13C-NMR có 5 tín hiệu, trong đó 2 tín hiệu đối xứng với ∆δC= 36,77, δCmax 167,4, tất cả tín hiệu đều có độ dịch chuyển trên 100 ppm. Vậy hợp chất 2 có 7 carbon với 1 vòng thơm 3 nhóm thế, 1 nhóm –COOH. Phổ 1H-NMR có tín hiệu proton đối xứng của vòng thơm δH 6,18 s. Kết hợp tất cả dữ liệu và so sánh với tài liệu tham khảo(8) hợp chất 2 được xác định là acid gallic. Hợp chất 3 Bột vô định hình không màu và không màu với thuốc thử vanillin-sulfuric. Phổ ESI-MS m/z [M-H]- =937,0951, ứng với khối lượng phân tử 938, công thức phân tử C41H29O26. Phổ 13C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz): Glucose 94,5 (C-1); 71,4 (C-2); 68,8 (C-3); 71,2 (C-4); 75,4 (C-5); 64,1(C-6); HHDP: 116,04 (C-1’); 122,67 (C-2’); 106,96 (C-3’); 143,87 (C-4’); 135,77 (C-5’); 144,53 (C-6’); 165,92 (C-7’); 115,49 (C-1”); 123,51 (C-2”); 106,92 (C-3”); 144,10 (C-4”); 135,54 (C-5”); 144,76 (C-6”); 167,29 (C-7”); Gallic-II: 117,87 (C-1-II); 108,87 (C-2/6-II); 143,37 (C-3/5-II); 138,99 (C-4-II); 164,45 (C-7-II); Gallic-III: 118,20 (C-1-III); 108,97 (C-2/6-III); 1145,53 (C-3/5-III); 138,16 (C-4-III); 164,91 (C-7- III); Gallic-IV: 118,02 (C-1-IV); 108,97 (C-2/6-IV), 145,51 (C-3/5-IV); 139,12 (C-4-IV); 165,33(C-7-IV). Phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz): Glucose 5,94 d (4,5) (H-1); 5,58 dd (10;4) (H-2); 5,71 t (H-3); 5,18 dd (9;3,5) (H-4); 4,38 t (H-5); 5,56 t và 4,30 m (H-6); 6,56 s (1H, H-3’); 6,58 s (1H, H-3”); 6,93 s (2H, H-2/6-II); 6,86 s (2H, H-2/6-III); 6,88 s (2H, H-2/6-IV). Phổ 13C-NMR hợp chất 3 có 35 tín hiệu carbon, trong đó có 3 cặp tín hiệu carbon đối xứng cách nhau khoảng 30 ppm, 5 tín hiệu carbonyl C=O ở δC 167,29; 165,92; 165,33; 164,91; 164,45 đặc trưng cho acid gallic; 5 tín hiệu carbon trong vùng 60-80 ppm, 1 tín hiệu carbon δC 94,5 đặc trưng cho đường 6 carbon. Phổ 1H-NMR có tín hiệu proton của vòng thơm 6,93 s (2H); 6,88 s (2H); 6,86 s (2H) và 6,58 s (1H); 6,56 s (1H). Dự đoán hợp chất 3 có 41 carbon trong phân tử có 5 acid gallic gắn vào phân tử đường, trong đó có 2 acid gallic nối với nhau tạo khung hexahydroxydiphenol (HHDP), làm mất tính đối xứng của acid gallic, giảm 2 tín hiệu proton. Từ phổ 1H-NMR, HSQC, HMBC, COSY xác định được đường 6 carbon là đường β-D-glucose, khung HHDP gắn OH vị trí số 1,6 của đường. Kết hợp tất cả dữ liệu và so sánh với tài liệu tham khảo(3) hợp chất 3 được xác định là davidiin (2,3,4-tri-O-galloyl-1,6-(S)-hexahydroxydiphenoyl- β-D-glucopyranosid). Hợp chất 4 Bột vô định hình màu vàng, cho màu vàng với thuốc thử vanillin-sulfuric. Phổ ESI-MS m/z [M-H]- = 463,05, ứng với khối lượng phân tử 464, công thức phân tử C21H20O12. Phổ 13C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz): 156,1 (C-2); 133,3 (C-3); 177,4(C-4); 161,2 (C-5); 98,8 (C-6); 164,5 (C-7); 93,6 (C-8); 156,3 (C-9); 103,8 (C-10); 121,1 (C-1’); 115,2 (C-2’); 144,8 (C-3’); 148,5 (C-4’); 116,1 (C-5’); 121,6 (C-6’); 100,9 (C-1’’’); 74,3 (C-2’’’); 76,7 (C-3’’’); 70,2(C-4’’’); 77,8 (C-5’’’); 61,0 (C-6’’’). Phổ 1H- NMR (DMSO-d6, 500 MHz): 6,19 d (2) (H-6); 6,39 d (2) (H-8); 7,56 d (2) (H-2’); 6,84 d (9) (H-5’); 7,57 m (H-6’). Phổ 13C-NMR có 21 tín hiệu carbon, trong đó δCmax 177,4, không có tín hiệu carbon đối xứng, 8 tín hiêu carbon downfiled >130 ppm. Kết hợp với phổ 1H-NMR có tín hiệu proton δH 12,62 s, hai tín hiệu proton ghép cặp meta δH 6,18 (1H, d, J=2 Hz) và 6,39 (1H, d, J=2 Hz) dự đoán hợp chất 4 có khung quercetin. 5 tín hiệu carbon trong vùng dịch chuyển từ 60-80 ppm, 1 tín hiệu carbon δC 100,9 và tín hiệu proton δH 6,18 5,44 d (7,5 Hz) đặc chưng cho tín hiệu đường β-D- Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 102 glucose. Từ phổ HMBC tín hiệu 5,44 d (7,5 Hz) H-1 amomer của đường tương tác với carbon δC 133 (C-3) nên đường gắn OH vị trí C-3 của khung quercetin. Kết hợp các dữ liệu và so sánh với tài liệu tham khảo(1) hợp chất 4 được xác định là isoquercitrin (quercetin-3-O-β-D- glucopyranosid). Hình 1. Công thức hóa học và các tương tác HMBC chính của các chất phân lập được BÀN LUẬN Bốn hợp chất phân lập được từ phân đoạn ethyl acetat của lá Trứng cá có hai flavonoid là quercetin, isoquercitrin, một acid hữu cơ là acid gallic, một tanin là davidiin. Quercetin đã được báo cáo phân lập từ lá Trứng cá năm 1990(6). Isoquercitrin lần đầu tiên được báo cáo trong cây Trứng cá. Hai flavonoid này phổ biến trong dược liệu. Davidiin là một ellagitannin lần đầu tiên được phân lập từ lá Trứng cá Muntingia calbura L.. Năm 1982 davidiin được báo cáo phân lập lần đầu tiên từ loài Davidia involucrata sau đó nhiều báo cáo phân lập từ các loài Polygonum capitatum, Acer saccharum, Antidesma pentandrum(4,10,11). Davidiin đã được nghiên cứu có tác dụng chống ung thư biểu mô tế bào gan, là chất tiềm năng trong chống ung thư tế bào gan, có tác dụng ức chế liên quan đến thụ thể µ- opioid(7,10). KẾT LUẬN Bốn hợp chất 1-4 phân lập từ phân đoạn ethylacetat của lá Trứng cá lần lượt xác định là quercetin, acid gallic, davidiin, isoquercitrin. Trong đó hợp chất davidiin (3) là một tanin lần đầu tiên được phân lập từ lá Trứng cá. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Deepralard K, et al (2009). "Flavonoid glycosides from the leaves of Uvaria rufa with advanced glycation end-products inhibitory activity". Thai Journal of Pharmaceutical Sciences, 33:84-90. 2. Güvenalp Z, et al (2005). "Flavonol glycosides from Asperula arvensis L". Turkish Journal of Chemistry 29(2):163-169. 3. Haddock EA, et al (1982). "The metabolism of gallic acid and hexahydroxydiphenic acid in plants. Part 3. Esters of (R)-and (S)- hexahydroxydiphenic acid and dehydrohexahydroxydiphenic acid with D-glucopyranose (1C4 and related conformations)". Journal of the Chemical Society, Perkin Transactions 1, pp.2535-2545. 4. Hatano T, et al (1990). "Gallotannins having a 1, 5-anhydro-D- glucitol core and some ellagitannins from Acer species". Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 38(7):1902-1905. 5. Mahmood N, et al (2014). "Muntingia calabura: a review of its traditional uses, chemical properties, and pharmacological observations". Pharmaceutical biology, 52(12):1598-1623. 6. Seetharaman TR (1990). "Polyphenols of Muntingia calabura". Fitoterapia, 61(4):374. 1 2 3 4 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 103 7. Takemoto M, et al (2014). "Inhibition of protein Sumoylation by davidiin, an ellagitannin from Davidia involucrata". The Journal of Antibiotics, 67(4):335. 8. Theepireddy SKR, et al (2015). "The isolation, characterization and quantification of gallic acid from the fruit extract of Terminalia chebula". International Journal of Medicine and Pharmaceutical Research, 3(2):983-988. 9. Võ Văn Chi (2012). “Từ điển Cây Thuốc Việt Nam”. Nhà xuất bản Y học, pp.75. 10. Wang Y, et al (2014). "A potential antitumor ellagitannin, davidiin, inhibited hepatocellular tumor growth by targeting EZH2". Tumor Biology, 35(1):205-212. 11. Yoshida T, et al (1992). "Tannins of euphorbiaceous plants. X. Antidesmin A, a new dimeric hydrolyzable tannin from Antidesma pentandrum var. barbatum". Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 40(2):338-342. Ngày nhận bài báo: 28/07/2019 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 20/08/2019 Ngày bài báo được đăng: 14/09/2019